张新华[1]2003年在《TGFβ1基因转染大鼠树突状细胞增强移植心脏耐受性及相关趋化因子表达的研究》文中研究表明目的： 1．建立从大鼠骨髓前体细胞分离、培养和扩增树突状细胞(dendritic cell, DC)的方法；研究影响骨髓DC(bone marrow derived DC, BM-DC)分化、成熟的相关因素以及不同分化时期DC的免疫免疫生物特性。 2．构建人TGFβ1基因的真核表达质粒TGFβ1-pcDNA3以及反义TGFβ1-pcDNA3(ASTGFβ1-pcDNA3)并转染大鼠DC，研究TGFβ1基因转染对DC的成熟分化以及免疫功能的影响。 3．观察TGFβ1-DC在受者大鼠体内迁移归巢途径及微嵌合水平，检测受者次级淋巴器官T细胞凋亡和端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达的变化。 4．探讨TGFβ1-DC对移植心脏的急性排斥反应发生时间、排斥反应级别以及存活时间的影响；并进一步研究TGFβ1-DC输注对移植受者体内多种相关趋化因子及其受体表达的影响。 方法： 分离F344大鼠骨髓前体细胞，在rmGM-CSF+TGFβ1或rmGM-CSF+rmIL-4的联合作用下，培养、扩增大鼠骨髓来源DC(bone marrow derived DC, BM-DC)。分别从形态学(光镜、电镜)、免疫细胞化学(FACS，ICC)以及免疫生物学(MLR)等方面研究大鼠BM-DC的免疫生物特性。构建重组人TGFβ1-pcDNA3表达质粒，并转染DC制备TGFβ1-DC，应用多种分子生物学技术(RT-PCR, Western blot等)及免疫学技术研究TGFβ1基因转染对于DC发育分化、分子表型以及免疫功能的影响，检测TGFβ1-DC刺激T细胞增殖的能力；TGFβ1-DC异体输注Lewis大鼠后，以免疫组织化学检测TGFβ1-DC的迁移路线和分布特征，TUNEL检测受者脾T细胞凋亡以及端粒酶逆转录酶hTERT的表达。按Ono's方法建立大鼠同种异体心脏移植模型，观察TGFβ1-DC输注对于移植心脏排斥反应出现时间、反应级别以及存活时间的影响，以免疫组织化学方法观察移植后相关趋化因子的表达和变化。 结果：中文摘要1、应用细胞因子rmGM一CSF+rrIL一4，骨髓前体细胞在培养第6天时，可观 察到有大小不等的集落生成，吞饮和吞噬能力较强，MLR实验中不能刺 激T细胞增殖。培养至第ro天，集落减小并减少，多数细胞从集落中 释放，散在悬浮细胞增多。细胞多具有较长的树枝状突起，细胞吞饮吞 噬能力减低，MHCll类分子和B7一2分子表达增高，刺激T细胞能力增 强。应用n庄L一4可提高细胞得率，每只大鼠二后肢骨髓前体细胞经过扩 增可得到8一20xl护个细胞。2、一定浓度的thTGF印对Dc的扩增和分化具有抑制作用，细胞集落较少， 细胞成熟缓慢，大多数细胞无突起或突起较短。MHCll类分子和B7一2 分子表达较低，刺激T细胞增殖能力低下，但加入LPS刺激后MLR刺 激指数与IL一4对照组细胞无明显差异，细胞得率略低。3、通过酶切后连接、质粒转化、扩增与抽提，构建得到TGFpl重组真核表 达质粒TGF印一peDNA3。经酶切电泳和DNA测序鉴定，证实重组质粒 构建正确。4、以Westem blot、RT-PCR、免疫细胞化学以及免疫荧光染色显示脂质体 DOTAp可介导TGF困一peDNA3转染大鼠imDc，并得到有效mRNA和 蛋白表达，经测定转染效率可达到18~23%。5、应用FAcs和免疫细胞化学等方法检测发现，转染TGF印基因得到的 ToFpl一ne表面盯IB、B7一2、IcAM一l和ox62等分子表达均明显低于 对照组，MLR显示，TGF印一DC刺激T细胞增殖能力低下。TGF印基 因转染对DC生长无明显抑制作用。6、转染后各组DC输注Lewis大鼠发现，各组DC主要归巢到受者大鼠的 次级淋巴器官胸腺依赖区，其中尤其以TGF印一DC组在输注后第7一14 天时在脾的动脉周围淋巴鞘和边缘区数量最多。7、经TUN旧L、hTERT等方法显示，TGFpl一DC组受者大鼠脾动脉周围淋 巴鞘等处的T细胞凋亡水平明显高于对照组，并且发现该组的T细胞 h花RT表达水平明显低于对照组。8、各组DC异体输注一周后行F344叶Lewis大鼠的心脏移植，发现 TGF印一DC组排斥反应发生时间延迟，排斥反应级别明显降低，移植心中文摘要 脏存活时间显着延长，最长可达51天，平均存活时间达到33.14士7.88 天，与其它组相比具有显着差异(p<0 .01) 9、研究各组移植心脏、受者脾和淋巴结等器官趋化因子RANTES、MCP一1、 Mlp一la、FKN及其受体的表达，发现TGF印一DC输注不同程度地降低 了以上趋化因子的表达，改变其表达模式，提示TGF印下调相关趋化因 子表达可能是TGF印一DC增强移植心脏耐受性的机制之一。结论: 1、TGF印可降低培养BM一Dc的MHcll类分子和B7一2分子表达以及刺激 T细胞能力，该效应可被LPS所逆转。 2、脂质体介导TGF印基因转染Dc可以获得有效表达，TGF印一Dc的分 子表型、分化程度均显示TGF印一DC为imDC。 3、TGF印一Dc术前输注受者大鼠可延迟移植心脏排斥反应发生时间，降低 排斥反应级别，延长移植心脏存活时间。 4、TGF印一DC输注可改变移植心脏及受者次级淋巴器官相关趋化因子及 其受体的表达程度和表达模式。创新点及意义: 1、结合以往小鼠DC培养经验，经过改良，建?
