赵涛[1]2003年在《胶原蛋白自组装行为以及细胞形态的AFM研究》文中研究说明对原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)的成像技术进行了多方面探索；用AFM研究胶原蛋白分子在云母表面的吸附和自组装行为；对小鼠胚胎干细胞和人血红细胞进行AFM成像，观测单个细胞的形态以及细胞膜的微观结构；利用AFM得到了小鼠胚胎干细胞超薄切片的高分辨率图像，探索用AFM研究细胞内部结构，拓展其应用领域；天花粉蛋白(TCS)和红细胞的相互作用，利用AFM观察到天花粉蛋白(TCS)和红细胞相互作用前后红细胞膜超微结构的变化，据此讨论了二者的作用机理。 测量了四种AFM常用基片的表面粗糙度，探索并总结了用于AFM观测的生物样品的制备方法。结果发现，对于生物大分子(如胶原蛋白)，使用经MgCl2处理后的云母做基底，成像效果最好。对于细胞，使用普通玻片做基底，能使样品较好地固定，从而得到稳定的AFM图像。通过AFM针尖对胶原蛋白样品损伤作用的研究，探索用AFM研究生物大分子的成像技术。 利用AFM技术研究来自小牛皮肤的Ⅰ型胶原蛋白溶液在用镁离子处理过的云母表面的吸附和自组装行为。改变胶原蛋白溶液的浓度和pH值，研究不同条件下胶原蛋白分子的自组装行为，利用AFM的高分辨率，在纳米范围内直接观察胶原分子在云母表面的自组装的情况。 用AFM观测小鼠胚胎干细胞的超薄切片，得到了高分辨的小鼠胚胎干细胞内部超微结构的AFM图像。本实验结果表明，AFM技术如与超薄切片技术相结合，可对样品的内部结构进行研究，而不仅仅是一种表面成像工具。 对红细胞进行成像，观察到红细胞双面凹的典型特征，小范围扫描观察到了红细胞膜表面的超微结构，在此基础上研究了红细胞与天花粉蛋白作用后红细胞膜表面超微结构的变化，并对二者作用的机理进行了分析讨论。
赵鑫[2]2016年在《温度敏感型胶原蛋白肽》文中研究表明胶原蛋白是人体内主要的结构蛋白,具有特殊的二级构象和多级自组装行为,在生物医用材料领域有着广阔的应用前景。树枝化烷氧醚作为一种生物相容性基元,不仅可以赋予聚合物以温敏特性,同时还能形成疏水空腔,对内部基团提供屏蔽作用。本论文通过分子设计,对一类烷氧醚化聚胶原蛋白肽的合成、温敏、构象及自组装行为进行了深入的探讨,主要工作包括以下几部分:(1)利用优化的合成策略,制备了一类具有不同侧基拓扑结构的烷氧醚化聚胶原蛋白肽。首先通过KOH-DMSO体系经醚化反应在多肽侧基有效引入烷氧醚,其次将带有烷氧醚侧基的大单体通过活性酯缩合法进行聚合反应,通过控制聚合反应时间和在聚合反应后期添加缩合剂的方式有效调控聚合物分子量。通过GPC、NMR、IR和DLS等分析手段对相应聚合物的结构和流体力学尺寸进行了分析表征。(2)研究了烷氧醚化聚胶原蛋白肽的温敏和构象性质。首先探讨了不同拓扑结构侧基和聚合物分子量对该类多肽分子温敏行为的影响,进一步讨论了热历史和聚集状态对温敏行为的影响;然后讨论了烷氧醚化和温敏行为对胶原蛋白肽叁螺旋构象的控制。本文首次发现了烷氧醚侧基屏蔽效应对胶原蛋白肽温敏和构象的重要影响。(3)研究了烷氧醚化聚胶原蛋白肽的超分子自组装性质。首先探讨了水相中不同结构多肽聚合物在不同温度下的超分子自组装现象;然后在有机相对该类分子的自组装行为进行了深入研究,讨论了结构、分子量、溶剂极性、界面、浓度和温度对自组装形貌的影响;最后简单尝试了烷氧醚树枝化胶原蛋白肽的溶致结晶,讨论了温度和聚集状态对结晶的影响。本文首次发现树枝化烷氧醚化聚胶原蛋白肽的主侧链径向双亲性,及其对多肽聚合物自组装的影响。本文从不同侧面对烷氧醚化聚多肽的屏蔽效应和主侧链双亲性进行了探讨。
朱杰[3]2010年在《心肌纤维与Ⅰ型胶原纤维的超微结构及生物力学特性研究》文中进行了进一步梳理肌节周期性的收缩力可经由近邻的胞外基质和心肌纤维传导至整个心脏组织,从而迫使心脏壁收缩并将血液压出心室,是心脏搏动的原动力。肌纤维和胶原纤维超微结构及生物力学特性的病理性变化往往会影响纤维对外界刺激信号的应答,从而影响心脏搏动的规律性,造成心脏功能紊乱。而胶原蛋白纤维是肌内膜的主要成分,要深入研究心肌纤维的功能,还必须研究心肌外层的胶原纤维膜的超分子结构与力学特性,这些信息将有助于人们更好地了解胶原蛋白结构影响肌细胞-肌细胞、肌细胞-基质通讯的途径,以及胶原蛋白在心肌组织生长、发育、病变和修复/再生过程中所起的作用,为临床治疗提供科学依据。本研究以肌纤维和胶原纤维为主要研究对象,采用原子力显微镜高分辨成像和纳米压痕技术,研究了牛心心肌纤维、昆虫飞行肌纤维、鼠尾肌腱胶原蛋白纤维在不同生理状态的表面超微结构、压弹性和粘弹性,尝试找到肌纤维收缩过程中肌节长度、纤维直径等参数之间的关系;找到抗I型胶原蛋白抗体在胶原蛋白纤维上的结合位点并得到二者之间的特异性作用力;从而建立心肌纤维和胶原蛋白纤维的超微结构、力学特性和生理状态之间的内在联系。