陈丽红[2]2008年在《IL-10和TGF-β1基因共修饰树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中进行了进一步梳理肝移植是目前治疗终末期良性肝病的效治疗手段。肝移植的理想目标是要达到移植肝和受体之间的免疫耐受,既在低免疫抑制或无免疫抑制的情况下移植物仍然功能正常。免疫抑制剂的使用短期内能改善急性排斥症状,但不能保证移植物长期存活,此外免疫抑制剂的长期使用常导致严重的副作用,因此我们寻找有效的在不使用免疫抑制剂的情况下,使受者机体对于移植物产生特异性的耐受已经成为移植免疫学领域最为关注的问题方法,因此,本研究通过对树突状细胞及其基因工程改造,探讨它们与肝移植耐受的关系,从而为无限期延长移植物的存活提供新的治疗方案。在免疫耐受的诱导中,树突状细胞(dendritic cell, DC)起重要的作用,现在已知DC是体内功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC),在机体的特异性免疫中起着非常重要的作用。目前研究证实,DC在启动免疫反应和诱导免疫耐受起决定性作用,这取决于其成熟状态,不成熟DC表面缺乏或低表达MHC分子和共刺激分子,导致T细胞的无能和低反应,从而诱导抗原特异性免疫耐受,而成熟DC表面高表达MHC分子和共刺激分子能激活参与免疫反应的淋巴细胞的增生,因此对DC进行改造以诱导移植免疫耐受成为研究的热点和关键领域。白介素-10 (interleukin-10, IL-10)可抑制Th-1激活的抗原提呈细胞合成细胞因子,阻止单核巨噬细胞活化和抗原提呈细胞的功能。因此,可以抑制炎性免疫反应和T细胞介导的免疫反应。从而减轻免疫排斥反应有很重要的意义。转化生长因子-β1 (Transforming growth factor-β1, TGF-β1)是一种强效免疫抑制因子,它可以抑制细胞毒性T淋巴细胞的增殖和活化,抑制T, B淋巴细胞的增殖及免疫球蛋白的分泌,调节多种细胞因子如IL-1, IL-2的生成并拮抗它们的功能。因此,它在移植免疫过程中,对移植物的长期存活和移植物的耐受密切相关。由于IL-10和TGFβ1既是诱导耐受DC形成的重要细胞因子,又是参与诱导移植耐受的重要细胞因子,所以我们通过从大鼠骨髓分离造血前体细胞体外诱导培养足够数量的DC,构建IL-10和TGFβ1重组质粒,并将其单个和联合转染大鼠imDC,研究IL-10和TGFβ1单个和联合转染后的imDC输注后在受者体内的迁移途径,以及对于同种异体大鼠移植肝的排斥反应级别和存活时间的影响,探讨它们诱导移植耐受的机制。目的通过基因工程改造DC,建立肝移植动物模型,构建IL-10和TGFβ1重组质粒,研究IL-10和TGFβ1单个和联合转染的DC输注受者体内的迁移途径,以及对于同种异体大鼠移植肝的排斥反应级别和存活时间的影响,探讨DC诱导移植耐受的机制,为临床治疗移植免疫排斥提供了有力的实验基础和有关理论上的依据。方法1.DA大鼠DC的诱导、培养及鉴定:用不同细胞因子诱导培养大鼠骨髓来源的造血前体细胞成为成熟DC(mature DC,mDC)和不成熟DC(immature DC,imDC),利用电镜等进行形态学观察鉴定、利用流式细胞法和免疫组化法进行表型鉴定,利用混合淋巴细胞反应和动物体内直接注射DC进行功能学鉴定。2.构建、筛选、扩增、抽提和鉴定pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2- EGFP-hTGFβ1真核表达质粒:(1)RT-PCR扩增人IL-10基因,1%琼脂糖凝胶电泳分离、回收PCR产物,含pIRES2-EGFP空载体,经Xho I和EcoR I双酶切后,T4 DNA连接酶连接,将产物转化于DH5a感受态细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养提质粒,以Xho I和EcoR I进行双酶切鉴定。将双酶切为阳性的质粒pIRES2-EGFP-hIL10送公司测序。(2)hTGFβ1构建方法同前,以Bgl II和Hind III进行双酶切鉴定。(3)用中抽试剂盒抽提质粒,以紫外分光光度计测定质粒的浓度。3.脂质体介导的pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1单个和联合转染imDC细胞:收集培养6天的imDC,按照Lipofectamine2000使用说明进行转染。实验设立空载体转染组、IL-10、TGFβ1转染组和共转染组,48hr荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白在imDC中的表达。4.用5种方法检测转染后各组imDC分子表型和免疫功能的变化:(1)ELISA法和(2)Western Blot法检测转染后各组imDC培养上清IL-10、TGFβ1蛋白表达;(3)流式细胞法检测各组imDC表面分子CD80、CD86表达情况;(4)免疫细胞化学法检测各组imDC MHCⅡ分子表达情况;(5)混合淋巴细胞反应法检测各组imDC对T细胞的增殖作用。5.大鼠肝移植模型构建:受体为Lewis大鼠,供体为DA大鼠,采用二袖套法建立肝移植模型。6.IL-10、TGFβ1单基因和联合转染的DC输注对于同种异体Lewis大鼠移植肝耐受的实验研究:(1)探讨pIRES2-EGFP-DC腹腔和尾静脉输注后在受体Lewis体内的迁移途径以及微嵌合体形成的机制;(2)IL-10、TGFβ1单基因和联合转染的imDC移植前5d输注受体Lewis大鼠体内,移植后分别于3d、7d、10d :1)检测肝功能;2)ElASA法检测各组IL-12水平;3)肝脏苏木精伊红(HE)染色及急性排斥反应病理评分;4)TUNEL法检测肝脏、脾和淋巴结采用淋巴细胞的凋亡情况。