通过研究,获得了以下主要进展:(1)不同生理状态下,牛心肌纤维的肌节长度大致在1.22μm~1.33μm,其中松弛状态的肌节长度相对于僵直态有大约9%的增长,该结果提示,肌动蛋白和肌球蛋白会随着生理条件的变化而不断交替形成横桥,从而形成力学传导以应对外界环境的变化和信号刺激;与位置相关的压弹性曲线与AFM高度图的剖面曲线在外形上具有很高的相似性,相邻最大弹性系数点之间的距离与剖面分析得到的肌节长度非常接近,该结果显示了肌节的空间周期性和力学周期性的统一;源于AFM研究的肌纤维结构和弹性参数将会推动人们对生物结构、生物力学和生理功能之间关系的认识,为心脏疾病的基础研究和临床治疗提供更多的线索。(2)飞行肌肌原纤维在僵直态、松弛态和叁种活化态的肌节长度分别为:2.10±0.05μm(僵直态)、3.10±0.10μm(松弛态)、2.50±0.15μm(活化态, 2mM Ca2+)、2.60±0.25μm(活化态, 5mM Ca2+)和2.55±0.15μm(活化态, 10mM Ca2+),并得到得到5mM Ca2+浓度为合适的肌纤维活化浓度;另外,不论飞行肌纤维处于什么生理状态,A带的长度始终保持在1.50μm左右,而I带的长度则有较大的变化(0.7μm~1.6μm),该现象符合肌动蛋白纤维与肌球蛋白纤维在重迭区相对滑移的力学和空间结构模型。AFM高度图剖面分析的结果显示,不同生理状态下,肌原纤维内部肌动蛋白粗纤维之间的最小距离分别为53nm(松弛态)、58.5nm(僵直态)、56.7nm(活化态, 2mMCa2+)、54.8nm(活化态, 5mM Ca2+)和55.6nm(活化态, 10mM Ca2+),进而结合同根纤维的肌节长度变化建立了肌纤维的钙离子诱导等体积伸缩模型;根据沿肌球蛋白纤维纵向的剖面曲线分析图,找到了横桥在肌球蛋白纤维表面的位置及其周期性间距为37.5±0.5nm;另外,在同一生理状态下,肌原纤维的弹性系数和杨氏模量的大小关系满足:Z线>M线>重迭区>I带;同一肌节位置在不同活化态下的弹性系数和杨氏模量的大小关系基本满足:活化态(5mM Ca2+)>活化态(2mM Ca2+)>活化态(10mM Ca2+)。(3)固定在云母片上的胶原纤维在空气中自然干燥时,胶原纤维的D单元长度在干燥的过程中并无显着变化,基本稳定在66.67nm;而间隙带的深度则有一定的增加,从4.4nm逐渐增加到4.7nm,增幅达7%;变化最为明显的则是纤维的直径,从201nm降到了187nm,减幅达到7%,尽管如此,由于D单元长度并无变化,因而该方法(样品制备和空气中成像)依然适于研究胶原纤维的纵向精细结构。文中采用抗I型胶原蛋白抗体偶联金纳米颗粒对胶原蛋白纤维成功实现了定位标记,AFM研究发现,抗体作用时间不同的纤维样品表面上的金纳米颗粒分布密度有较大差别。抗体作用时间越长,金颗粒的密度越大;其中,抗体作用时间等于2h的金纳米颗粒密度与厂家提供的标准结合密度很接近,但从实际的AFM图像质量可知,抗体作用时间为1h的金颗粒密度更适合做抗体结合位置的统计分析。以抗体作用时间为1h的样品作为研究对像的实验结果显示,与抗体结合的金颗粒主要分布在胶原纤维的重迭区,显示出抗I型胶原蛋白抗体对胶原纤维重迭区的结合特异性。(4)用未加修饰的探针对抗体结合时间不同的胶原纤维样品进行了成像,分别得到了高分辨的高度图和低分辨的摩擦图,二者分别从结构细节和总体力学特性上反映出抗体在胶原纤维上的结合位点主要集中在重迭区。而未加修饰探针的单点力学测量结果显示,胶原纤维表面结合的抗体对肌原纤维压弹性的测量几乎没有影响;但对于粘附力的收集结果却有显着的影响,特别是在重迭区,随着抗体结合时间的增加,探针与胶原纤维间的粘附力相对于探针与天然纤维样品之间的粘附力分别增加了17.8%、48.9%和82.2%,而间隙带的粘附力则保持相对稳定,说明抗体主要分布在重迭区,与前述高度图和摩擦图的结果保持一致。最后,本论文重点研究了抗体与胶原蛋白的结合力。主要用抗I型胶原蛋白抗体对探针进行了修饰,并用修饰过的探针进行探针-天然胶原纤维间的粘附力(结合力)测量,统计结果显示,单个抗I型胶原蛋白抗体与胶原纤维重迭区的结合力约等于250pN。
曹长海[4]2013年在《短肽自组装水凝胶及其在细胞培养方面应用的研究》文中研究指明水凝胶是以水为分散介质的凝胶，由于它的孔结构和叁维网状结构能够提供好的渗透性和机械支撑，因此在药物运输、组织工程等生物医学方面有着广泛的应用。水凝胶可以通过一些小分子自组装的方式得到，而肽分子无疑是一种较为理想的选择。肽分子的自组装现象广泛存于自然界中，通过自组装，肽分子可以形成不同功能的蛋白质分子，在生物进化及维持生物物种的多样性方面起着重要的作用。通过合理地设计调控肽分子的分子结构及改变相应的外界环境，肽分子通过疏水作用、氢键、静电作用、π-π堆积等非共价力可以自组装形成形态结构和功能特异的自组装体，其中较为重要的一种宏观表现就是水凝胶。肽分子的结构单元为氨基酸，自然界中常见的氨基酸有20种，通过设计不同肽序列可得到多种具有特殊功能的水凝胶材料，此外，肽分子自组装水凝胶还有着良好的生物相容性，在体内可降解，代谢终产物无毒，在材料科学、生物医药及临床医学等领域都有广阔的应用前景，近些年来，已经成为科学界的研究热点。本课题在实验室已有研究基础之上，对Ac-I3K-NH2分子进行了修饰，设计合成了叁个不同系列的短肽分子，分别考察了氧化还原作用、pH、酶催化作用对所设计肽分子自组装成水凝胶的影响，并对所成水凝胶的性能进行了表征，分别考察了其在药物运输、组织工程及凝血方面的应用，具体的研究如下：(1)氧化还原作用下的成胶：Ac-I3K-NH2可以自组装成长纤维，并且在10mM的浓度下可以形成弱的水凝胶，在Ac-I3K-NH2分子基础之上，引入半胱氨酸残基Cys和甘氨酸残基Gly，设计合成了Ac-I3CGK-NH2分子，CD、FTIR及AFM、TEM说明半胱氨酸的引入并没有使分子在二级结构和自组装形貌上发生改变，依旧是β折叠的二级结构和纳米纤维的自组装体。然而，半胱氨酸上的巯基可以被氧化形成二硫键，使纳米纤维间发生化学交联，从而促进形成水凝胶，实验发现Ac-I3CGK-NH2在0.5mM的低浓度时就可以形成水凝胶，流变学实验证明Ac-I3CGK-NH2水凝胶的强度可以由环境氧化还原性调控。为了验证巯基在自组装成胶中的作用，实验中将半胱氨酸残基替换为甲硫氨酸，设计合成了对比分子Ac-I3MGK-NH2，分子中巯基被甲基化，无法氧化形成二硫键，实验证明Ac-I3MGK-NH2在相同的条件下无法成胶。此外，还设计合成了Ac-I3CCGK-NH2，Ac-I3KGCG-NH2两个分子，考察了巯基数量及位置对肽分子自组装成胶时间的影响。(2) pH诱导下的成胶：由于Ac-I3K-NH2中赖氨酸侧链含有伯胺基团，其对pH敏感，在不同的pH下，有着不同的带电荷情况，在此基础上，将丝氨酸和甘氨酸引入到分子序列中，设计合成了肽分子Ac-I3SGK-NH2。与Ac-I3K-NH2相比，此分子在8mM pH为8.6-10的范围里可以形成较为透明的水凝胶，而Ac-I3K-NH2只能形成较为浑浊的粘稠液体。通过pH滴定的方法，发现赖氨酸侧链上的伯胺基的pKa有一个偏移，从10.53减少至8，从而确定了在不同范围内Ac-I3SGK-NH2的带电情况。CD发现8mM的Ac-I3SGK-NH2在pH=9情况下比pH=3的情况下更加容易形成β折叠的二级结构，AFM和TEM结果表明两种pH下Ac-I3SGK-NH2的自组装形貌均为纳米纤维，pH=9时纤维的混乱度明显地增加。同时还设计了对比分子Ac-I3AGK-NH2、Ac-I3TGK-NH2，证明了分子亲疏水性之间的平衡对自组装成胶的影响。通过流变学实验证明，Ac-I3SGK-NH2水凝胶具有很好的机械性能和破坏恢复性能，基于该特性进一步研究了其在药物释放和组织工程方面的应用。同时还将赖氨酸残基换为同样对pH敏感的谷氨酸和组氨酸，设计合成了Ac-I3SGE-NH2和Ac-I3SGH-NH2，在8mM的浓度下，发现在合适的pH下，两种肽分子同样可以形成水凝胶，从而得到规律的存在，为以后的分子设计提供了思路。(3)酶催化下的成胶：谷氨酰胺转移酶可以催化转酰基反应，从而使多肽之间发生共价交联。利用这种酶的特点，在Ac-I3K-NH2的基础上，将谷氨酰胺残基和甘氨酸残基引入，设计合成了Ac-I3QGK-NH2，考察了谷氨酰胺转移酶对Ac-I3QGK-NH2分子自组装成胶的促进作用。质谱分析说明在酶的存在下，Ac-I3QGK-NH2分子发生了交联，以二聚体的形式存在。流变学实验说明在酶的催化作用下，Ac-I3QGK-NH2肽分子所成胶的强度明显增加。考虑到哺乳动物的血液中含有谷氨酰胺转氨酶，故而论文进一步研究了Ac-I3QGK-NH2所成胶在凝血方面的应用，发现Ac-I3QGK-NH2对血小板有很好的粘附凝聚作用。血浆氨氧化酶可以将伯胺转化为醛，从而使醛与伯胺反应生成西弗碱，促使多肽之间发生共价交联，利用这种酶的特点，考察了血浆氨氧化酶对Ac-I3SGK-NH2分子自组装成胶的促进作用，并进一步研究了Ac-I3SGK-NH2所成胶在细胞支架材料方面的应用。
李妍花[5]2017年在《鸡爪皮胶原蛋白提取、自组装和消化特性研究》文中进行了进一步梳理胶原蛋白作为医药材料、食品辅料等都有着其它材料不可替代的优势,因此近年来对胶原蛋白的需求量日益增大。如今我国已经超过欧盟成为继美国之后的第二大肉鸡产业大国,肉鸡加工的副产物鸡爪的利用率却很低,这就造成资源的极大浪费,而鸡爪中含有丰富的胶原蛋白,因此急需研究鸡爪胶原蛋白的开发和利用。然而胶原蛋白具有机械性能差、热稳定性不好等劣势。为了解决这一问题,需要研究胶原材料的制备和性质,来改善其应用性能。不管是胶原蛋白还是胶原材料应用在食品和药学大都会被人体摄入,因此研究其消化特性十分重要。本文以鸡爪皮为原料,研究利用盐、酸和酶法分类提取,分级盐析纯化分离胶原蛋白,对其进行性质测定和消化性对比;探究超声波对胶原蛋白自组装过程和形成的胶原凝胶材料的理化性质的影响;以及胶原蛋白的不同处理产物的仿生动态鼠胃消化系统装置(BD-RSDS)消化行为。为鸡爪皮胶原蛋白的生产、材料应用和消化吸收提供理论依据。主要研究的内容及结果如下:(1)利用缓冲盐溶液除去鸡爪皮中含有的脂肪和杂蛋白,盐法、酸法和酶法依次提取胶原蛋白,并对其进行表征和模拟胃肠消化性研究。提取得到的盐溶性胶原蛋白(SSC)、酸溶性胶原蛋白(ASC)、酶溶性胶原蛋白(PSC)的得率分别为:1.13±0.31%、14.49±0.90%和49.10±1.95%。