(3)观察各组大鼠肝移植后的生存时间。7.统计学处理:应用SPSS10 .0软件进行单因素方差分析,p<0.05为具有显着性差异。结果1.DC的培养及鉴定:(1)形态学观察:DC细胞形态不规则,大多数细胞表面有细长树枝状突起;(2)mDC和imDC表面均表达表面分子OX62,而表面分子CD86在imDC表面低表达,在mDC表面高表达;(3)imDC和mDC与淋巴细胞相互作用,证实imDC对淋巴细胞的增殖作用弱,而mDC对淋巴细胞的增殖有明显的促进作用;(4)注射mDC的肝移植大鼠在移植后较早且出现较强的急性排斥反应,而注射imDC的大鼠在移植后7天才开始出现轻度急性排斥反应,注射imDC的受体大鼠的存活时间显着长于注射mDC的受体大鼠,这也说明imDC能诱导移植耐受,而mDC能诱导移植排斥反应。2.构建、筛选、扩增和鉴定pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2- EGFP-hTGFβ1真核表达质粒:(1)琼脂糖凝胶电泳结果显示,PCR扩增产物大小同预期结果一致;(2)重组质粒pIRES2-EGFP-hIL-10、TGFβ1酶切后显示两个条带,IL-10和TGFβ1大小分别为540bp和399bp;(3)IL-10和TGFβ1质粒测序结果经Genebank的序列比对,两重组目的基因序列完全正确;(4)pIRES2-EGFP-hIL-10浓度360ug/ml,pIRES2-EGFP-hTGFβ1浓度126ug/ml,pIRES2-EGFP浓度382ug/ml。3.脂质体介导的pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1单个和联合转染imDC细胞:(1)转染48h后在荧光显微镜下可见绿色荧光,转染效率为30%。4.检测转染后各组imDC分子表型和免疫功能的变化:(1)ELISA试剂盒检测转染后各组imDC培养上清,发现转染组目的蛋白表达明显高于未转染组和空载体组。(2)Western Blot检测IL-10和TGFβ1基因转染的imDC上清中均有相应蛋白的高表达,共转染组DC上清能同时检测到IL-10和TGFβ1蛋白的高表达,空载体组imDC的上清几乎不表达TGFβ1蛋白,低表达IL-10蛋白。(3)流式细胞法检测证实,CD80和CD86在mDC表达高于imDC及各基因转染组和空载体组;(4)免疫细胞化学染色hIL-10和TGFβ1基因单个和联合转染imDC MHCⅡ呈低表达,而空载体imDC的MHCⅡ分子表达高于各基因转染组;(5)混合淋巴细胞反应证实IL-10组、TGFβ1组以及共转染组的imDC对T的增值有抑制作用,显着低于空载体组和imDC组。各转染组对T细胞增值的抑制作用以共转染组为最低。imDC组和空载体组对T细胞增殖显着低于mDC对T细胞的增殖能力(P<0.05)。5.大鼠肝移植模型构建:利用二袖套法构建受体为Lewis大鼠供体为DA的大鼠肝移植模型,符合原设计的实验方案。6.pIRES2- EGFP–DC经尾静脉和腹腔输注Lewis大鼠,发现供者DC (EGFP阳性)主要分布于受者脾动脉周围淋巴鞘和边缘区以及淋巴结的副皮质区。7.IL-10、TGFβ1单基因和联合转染的imDC输注对于同种异体大鼠移植肝耐受的实验研究:(1)肝功能检测表明:IL-10组、TGFβ1组和共转染组移植后3d、7d、10d的肝功能优于空载体组;(2)ElASA检测表明:mDC和空白对照组移植后IL-12值明显增高,与其它各组有显着性差异。实验组血清IL-12浓度均低于对照组、mDC组、imDC组及空载体组,实验组中以共转染组最低。(3)急性排斥反应评分表明:mDC组较移植后3天就出现轻度急性排斥反应,7d后出现重度排斥反应,较空白组早出现,且程度重。而空载体组和imDC组移植7d才开始出现轻度排斥,实验组中IL-10组和TGFβ1组移植7天出现交界性排斥反应,移植10d后才出现轻度排斥反应。而共转染组在移植后10d均未出现急性排斥反应;(4)TUNEL染色表明:各组DC输注3d、7d、10d脾动脉周围淋巴鞘和边缘区以及淋巴结的副皮质区可见凋亡细胞细胞,各组凋亡细胞中以mDC最最少,而IL-10和TGFβ1基因转染组淋巴细胞凋亡明显增高;mDC组大鼠肝移植后汇管区仅有少量淋巴细胞凋亡, imDC组汇管区淋巴细胞凋亡高于mDC组,但低于IL-10和TGFβ1基因转染组。在基因转染组中,以共转染组汇管区淋巴细胞凋亡为最多。同时,在移植3d、7d、10d中,mDC组凋亡细胞逐渐消失,而转染组的凋亡细胞数量逐渐递增。(5)肝移植后生存时间观察表明:mDC组大鼠绝大部分在肝移植后一周内死亡,空白组大鼠在12内全部死亡,imDC组和空载体转染组大鼠在移植后30天内因持续排斥死亡,实验组由于转染IL-10和TGFβ1基因,存活时间明显延长。IL-10组大鼠移植后存活时间绝大部分接近一个月。TGFβ1组大鼠移植后存活又显着长于IL-10组,大部分在50天左右,最长的甚至活到79天。共转染组的大鼠除一只生存时间是75天,其余的存活时间超过3个月。结论1.本实验已成功利用细胞因子从大鼠骨髓造血干细胞诱导出足够数量的mDC和imDC。同时,mDC和imDC具有不同的生物学特性。2.我们在成功构建pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1真核表达质粒的基础上,采用脂质体法成功转染imDC,可以获得良好的转染效率。转入的基因可以在imDC内表达,并且使imDC的生物学特性发生相应的改变。3.本实验采取基因共转染技术,发现IL-10和TGFβ1共转染对诱导大鼠移植免疫耐受作用和延长移植大鼠存活时间明显优于单基因转染组,而IL-10和TGFβ1基因单基因转染组诱导免疫耐受作用优于未转染组。IL-10和TGFβ1基因联合应用在诱导器官移植耐受有应用前景。