傅里叶红外光谱、聚丙烯凝胶电泳和圆二色谱结果显示叁种胶原蛋白的二级结构相似,均是I型胶原蛋白,且完整的保留了胶原蛋白特有的叁股螺旋结构。氨基酸分析表明叁种胶原蛋白的羟基化程度分别为45.8%、45.2%和37.5%,PSC的羟基化程度最高,因此变性温度最高,这也与流变学试验的动态温度扫描结果一致。胶原蛋白的扫描电镜和原子力显微镜微观结构图显示其都有胶原蛋白特有的网络状纤维结构。胶原蛋白的模拟胃肠消化的水解度(DH)显示PSC水解的更完全,在10 h的水解实验后水解度分别为21.00%(SSC)、22.49%(ASC)和24.00%(PSC)。消化产物的抗氧化性测定结果表明,消化结束后还原力分别为0.34(SSC)、0.35(ASC)和0.40(PSC),结果可能与水解度有关,且与相对分子质量呈负相关。·OH清除率的测定结果趋势一致。试验表明PSC具有更高的提取率、热稳定性更好、更容易被消化,因此以下试验都用PSC来进行研究。(2)用鸡爪皮PSC为原料,研究超声频率对胶原蛋白自组装的影响。在水浴30℃下自组装,并且在前5 min分别用发散式叁频超声设备不同频率处理:20kHz/270 w、40 kHz/270 w、60 kHz/270 w、(20/40/60 kHz)/90 w以及不超声溶液作对照,分别对应样品C0H0m、C20H5m、C40H5m、C60H5m和CtH5m。浊度试验和粘弹性试验表明,自组装的过程分为成核阶段、上升阶段和平衡阶段叁个阶段,由于浊度试验只是反映胶原纤维聚集对吸光值的影响,因此粘弹性试验更能准确的反映自组装的成核时间。超声的频率增大会使自组装的速度加快,但是频率60 kHz的效果好于叁频。原子力显微镜和透射电镜微观结构图显示,超声处理会使自组装形成的胶原纤维结构更松散但是排列更有规律,并且原子力显微镜显示其胶原纤维的粒径会变小,C60H5m(65-89 nm)远远小于C0H0m(80-161 nm)。超声处理会减小胶原蛋白的自组装程度,并且降低形成的胶原凝胶的机械性能,其蠕变回复率分别为81.54%、78.36%、76.26%、63.67%和72.66%。模拟胃肠消化试验结果表明,超声处理使凝胶更容易消化。(3)对PSC进行不同处理,并研究其仿生动态鼠胃消化特性差异。利用仿生动态鼠胃消化系统装置(BD-RSDS),对PSC、PSCH(PSC蒸煮处理形成的明胶)、PSCU(PSC超声处理自组装成的胶原凝胶)和PSCUN(PSC自组装成的胶原凝胶)进行消化水解。可溶性氨基的含量测定显示,PSCH的水解速度最快,PSCUN的耐酶解性最好。原子力显微镜和倒置荧光显微镜的结果表明,视野中的PSCH水解物的颗粒更小分布更均匀,因此也更利于消化。凝胶过滤色谱法(GPC)测定酶解产物的相对分子质量分布和游离氨基酸分析结果显示,样品中天冬氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量变化很大,最终消化产物中寡肽含量最高。
钟朝辉[6]2006年在《鱼鳞酶溶性胶原蛋白的提取、特性及其二级结构的温度效应研究》文中研究指明本文采用胃蛋白酶从草鱼鱼鳞中提取酶溶性胶原蛋白(PSC)，通过考察提取介质、前处理、搅拌、料液比、提取次数及提取时间等影响因素来确定最佳提取工艺，并利用SDS-PAGE凝胶电泳、傅立叶红外光谱(FT-IR)和氨基酸组成分析对其类型进行确定，同时对鱼鳞PSC的溶解性、黏度特性和凝胶特性进行了系统研究。在利用乌氏黏度计和差示扫描量热仪(DSC)探讨了PSC的热变性温度(Td)的基础上，结合使用傅立叶红外光谱、拉曼光谱(Raman)和圆二色谱(CD)研究鱼鳞PSC二级结构的温度效应，并采用原子力显微镜(AFM)考察了浓度、pH、温度对鱼鳞胶原蛋白溶液聚集态的影响。其主要研究结果如下：1．草鱼鱼鳞PSC的最佳提取工艺为：蒸馏水浸泡5h后，微波辅助去杂，4％苹果酸脱钙，以0.50mol／L的苹果酸作为提取介质，料液比为1：10，提取过程加以搅拌，提取3次，每次48h。纯化后的鱼鳞胶原蛋白通过SDS-PAGE电泳、氨基酸组成和红外光谱分析，确定所提蛋白为典型的Ⅰ型胶原蛋白且达到电泳纯。2．草鱼鱼鳞PSC最易溶解于0.50mol／L乙酸中，且其最大溶解浓度达4.00mg／mL：在pH3时，PSC溶解度最大；NaCl浓度低于3％时，对草鱼鱼鳞PSC的相对溶解度影响很小，当NaCl浓度大于3％，随其浓度增加，PSC的相对溶解度显着下降。3．草鱼鱼鳞PSC的特性黏度为1.07L／g。增加PSC浓度和添加丙叁醇、乙醇、聚乙二醇都能使PSC溶液表观黏度显着增加；添加葡萄糖和蔗糖都将使PSC溶液表观黏度缓慢增加，而添加NaCl和CaCl_2都会引起PSC溶液表观黏度降低；PSC表观黏度在pH3时最大；随剪切速率的增大，PSC表观黏度下降；保温时间长短对PSC溶液的表观黏度影响不大。4．草鱼鱼鳞PSC的凝胶强度随其浓度增大和加热温度升高而增强，但加热时间延长，其凝胶强度显着下降；在凝胶形成的前4h，凝胶强度显着增加，到18h后，凝胶强度基本趋于稳定；添加NaCl和CaCl_2都会使PSC的凝胶强度下降，而增大葡萄糖和蔗糖的添加量，鱼鳞PSC凝胶强度缓慢增加；丙叁醇、乙醇、聚乙二醇对鱼鳞PSC凝胶强度影响的趋势基本一致，随其添加量增加，PSC凝胶强度降低，添加量进一步增加，则凝胶强度又开始增强。