张新华, 钟翠平, 周播江, 顾云娣, 冯久贤[3]2003年在《TGFβ1基因修饰供者树突状细胞降低移植心脏RANTES表达》文中提出目的 探讨移植前输注入TGFβ1基因修饰树状细胞(dendritic cell,DC)对移植心脏正常T细胞表达和分泌的活化调节因子(RANTES)表达的影响。方法 TGFβ1-pcDNA3重组质粒转染供者DC,静脉输注异体大鼠,1周后检测TGFβ1-DC在受者脾和淋巴结的分布。TUNEL法检测受者大鼠脾T细胞凋亡水平,并检测受者脾RANTES表达的变化;同时另一部分输注大鼠接受同种异体心脏移值,观察DC输注后移植心脏存活时间变化,比较移植后不同时间排斥反应级别,免疫组化检测移植心脏 RANTES的表达。结果 TGFβ1-DC输注受者后,1周内可在脾和淋巴结内形成微嵌合,并有效诱导T细胞的凋亡。TGFβ1-DC输注大鼠移植后排斥反应明显低于对照组,移植心脏存活时间明显延长,并发现移植心脏RANTES表达明显低于对照组。结论 TGFβ1-DC能有效降低移植心脏RANTES表达,增强移植心脏免疫耐受性。
苏纪权[4]2007年在《RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究》文中提出目的:探讨RNAi (RNA interference)技术沉默树突状细胞CD40基因,建立DC(Dentritic cells)细胞培养及转染方法,对体外脾淋巴细胞的影响,对IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10分泌的影响,为寻求治疗急性移植排斥反应提供基础研究。方法:1.DC细胞培养:培养参照Giannoukakis等报道的方法[Molecular Therapy 2000;1(5):430-437]。从Dark Agouti (DA)供体大鼠股骨中获取的骨髓细胞在含2ml RPMI-1640的24孔培养板(2×106/孔)中培养,其中含抗生素10%(v/v)小牛血清FCS。加入基因重组大鼠GM-CSF(20ng/mL)以扩增未成熟DC。除GM-CSF外,加入基因重组大鼠IL-4 (20 ng/mL)以获得成熟DC。在选定的培养孔,于培养开始时分别加入pSilencer1:U6-CD40 siRNA和pSilencer空白质粒转染细胞,以鉴定siRNA-CD40抑制由IL-4诱导的DC成熟的能力和其抑制DC中CD40基因表达的能力。每2天更换富含细胞因子的培养液;轻微旋动培养板后,吸除一半旧培养液,再加入等量且含细胞因子的新鲜培养液。因此,非贴壁的粒细胞将被清除又可确保那些已生长出的松散地附在弹性帖壁巨嗜细胞单层上的DC细胞簇不被同时移除。10天后收集那些自动从DC细胞簇离开的未帖壁DC。2.大鼠Silencer2.1-U6- siRNA-CD40重组质粒的构建与鉴定(1)siRNA靶位点的选择及编码siRNA DNA模板的体外合成根据GeneBank(AF241231)大鼠CD40基因mRNA的已知序列,寻找符合特征的靶序列,合成分别针对其叁个编码区合成两条DNA寡核苷酸链(分别命名为CD40 -1,-2,-3)并用RNA structure 4.11软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括19个碱基正义链和与其互补的19个碱基的反义链,正反链之间有9个碱基(TTCAAGAGA)间隔,反义链之后有5个T作为转录终止信号,在模板链的两端加入Hind III及BamH I酶切位点。合成两条链在退火缓冲液(100mM K-acetate, 30mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mMMg-acetate)作用下退火(90℃,3min,37℃,1hr),形成双链结构。待连接。(2)pSilencer2.1-U6载体线性化及回收pSilencer?2.1-U6 neo质粒:全长4521bp,含有U6启动子,氨苄抗性,含NEO基因,可由新霉素筛选稳定转染。pEGFP质粒:带有增强绿色荧光蛋白的原核克隆和表达载体,全长3.4kb,含有LacZ启动子,氨苄抗性;同时与Silencer2.1-U6-siRNA重组共转染,估计细胞体系的转染效率。将pSilencer2.1-U6用BamH I及Hind III分别消化,对消化后产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将含有线性化质粒的凝胶在紫外灯下切下,放入1.5ml离心管中,加入3倍体积的融胶液,45℃-55℃水浴5-10min,使胶完全融化,加入10μl玻璃奶(通常1μgDNA用1μl玻璃奶),混匀,45℃-55℃冰水浴5-10min,其间每隔2-3min混匀一次,5,000转/min离心30-60s,弃上清,加入400μl洗液,轻弹管底,5,000转/min离心30s,弃上清,重复上述步骤一次,吸净洗液,室温干燥,加入10-30μl无菌双蒸水,将玻璃奶悬起,45℃-55℃水浴5-10min,10,000转/min离心1-2min,回收上清用λDNA mark做标准品定量,待连接。(3)载体与siRNA模板链连接连接体系中模板与载体的摩尔数比约为3-5:1,充分混匀,加入T4连接酶16℃反应过夜。连接产物可立即转化感受态细胞或于-20℃保存。同时进行空载体自身环化作为阴性对照。(4)感受态细胞的制备与连接产物的转化取-70℃保存的GM109大肠杆菌接种于平板,次日挑取单菌落接种于LB固体培养基中,370C培养过夜。用无菌签挑取单菌落,转到3mlLB液体培养基中,37℃300rpm振荡2h,取1ml菌液接种到100ml LB培养基中,37℃继续培养待OD600大约为0.4时取出,冰浴10min。将菌液转到灭菌的预冷50ml离心管中,4℃4000g离心10min回收细菌,重悬于10mlCaCl2(0.1mol/L)中,冰浴30min , 4℃4000离心10min ,弃上清,加4 ml预冷的CaCl2(0.1mol/L),置于4℃,16h后用于转化试验,或加入甘油至终浓度10%,-70℃保存备用。取100μl的感受态细菌,加入5μl pSilencer2.1-U6与siRNA连接产物,用空载体作对照,轻轻旋转混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速放置冰浴中2min,加入800μl LB培养基(不含Amp),37℃振荡培养60min,吸100μl培养液滴于含Amp的LB平板涂匀,待表面液体吸收后,倒置平皿37℃培养16-20h。(5)阳性重组克隆的筛选(碱裂解法)15,000rpm离心10min,弃上清,加入冰冷的75%乙醇洗一次,离心室温干燥,用含RNase(50μg/ml)的双蒸水10μl充分溶解沉淀。用M13F(-40): 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' Rev: 5'-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3' primer测序。(6)重组质粒的转染DC细胞用RPMI1640培养基加10%小牛血清37℃,5% CO2培养。用100 ml培养瓶,当贴壁细胞达到80%-90%融合,用无血清培养基洗叁遍,将脂质体15μl加无菌水85μl室温放置10分钟,重组质粒18μg用无菌水加至总体积100μl室温放置10分钟,两者混合室温放置10分钟后加入细胞无血清培养液中,用pEGFP质粒与psilencer1.0-U6-CD40-siRNA按1:20的比例以慢病毒为载体共转染,以标记阳性转染的细胞;空质粒对照用psilencer1.0-U6质粒,另外一组只用脂质体加入培养细胞内;于转染后24-72小时,加G418(新霉素)进行稳定转染阳性克隆筛选,筛选21天后收集细胞,做Western blot分析。3.Western blot测定RNAi干涉后CD40基因在DC中的表达情况裂解RNAi干涉后的DC,用常规Western blot方法检测CD40表达情况。4.单向混合淋巴细胞反应(MLR)采用3HTdR掺入法。刺激物为RNAi干涉后的DC;反应物为Lewis大鼠的脾细胞。最后用自动液闪计数仪测定每分钟脉冲数值。5.通过ELISA的方法检测大鼠淋巴细胞分泌细胞因子的情况。6.统计学分析所得数据以均数±标准差表示,用SPSS软件包(10.0版)进行统计学处理,多组资料均数比较采用F检验,若差异有显着性,则进一步进行q检验。结果:1.成功从大鼠骨髓细胞中体外诱导培养出树突状细胞。2.通过感染含有RNAi序列的慢病毒可以抑制树突状细胞中CD40的表达。3.RNAi沉默后树突状细胞体外活化脾细胞的能力减弱。4.RNAi干涉后的DC活化的淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的量显著减少结论:应用RNAi技术沉默DC上的CD40,切断第二信号传递使T细胞沉默,不被激活,达到抑制急性免疫排斥反应。
邱明链[5]2008年在《FasL和TGF-β1基因共修饰树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中提出肝移植已成为各种良性终末期肝病及早期、中期肝癌有效的治疗方法,然而,急性排斥反应(acute rejection,AR)仍是肝移植术后主要的并发症之一。未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDC)可诱导抗原特异性T细胞低反应性并延长移植器官的存活时间;但它可能在活体内复杂的微环境中接受成熟信号而被诱导成熟,甚至会加重排斥反应。具有免疫抑制功能的单基因修饰imDC的基础研究已证实可增强imDC诱导免疫耐受的能力,也表现出一定的局限性,未能达到理想的免疫耐受状态。本研究采用联合具有不同免疫抑制功能的双基因共同修饰imDC,以进一步提高imDC诱导免疫耐受的能力,从而获得受者的长期生存。目的联合FasL和TGF-β1基因共修饰大鼠骨髓来源的imDC,旨在进一步提高imDC诱导大鼠同种异体原位肝移植免疫耐受的能力,以延长受鼠生存期。方法1.建立改良的大鼠原位肝移植模型:在原二袖套法的基础上,采用快速切取供肝,一针法连续缝合肝上下腔静脉以及对出血点进行热止血等方法,进行120例大鼠原位肝移植,并观察术后存活率。2.建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型:大鼠原位肝移植分3种移植组合:SD→SD组(同基因对照组),SD→Wistar组及DA→Lewis组,每组合20例。分别于术后3、5、7和10 d各随机处死4只,观察外周血肝功能变化(ALT和TBIL)与肝脏病理改变,各组除外技术死亡的受鼠,将余受鼠留做生存分析。