5．DSC分析表明PSC冻干品的Td为37.1℃，而乌氏黏度计测定草鱼鱼鳞PSC乙酸溶液的Td为32.0℃，这表明草鱼鱼鳞PSC冻干品比其乙酸溶液具有更高的稳定性。旋转流变仪测定鱼鳞PSC水溶液的变性温度(31.5℃左右)明显高于其苹果酸(25.4℃左右)和乙酸溶液(28.0℃左右)，这说明草鱼鱼鳞PSC水溶液比其酸溶液更稳定，但其乙酸溶液的Td与乌氏黏度计的结果存在一定差异。此外，向鱼鳞PSC乙酸溶液中添加4％丙叁醇、4％乙醇、4％聚乙二醇、5％葡萄糖、5％蔗糖，都能使PSC溶液的Td略有上升；而添加1.5％NaCl或2％CaCl_2使PSC乙酸溶液的Td下降到22.0℃，这表明溶剂类型和添加剂种类对鱼鳞PSC溶液的Td都有一定的影响。6．FT-IR分析表明：草鱼鱼鳞PSC具有典型的胶原蛋白特征吸收带，酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ带的特征吸收频率分别出现在1658cm~(-1)、1552cm~(-1)和1238cm~(-1)处。随温度升高，酰胺A和酰胺B峰位向低波数移动，1658cm~(-1)处吸收峰裂解成多个吸收峰；1552cm~(-1)处的吸收峰在35℃微略红移，随后发生明显蓝移；1238cm~(-1)处吸收峰随温度升高向低波数移动。在拉曼光谱中，胶原蛋白的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ带的特征吸收频率分别出现在1669cm~(-1)、1557cm~(-1)和1245cm~(-1)处，都较红外光谱的波数高；此外，921cm~(-1)和855cm~(-1)处脯氨酸的特征谱峰在拉曼光谱中体现出来。圆二色谱分析可见，鱼鳞PSC溶液在221.6nm和204.4nm分别有一正、负峰，具有典型胶原蛋白叁股螺旋结构的特征圆二色谱峰型。PSC冻干品的FT-IR和Raman谱线大都在35℃-60℃时发生波数和强度改变，而PSC乙酸溶液的园二色谱谱线在20℃-35℃之间发生剧烈改变。由此可以推断PSC在固态和溶液状态下，变性温度存在一定差异，PSC冻干品比其乙酸溶液更稳定。7．鱼鳞PSC在不同浓度、pH、温度条件下的溶液聚集态明显不同。在pH2.7的乙酸溶液中，在10μg／mL的低浓度时，鱼鳞PSC主要以单体和线性小聚集体形式存在；随着浓度增大，胶原分子开始组装形成网状结构，当浓度达到4.0mg／mL时，形成无规线团结构；而在pH7.2的Tris-HCl溶液中，即使在10μg／mL的低浓度下，鱼鳞PSC也能自组装成不规则的片状聚集体，并通过横向融合形成多孔网状结构，随着浓度增大，纤维直径和高度明显增加；浓度为1.0mg／mL的鱼鳞PSC溶液经40℃处理1h，胶原蛋白的聚集行为发生了明显改变，聚集体由线性变为球状，而采用80℃处理1h，其高级结构基本被破坏，AFM图像上只可见少许不规则分布的团状聚集体。
许小丁[7]2011年在《小分子肽自组装行为研究及其生物医学应用》文中研究表明近年来,多肽自组装逐渐成为材料学和生物医学等领域的研究热点。通过合理调控多肽的分子结构以及改变外界的环境,多肽分子可以利用氢键、疏水性作用、π-π堆积作用等非共价键力自发或触发地自组装形成形态与结构特异的组装体。由于多肽自身具有良好的生物相容性、可控的降解性能和种类多样性,利用多肽自组装技术构建的各种功能性材料在药物控制释放、组织工程支架材料以及生物矿化等领域内有着巨大的应用前景。本论文在大量前期工作基础上,设计和制备了一系列小分子肽,系统研究了这些小分子肽的自组装行为及其在生物医学领域内的应用。论文第一章概述了近年来有关多肽自组装的研究进展,包括多肽的分子设计、自组装机理、组装体形态及其在材料学和生物医学等领域内的应用。第二章中,我们利用固相合成技术制备了两类含有异性电荷的小分子肽。把这两类小分子肽混合溶于中性(pH7.0)水溶液中后,分子间静电吸引作用可以驱使它们共同自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。由于这两类小分子肽的链段柔韧性较弱以及在共同自组装初始阶段小分子肽的刚性N-芴-9-甲氧羰基(FMOC)端基间存在着空间位阻作用,它们的共同自组装速度较慢,而且需要较高的溶液浓度才能形成稳定的超分子水凝胶。本章中使用的共同自组装的方法可以方便地将不同的功能肽混合在一起形成多功能自组装材料。第叁章中,我们设计合成了四种含有不同疏水性烷基链的两亲性小分子肽(PAsl-4)并系统研究了它们在不同pH下的自组装行为。四种小分子肽在中性条件下均可以自组装形成具有有p-折迭空间构象的紧密堆积的纳米线纤维。升高溶液的pH至碱性后(pH11),具有较长疏水性烷基链的小分子肽PA3和PA4仍可以自组装形成纳米纤维。由于小分子肽PA1的烷基链长度相对较短,其纳米纤维结构完全转变为具有p-折迭空间构象的松散的球状胶束。小分子PA2的疏水性烷基链长度适中,纳米纤维和球状胶束均可以在自组装体系中存在。