3.培养和诱导DA大鼠骨髓来源的DC,经形态学、免疫表型及功能鉴定确认后,将构建好的pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1质粒共转染到imDC,检测hFasL和hTGF-β1的表达。4.将空载体转染的DA大鼠imDC分别从尾静脉注射(尾静脉注射组,20只)和腹腔注射(腹腔注射组,20只)至Lewis大鼠体内,两组分别于注射后第1d、2d、3d、5d及7d各时间点处死4只大鼠,取胸腺、脾脏、腹腔淋巴结、肝脏及肾脏组织行冰冻切片,于荧光显微镜下观察、计数并分析。5.行以DA大鼠为供体、近交系Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植140例,随机均分为7组:未注射DC组(对照组)、mDC组、imDC组、空载体组、FasL组、TGF组及共转染组;分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC、hFasL修饰的imDC、hTGF-β1修饰的imDC、hFasL和hTGF-β1共修饰的imDC各2×106个,于肝移植术后3d、7d、10d各处死4只,观察外周血肝功能变化(ALT和TBIL),肝脏病理改变,肝、脾及腹腔淋巴结凋亡情况,外周血清细胞因子情况,各组除去技术死亡的受鼠,将余下受鼠作生存分析,死亡时取肝脏行病理组织学检查。结果1.大鼠原位肝移植各主要操作步骤手术中位时间:供体手术20 min,供肝修整3 min,肝上下腔静脉吻合9 min,门静脉重建3 min,无肝期15 min,肝下下腔静脉重建3 min。手术成功率达96.7%,动物的3周存活率为94.2%。2. SD→SD组大鼠原位肝移植术后仅有极少量的单核细胞浸润,RAI评分0～3分,属非确定型急性排斥反应(或无急性排斥反应);SD→Wistar组3只(75%,3/4)受鼠移植肝脏病变逐渐加重,到7d时RAI评分为5～7分,属于中度的急性排斥反应,术后10d才出现重度的急性排斥反应;有1只(25%,1/4)大鼠移植肝脏急性排斥反应在10d时反而减轻,淋巴细胞的浸润有所减少;DA→Lewis组3d后移植肝脏病变均迅速加重,RAI评分均为8～9分。经各时间点多组秩和检验示:3d时,3组差异无统计学意义(P=0.173),其排斥反应无显着差异;5、7和10d时,3组差异均有统计学意义(P=0.008、P=0.006和P=0.010),DA→Lewis组排斥反应均最明显,SD→Wistar组次之,SD→SD组均最不明显。SD→SD组血清ALT、TBIL浓度随着时间延长,逐渐下降,10d已恢复正常;DA→Lewis组血清ALT、TBIL浓度术后随着时间的延长,呈进行性升高;SD→Wistar组血清ALT、TBIL浓度随着时间延长,升高相对较慢,10d时达到DA→Lewis组7d的水平(P=0.934,P=0.072)。SD→SD组可长期存活,不发生排斥反应;SD→Wistar组中位生存时间为16d,DA→Lewis组中位生存时间为8d,明显短于SD→Wistar组(P=0.000)。3.成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源DC的方法;经相差倒置显微镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为DC。形态学结果显示:DC形态不规则,细胞核大而偏位,细胞表面可见细长树枝状突起。免疫表型结果显示:mDC和imDC表面均表达表面分子OX62,而共刺激分子CD86在imDC呈低表达,在mDC呈高表达。混合淋巴细胞反应(MLR)结果显示:imDC刺激同种异体T淋巴细胞的能力明显弱于mDC(P=0.005)。pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-hTGF-β1质粒经基因测序显示其序列与Pubmed基因库的hFasL和hTGF-β1序列相符合;经PCR鉴定示在846bp和339bp处有明显的条带。荧光显微镜观察显示pIRES2-EGFP-hFasL和pIRES2-EGFP-h TGF-β1质粒转染imDC后可见绿色荧光。流式细胞仪检测转染后未影响其表面分子CD86和CD80的表达。转染后MLR显示,TGF组、FasL组及共转染组的imDC对T细胞的增殖反应均弱于imDC组(P=0.006、0.002及0.000);共转染组的增殖反应均明显弱于TGF组和FasL组(P=0.010及P=0.030)。ELISA检测TGF组和共转染组的TGF-β1表达明显高于其他组,但各组sFasL的表达差异无统计学意义。经Westen-Blot检测有FasL和TGF-β1蛋白表达。4.供体骨髓来源的imDC在受体内的移行及分布显示:尾静脉注射组,第1d肝脏内imDC数量最多,达(92.2±4.2)个,其次是脾脏(32.6±7.6)个,腹腔淋巴结最少,只有(3.7±2.0)个,随着时间延长,肝脏、脾脏及腹腔淋巴结的imDC数量均逐渐减少;胸腺的imDC数量逐渐增多,第5d最高,为(30.6±14.3)个。腹腔注射组计数显示,腹腔淋巴结为第1d脏器含imDC数量最多的器官,达(40.7±4.0)个,第2d达高峰(64.4±17.8)个,以后逐渐递减,在1d、2d、3d、5d均多于尾静脉注射组,其P值分别为0.000,0.000,0.000,0.003。腹腔注射组第1d肝脏imDC数量处于第2位,达(24.6±5.0)个,并逐渐递增,第5d达到峰值(33.6±15.5)个,在1d、2d、3d少于尾静脉注射组,差异有统计学意义,P值分别为0.000、0.000、0.005。腹腔注射组脾脏呈逐渐递增,第5d达峰值为(35.9±11.3)个,多于尾静脉注射组(P=0.000)。第5d,腹腔注射组胸腺imDC数量少于尾静脉注射组(P=0.001)。5. hFasL和hTGF-β1基因共修饰imDC诱导大鼠肝移植免疫耐受研究:肝脏病理示共转染组和TGF转染组术后仅有较少量的单核细胞浸润,RAI评分2～5分,属非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应,10d开始出现肝细胞再生,有少量的中性粒细胞浸润。FasL组排斥反应为轻度到中度,7d时肝脏出现中性粒细胞浸润,10d出现大量中性粒细胞浸润致大量肝细胞破坏。经Kruskal-Wallis H检验示,3d时,7组差异有统计学意义(P=0.020)但各组肝脏排斥反应均属轻度,共转染组和TGF组的排斥反应均轻于FasL组;7d时,7组差异有统计学意义(P=0.001),共转染组排斥反应均轻于TGF组和FasL组;10d时,7组差异有统计学意义(P=0.001),共转染组排斥反应轻于TGF组和FasL组,TGF组轻于FasL组。肝功能示共转染组于7d时就已基本恢复正常,FasL组于7d时有所降低,但10d时反而升高, ALT及TBIL的浓度均高于共转染组(P=0.000,P=0.028);TGF组到10d时,肝功能已恢复正常,ALT及TBIL的浓度均低于FasL组(P=0.000,P=0.025),但与共转染组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。TUNEL显示FasL组的肝、脾及腹腔淋巴结中淋巴细胞凋亡指数与共转染组相比,差异均无统计学意义(P>0.05),但多于TGF组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测示,术后7d共转染组和TGF组的血清IL-1、IL-10及IL-12与FasL组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);但共转染组和TGF组之间差异无统计学意义(P>0.05)。FasL组中位生存期20d与imDC组(23d)差异无统计学意义(P=0.335),而TGF组延长受鼠生存时间有限(48d);只有共转染组出现长期存活的受鼠(>90d),均长于FasL组和TGF组(P=0.000,P=0.001)。结论1.经改良的大鼠原位肝移植方法,手术时间短,成功率高,稳定可靠,建立了比较稳定的大鼠原位肝脏移植模型,适用于肝移植方面的基础研究。2.SD→Wistar组合的大鼠原位肝移植模型虽可产生急性排斥反应,但发展相对慢,且会出现自发性免疫耐受,因而并非肝移植急性排斥反应基础研究理想的动物模型;DA→Lewis组合的大鼠原位肝移植术后肝脏病理改变、肝功能的变化及生存时间均符合临床上肝移植术后急性排斥反应的特点,是研究肝移植急性排斥反应理想的动物模型。3.本实验能培养、诱导、扩增大量的DC。hFasL或hTGF-β1基因转染均能够获得有效的表达,转染后对imDC表型没有明显影响;可明显降低imDC对同种异体T淋巴细胞的反应性。联合FasL和TGF-β1基因转染的imDC在体外诱导同种异体免疫耐受的能力强于FasL或TGF-β1单基因转染。4.腹腔注射时imDC在体内的分布主要以主动迁移为主,速度相对慢,避免了尾静脉注射时大量imDC快速分布在肝脏,以及切除受体肝脏时其内的imDC丢失,该途径适于肝移植免疫耐受的基础研究。5.imDC、hFasL或hTGF-β1单基因修饰imDC均未能诱导同种异体大鼠肝移植长期存活; hFasL和hTGF-β1共转染的imDC诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受的能力显着增强,显着延长同种异体肝移植大鼠的生存期。
邱涛[6]2013年在《沉默RelB的树突状细胞诱导移植免疫耐受》文中研究表明研究背景实体器官移植是治疗终末期器官衰竭最有效的治疗方式,随着免疫抑制剂的发展,肾移植的5年存活率已得到显着改善,肝脏移植的远期疗效也取得长足进步。但现行的免疫抑制剂仍存在众多副作用,包括促使感染性疾病的发生,以及诱发移植后糖尿病,高血压,高血脂等,这些因素都影响患者生存质量,同时阻碍了受者、移植物的长期存活,而诱导免疫耐受是器官移植后最理想的一种存在方式。诱导对移植物的特异性耐受后可以减少抗排斥药的使用,避免各种毒副作用,延长受者,移植物的长期存活。目前树突状细胞(DC)是一类最具有潜力的运用于诱导免疫耐受的细胞,最初DC被认为是体内最强的抗原提呈细胞,诱导免疫应答,称之为反应性DC,新近又发现DC也可以诱导T细胞低反应性,这种DC被称作为调节性DC,但体内DC数量较少,且以反应性DC为主,如何体内外诱导耐受性DC的扩增,分化成为移植免疫耐受研究的热点。上世纪90年代以后利用细胞因子体外扩增DC的技术逐步成熟,从而为利用DC进行输注治疗提供了基础。研究目的采用小干扰RNA技术,体外制备RelB shRNA慢病毒,同时体外培养扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC), RelBshRNA慢病毒转染DC诱导耐受性树突状细胞的产生,对转染后的耐受性DC的表型,凋亡,分泌细胞因子,以及耐受性DC诱导T细胞反应性研究,以及诱导T细胞低反应性的机制研究。利用RelB shRNA制备耐受性树突状细胞移植前输注预防心脏移植排斥反应。