富含电正性精氨酸残基的多肽具有独特的跨膜和运载质粒DNA的功能,仪用这一类多肽作为非病毒基因载体通常可以获得低毒高效的基因治疗效果。研究表明,多肽类基因载体的链段空间构象及其组装体的形貌对基因运载效率和基因表达效果有着显着的影响。第四章中,我们利用固相多肽合成技术制备了一系列富含精氨酸残基的两亲性多肽,系统地研究了它们在水相和有机相中的自组装行为。其中,含有刚性N-芴-9-甲氧羰基(FMOC)端基的两亲性多肽可以在二甲亚砜(DMSO)中利用多肽骨架间氢键作用以及FMOC端基间π-π堆积作用自组装形成纳米纤维。以柔顺的脂肪族烷基链为端基的多肽可以在水溶液中利用多肽骨架间氢键作用以及烷基链间疏水性作用进行自组装,而且组装体的形貌受溶液浓度的影响较大。第五章中,我们设计合成了一种含甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly)序列以及光敏感的芘甲酯端基的小分子二肽。将小分子二肽化学键连接到石英板上并插入到二肽水溶液中后,小分子二肽可以通过界面自组装在石英板表面形成化学键连接的垂直排列的纳米棒,而且纳米棒的数量随着小分子二肽水溶液的浓度增大而增多。荧光发射光谱表明小分子二肽的界面自组装驱动力为分子结构中芘甲酯端基间的π-π堆积作用。使用波长为365nm的紫外光照射石英板表面后,由于芘甲酯端基的光解,石英板表面上垂直排列的纳米棒消失。本章中提出的在石英板表面构建垂直排列的多肽纳米结构的方法为材料表面改性研究开辟了一条新途径。酶广泛广泛参与生物体内的各种反应,而生理葡萄糖代谢就是一个由多种酶调控的复杂过程。第六章中,我们体外模拟了由葡萄糖氧化酶介导的葡糖糖代谢过程并研究其对多肽自组装行为的影响。在本章中,我们设计合成了两种分别含有酸性天冬氨酸残基和碱性赖氨酸残基的多肽。在含酸性天冬氨酸残基的多肽体系中引入葡萄糖氧化酶介导的葡糖糖代谢后,由于其代谢产物为酸性的葡萄糖酸,多肽可以在葡糖糖代谢的调控下进行自组装并完成溶液态到凝胶态的相转变。向含碱性赖氨酸残基的多肽自组装体系中引入葡萄糖氧化酶介导的葡糖糖代谢后,其代谢产物葡萄糖酸能够破坏多肽自组装并导致凝胶态到溶液态的相转变。多肽可以自组装形成各种形状特异的组装体,由于多肽分子结构中含有多种功能基,因此可以利用这些功能基的化学活性在多肽组装体的表面进行各种反应,实现多肽自组装的后修饰。第七章中,我们以自组装硼酸肽纳米纤维为模板在其表面进行硼配位反应。在本章中,我们设计合成了叁种含有苯基硼酸端基的小分子肽(称为硼酸肽)。它们在水溶液中可以自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。向这叁种硼酸肽凝胶中加入含有邻二羟基结构的万古霉素和葡萄糖后,纳米纤维表面硼配位反应导其直径变大和表面粗糙度增加。由于固定在纳米纤维表面的万古霉素和葡萄糖与纳米纤维间氢键作用破坏了纳米纤维自身间的氢键作用,叁种硼酸肽凝胶叁维网络结构发生塌陷并转变为流动的溶液。青光眼是一种能够导致失明的眼科疾病,其临床症状为眼压过高压迫视盘和损伤视神经。目前滤过手术是一种治疗青光眼的常用方法,但是术后伤口组织瘢痕化往往导致青光眼滤过手术的失效。为此,临床上要多次注射抗增生药物如5-氟尿嘧啶的水剂来抑制术后瘢痕组织的形成。但是多次药物注射往往引起眼部组织的毒副作用。第八章中,我们设计并制备了一种具有良好生物相容性的小分子肽的水凝胶。使用该凝胶包裹抗增生药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)并在滤过手术中注射到兔眼后,从凝胶中缓慢释放出的5-Fu可以有效抑制术后伤口组织的瘢痕化,使得兔眼的眼压在术后28天内都处于较低水平。和传统的5-Fu水剂多次注射法相比,本章中用于抑制术后伤口组织瘢痕化的方法操作方便,而且能有效避免5-Fu对眼部组织的毒副作用。为了抑制青光眼滤过手术后瘢痕组织的形成,临床上多是使用抗增生药物如5-氟尿嘧啶和丝裂霉素等。这些药物往往会引起眼部组织的毒副作用,如结膜切口或滤过泡渗漏、角膜内皮细胞损害等。第九章中,我们设计并合成了一种含有氨基葡萄糖单元的治疗型糖肽。在pH为7.4的磷酸缓冲溶液中,该糖肽可以自组装形成具有纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。在兔眼滤过手术中使用该糖肽凝胶后,由于其结构中氨基葡萄糖单元能够有效抑制由成纤维细胞增殖导致的组织纤维化,滤过手术后形成的滤过道周围没有任何术后瘢痕组织形成,从而使得兔眼的眼压在术后21天内都处于较低水平。和传统的抗增生药物水剂相比,使用该治疗型的糖肽凝胶可以起到等同的抗瘢痕化效果。但糖肽凝胶使用方便而且不会引起眼部组织的毒副作用,因此可以替代传统的抗增生药物用于青光眼的治疗。