研究方法1、RelBshRNA转染DC后DC生物学形态,功能的改变利用慢病毒载体系统构建RelB shRNA慢病毒载体,制备纯化慢病毒颗粒。实验分组：未成熟组(imDC组),将获得的BMDC持续培养,避免LPS等外源性刺激；成熟DC组(mDC组),将获得的BMDC进行培养,在第7天用LPS刺激成熟；干扰载体对照组(LucR siRNA DC组),将获得的BMDC进行培养,于第5天感染干扰对照载体LucR-siRNA慢病毒,至第7天经LPS刺激成熟；RelB shRNA转染DC组(RelB shRNA DC组),将获得的BMDC继续培养,于第5天感染Re1BshRNA'慢病毒颗粒,至第7天,经LPS刺激成熟。慢病毒感染DC的MOI为50,在MOI为50时,经荧光显微镜和流式细胞仪检测感染阳性率达到92%以上。LPS刺激成熟的浓度为50ng/ml。RT-PCR和Western-blot检测转染后DC中RelB的表达；利用流式细胞仪检测DC凋亡率以及DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；ELISA检测转染后的DC分泌的细胞因子IL-10, IL-12, TGF-β1; ELISA检测转染后的DC胞核NF-KB各亚基的DNA结合活性。2、RelB shRNA转染DC后诱导T细胞低反应性研究利用RelB shRNA慢病毒转染DC获得耐受性树突状细胞。RelB shRNA-DC同同种抗原特异性T细胞(BABL/C来源)进行混合淋巴细胞反应(第1次MLR),将第1次MLR获得的T细胞同相同特异性抗原以及第叁方抗原来源(C3H来源)的DC进行第2次MLR, MTT法检测两次MLR后T细胞增殖能力,ELISA检测第1次MLR后分泌的细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-10和IL-4水平；流式细胞仪检测反应后T细胞凋亡率以及T细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比率。3、RelB shRNA-DC移植前输注预防心脏移植急性排斥反应建立小鼠腹部心脏移植模型,实验分为4组,每组10只小鼠,未输注组：受体BABL/c小鼠心脏移植前后无任何特殊处理；不成熟组：受体BABL/c小、鼠心脏移植前7d经尾静脉输注培养7d但未作其他处理的DC(体外不成熟DC)；空载体组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的空载体转染DC; RelB shRNA组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的RelB shRNA转染DC。观察移植后小鼠心脏存活时间；移植后7天各组各取2只小鼠,切除移植物,行HE染色检测排斥反应程度。结果1、相比于imDC组,mDC组,LucR siRNA DC组,RelB shRNA DC组低表达RelB mRNA和RelB蛋白；RelB shRNA DC组的凋亡率同其余叁组无差异；MB shRNA可下调DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；转染后的DC低表达IL-12,高表达IL-10, TGF-β1表达无差异；RelB shRNA抑制了核内RelB的DNA结合活性,但不影响p50、p52、RelA (p65)、c-Rel的DNA结合活性。2、mDC组和LucR siRNA DC组有较强的刺激同种T细胞增殖能力,imDC组和RelB shRNA DC组DC刺激同种T细胞增殖能力明显减弱；RelB shRNA转染DC能诱导同种T细胞抗原特异性低反应性,但对第叁方抗原无特异性地反应性。MLR后T细胞分泌低水平的IL-2,IFN-γ,分泌高水平的IL-10和IL-4；RelB shRNA-DC诱导T细胞凋亡率增加；诱导T细胞向CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化增加。3、小鼠心脏移植模型中,预先输注供体来源的RelB shRNA-DC可延长移植物存活时间,降低排斥反应发生程度。结论1、利用RelB shRNA慢病毒体外转染树突状细胞使MHC-2, CD80, CD86, CD83呈低表达,分泌抑制性细胞因子,而不影响DC存活以及其它功能。2、RelBshRNA慢病毒转染DC获得的耐受性DC诱导T细胞特异性低反应性,主要机制是诱导T细胞凋亡,诱导T细胞向调节性T细胞分化,分泌的细胞因子由Thl型向Th2型转变。3、在心脏移植模型中,移植前输注RelB shRNA-DC可预防移植物急性排斥反应,降低排斥反应程度,延长小鼠存活期。
王沐淇, 李亚萍, 刘拉羊, 党双锁, 石娟娟[7]2019年在《自噬在肝细胞癌发生发展和免疫治疗调控中的作用及其机制》文中进行了进一步梳理自噬作为基础的生理现象,是维持细胞稳态和生理代谢的重要机制,还可以诱导细胞程序性死亡。目前大量研究证明,自噬在多种肿瘤的发生发展和演化过程中发挥重要作用,这为肿瘤的研究及治疗提供了新的思路。肝癌的发生机制极其复杂,其中免疫调控对肝癌发生、转移和侵袭的作用已经得到公认,近年来自噬被发现通过参与肿瘤免疫、氧化应激和维持细胞稳态等多方面影响肝癌进展,且可通过多种途径对肝癌免疫治疗效果产生影响。综述了自噬在肝癌发生发展和免疫治疗调控中的作用及其机制,以期深入了解自噬在肝癌中的重大影响和潜在的治疗价值。
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