田冶[8]2008年在《表面功能化聚乳酸膜的构建及其细胞相容性评价》文中研究说明组织工程的核心内容之一是构建细胞与支架材料的复合体,而细胞在材料上的粘附、增殖、分化等行为主要依赖于材料的表面物理化学性质,因此不同表面性质材料的制备及其与细胞之间的相互作用就成为目前国内外研究的热点。由于材料制备方法及表面改性技术的限制,目前大多数关于材料不同表面性质对细胞行为影响的研究仍以相对较易实现功能化,但在组织工程领域应用并不广泛的材料为基底,如聚苯乙烯(PS)、石英等,而以常用的生物材料例如聚乳酸(PLA)为基底进行的研究则较少报道,而后者恰恰对组织工程的研究与开发更具有实际意义。为了探讨常用组织工程支架材料表面与细胞的相互作用,本研究以目前组织工程领域常用的PLA为基质,考察了表面具有不同物理化学性质的PLA膜对细胞生物学性能的影响,为今后研制生物相容性良好的PLA材料与细胞的复合支架探索一些理论基础和实际技能。为了较系统的研究材料表面与细胞之间的相互作用,本研究构建了一系列表面形态和化学组成功能化的PLA膜。首先是在单模微波有机合成仪中,采用有别于传统减压封管热聚合的微波聚合方式,在常压氮气保护下合成了分子量约为4.86×10~4和10.47×10~4的PLA。其次,以此为原料,采用SNS(Solvent-Non-Solvent)技术构建了微孔孔径介于1μm—20μm的PLA膜和PS膜,并以多孔PS膜为模板,制备了表面具有微岛结构的PLA膜,微孔孔径的大小以及孔密度可通过改变溶液的浓度、非溶剂组成、环境温度和溶剂的挥发速率等方法进行控制。最后采用光氧化接枝法,以过氧化氢为光氧化剂,在紫外光辐照下成功的将丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AAm)、丙烯酸羟乙酯(HEA)等亲水性单体接枝到PLA膜表面,从而在PLA膜表面引入了羧基、酰胺基以及羟基等基团,接触角测定显示这些极性基团的引入改善了PLA膜的亲水性,提高了材料的表面自由能。作为骨组织工程支架材料,不仅材料与骨细胞的相互作用非常重要,而且材料表面性质对矿化性能及胶原蛋白吸附的影响也非常关键,因此本论文首先系统的研究了材料表面性质对生物矿化及胶原蛋白吸附性能的影响。对PLA膜的诱导矿化性能的研究结果显示纯PLA膜表面由于缺少成核位点而不利于矿化产物的形成,小分子量的PLA由于其表面羧基密度大于高分子量的PLA而矿化沉积的产物相对较多;对于物理形貌功能化的表面,具有1μm微岛结构的PLA膜上有大量的结晶性矿化物产生,显示此结构的表面有利于促进矿化产物的沉积,而另外叁种形貌的表面均未见到有明显的结晶性矿化产物形成,其中又以20μm微孔结构的表面沉积的钙磷盐最少;对比不同基团功能化的表面,所引入的叁种极性基团由于带有负电荷,因此能够诱导大量的结晶性钙磷产物形成,X射线衍射(XRD)显示此产物为具有一定结晶性的羟基磷灰石(HA)。采用石英晶体微天平(QCM)技术探讨了PLA膜的分子量及表面基团对胶原蛋白吸附的影响。研究结果显示胶原蛋白的吸附基本符合Langmuir等温吸附方程,胶原蛋白在引入功能化基团的表面能够更快的达到吸附平衡,并有较强的吸附力;对比叁种功能化基团表面,胶原蛋白在羧基化表面的PLA膜上的吸附量最大;原子力显微镜(AFM)观察显示在小分子量PLA上吸附的胶原蛋白较少,呈弯曲状,而在较大分子量PLA上的胶原吸附量则相对较多,部分胶原蛋白形态呈直线形;在基团功能化表面,胶原蛋白在羧基化表面呈密集的网状分布,显示羧基化的表面有利于胶原蛋白的吸附。对成骨细胞在不同PLA膜表面的相容性评价显示,低分子量的PLA比高分子量PLA更有利于细胞粘附,但因前者的降解速率过快,对细胞的长期生长不利;表面具有微孔及微岛结构的PLA膜有利于细胞的粘附与铺展,但对细胞的增殖性能贡献不大。虽然细胞有贴壁的特性,但对直径小于20μm的微孔及微岛结构,细胞伪足均不会沿着孔壁及岛壁贴附生长,而是在微孔及微岛上方铺展;而对于不同表面基团的PLA膜,不论是细胞的粘附与铺展还是细胞的增殖性能都得到一定程度的改善,其中又以引入酰胺基的PLA膜的细胞相容性最好。最后,本研究还创新性的探讨了不同性质PLA膜对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化性能的影响。结果显示在诱导剂的存在下,BMSCs在纯PLA膜上均能够正常的向成骨细胞分化,而对于不同形貌的PLA膜,1μm微岛结构的表面对BMSCs分化性能的影响与纯PLA膜相似,而另外叁种形貌则不同程度的对BMSCs朝成骨细胞分化产生抑制作用;更值得注意的是,在PLA膜表面引入酰胺基不仅能够促进BMSCs的诱导分化,甚至在无诱导剂的作用下,其自身也具有一定的诱导BMSCs分化为成骨细胞的功能。
李鹏程[9]2013年在《胶原蛋白自组装结构及其离子效应的研究》文中提出近年来，胶原蛋白以其优异的生物相容性、生物可降解、无毒性、非抗原性等特点，在食品工业、制革工艺、生医材料以及化妆品等方面的应用及其潜在价值逐渐受到人们关注。为进一步开发胶原蛋白这一丰富的天然资源，将其更好地利用到相关的材料领域，需要进一步改善并提高它们的强度特性等性能。在纳米尺度上控制胶原蛋白分子的排列对于所构造的材料特性及其应用具有积极的意义，已有研究者通过分子自组装研究胶原蛋白分子的结构并探索其组装过程。目前大多数研究集中在考察胶原蛋白的浓度、自组装时间、溶液pH、电解质、基底等因素对胶原蛋白自组装过程的影响。而对于不同分散介质或溶液中金属离子对胶原蛋白自组装过程的影响的研究尚不多见，到目前为止还没有报道阴离子在自组装过程中对胶原蛋白结构的影响。本论文以胶原蛋白的自组装结构为中心，考察了分散介质、阴离子基团、金属离子等因素对胶原蛋白自组装结构的影响，具体开展了如下研究工作：(1)考察了分散介质对胶原蛋白自组装结构的影响。采用原子力显微镜为主要研究手段，分别选用了0.2mol/L的乙酸、超纯水、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液为分散介质。通过控制胶原蛋白的浓度，研究了其自组装结构在云母表面的变化，发现胶原蛋白在醋酸分散体系中随浓度的变化生长成薄膜结构、在PBS分散体系中随浓度的变化逐渐生长为纤维结构。此外，在PBS体系中，研究了pH值对胶原蛋白自组装纤维结构的影响。结果发现碱性条件下，胶原蛋白在云母表面容易聚集组装成较高的棒状或枝状体。这一研究工作可为后续研究离子调控胶原蛋白自组装提供参考。(2)研究了不同阴离子基团在胶原蛋白自组装过程中的离子效应。采用Cl-、SO_4~(2-)和CH_3COO~-叁种不同阴离子盐，首次研究阴离子基团在胶原蛋白自组装过程中的影响，并利用霍夫迈斯特离子序列进行详细的解释说明。实验表明，归属于chaotropes的Cl-表现出典型的蛋白质变性剂的效果，明显改变了胶原蛋白自组装的结构。然而同属于kosmotropes的SO_4~(2-)和CH_3COO~-对于胶原蛋白自组装结构的影响也不尽相同。论文中讨论了各种离子对胶原蛋白自组装结构的影响，希望可以为以后研究开发胶原蛋白的应用提供参考。(3)考察了不同金属离子对胶原蛋白自组装结构的影响。分别利用Co~(2+)、Ag~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Ni~(2+)五种金属离子盐参与胶原蛋白自组装，观测了胶原蛋白自组装结构随离子浓度的变化。实验发现，利用300mM的CoAc2可调控10μg/mL胶原蛋白在云母表面自组装形成结构均一的网状结构，而750mM的MgSO4可调控25μg/mL胶原蛋白在云母表面形成紧密排列的有序的胶原纤维。分别讨论了云母表面胶原蛋白自组装结构随各金属离子浓度的变化规律，并利用Kollins理论分析解释了离子之间、离子与胶原蛋白分子之间作用关系。
王小燕[10]2003年在《干细胞和胶原蛋白结构性质的AFM研究》文中提出运用原子力显微镜(AFM)和扫描电子显微镜(SEM)这两种技术对BALB/c小鼠胚胎干细胞的细胞膜表面进行了观测，同时运用透射电子显微镜(TEM)，通过制作超薄切片对BALB/c小鼠胚胎干细胞的内部结构进行观测，得到BALB/c小鼠胚胎干细胞的形态学特征。同时将叁种技术进行比较，结果显示各有所长，应将这种新的技术(AFM)与传统技术(SEM与TEM)综合利用，互相补充。 利用AFM观测正常的CD34~+造血干细胞，得到了单个造血干细胞以及膜表面超微结构的AFM图像，同时应用AFM测定正常人终末分化细胞红细胞的细胞膜表面超微结构，通过五个参数(Rp-v、Median height、Mean height、R_(rms)及R_a)定量比较造血干细胞与红细胞膜的特征，通过形态学的比较为进一步认识多能造血干细胞演变为终末血细胞的过程提供实验依据。 利用AFM研究不同种属Ⅰ型胶原蛋白聚集行为的差别，结果发现相同实验条件下同型胶原蛋白溶液中，胶原蛋白分子的聚合方式有所区别。来源不同，胶原蛋白分子聚集形成的胶原纤维在微观结构上有较大的差异，本实验结果对于胶原制品的开发及改善胶原制品的性能具有一定的参考意义。 以胶原蛋白为研究对象，对NSOM的成像条件进行摸索，通过对比实验说明探针的质量及定位系统对图像质量的影响。得到了自组装后胶原蛋白的不同扫描范围的透射模式近场光学像以及反射模式近场光学像。将NSOM技术与AFM技术进行了对比。
参考文献：
[1]. 胶原蛋白自组装行为以及细胞形态的AFM研究[D]. 赵涛. 暨南大学. 2003
[2]. 温度敏感型胶原蛋白肽[D]. 赵鑫. 上海大学. 2016
[3]. 心肌纤维与Ⅰ型胶原纤维的超微结构及生物力学特性研究[D]. 朱杰. 西北农林科技大学. 2010
[4]. 短肽自组装水凝胶及其在细胞培养方面应用的研究[D]. 曹长海. 中国石油大学（华东）. 2013
[5]. 鸡爪皮胶原蛋白提取、自组装和消化特性研究[D]. 李妍花. 江苏大学. 2017
[6]. 鱼鳞酶溶性胶原蛋白的提取、特性及其二级结构的温度效应研究[D]. 钟朝辉. 华中农业大学. 2006
[7]. 小分子肽自组装行为研究及其生物医学应用[D]. 许小丁. 武汉大学. 2011
[8]. 表面功能化聚乳酸膜的构建及其细胞相容性评价[D]. 田冶. 暨南大学. 2008
[9]. 胶原蛋白自组装结构及其离子效应的研究[D]. 李鹏程. 江西师范大学. 2013
[10]. 干细胞和胶原蛋白结构性质的AFM研究[D]. 王小燕. 暨南大学. 2003
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