梁莹[1]2004年在《水稻黄单胞菌水稻致病变种与致病相关的新基因的功能鉴定》文中研究指明作者所在实验室以前工作表明含有水稻黄单胞菌水稻致病变种(以下简称Xoo)13751 DNA的重组质粒pGXN3000上至少有4个基因(rpfA、rpfB、rpfC、rpfF)能正向调控该菌的胞外多糖的产生及致病性并已完成了pGXN3000的序列测定。序列分析表明pGXN3000的rpfA上游有4个完整的ORFs，分别为pdeA、cheB、pin、pcaD。pdeA基因为2262 bp，可编码一个含754个氨基酸的产物，该产物与地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(以下简称Xac)的环二鸟苷酸磷酸二酯酶A(c-di-GMP phosphodiesterase A)有96％的相似性和93％的相同性。cheB基因为1074 bp，可编码一个含358个氨基酸的产物，该产物与Xac的谷氨酸甲酯酶(glutamate methylesterase)的相似性和相同性均为67％。pcaD基因为813bp，可编码一个含271个氨基酸的产物，该产物与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(以下简称Xcc)的β-酮已二烯醇内酯水解酶(beta-ketoadipate enol-lactone hydrolase)有92％的相似性和85％的相同性。pin基因产物的功能域分析表明其第189-198个氨基酸为锌指结合域(zinc finger binding domain，ZnF_NFX域)。在rpfC基因下游有—ORF的产物与Xcc的属于双组分调控系统家族的调节蛋白RpfG有99％的相似性和96％的相同性。 为了了解Xoo pdeA、rpfG、cheB、pin、pcaD基因在该菌在水稻致病过广西大学硕_l:学位论文程中的作用和功能，我们用同源自杀质粒单位点整合突变方法分别构建得到了该菌的p认纳一突变体(GXNI 256)、，月一突变体(GXNI 258)、CheB一突变体(GXNI 255)、刀j厅突变体(GXN1269)和户eal)一突变体(GXN1261)。 水稻植株剪叶接种试验表明，xo口p/n-突变体GXNI 269在水稻上引起 的病斑长度与野生型13751的没有显着差别，说明xo口pl’n基因可能与其在 水稻上的致病性无关。无论是在高接种浓度(OD600二0.1)还是在低接种浓度 (0D600=0.001)下，而oFp几一突变体GXNI 258、p动纳一突变体GXNI 256和pCaD- 突变体GXNI 261在水稻上引起的病斑长度显着降低，在高接种浓度(OD600=0.1)下，GXNI 25a、GxNI 256和GxNI 261在水稻上引起的病斑长度分别是野 生型13751的21.37%、64.69%和77.44%，在低接种浓度(0D600=0.001)下 则分别是野生型13751的14.47%、67.99%和76.10%，说明而。的rP招、刀决斌和pCao基因与其在水稻上的致病性有关。 平板检测表明xo口p丈介绒一突变体GXNI 256、rP招一突变体GXNI 258的胞外多糖和OSF因子的产量均显着减少，说明xo口胞外多糖和OSF因子的产生与rP招和p尤论斌基因有关。xo口pde月基因产物的功能域分析表明其第317一488个氨基酸为具有环二鸟昔酸磷酸二醋酶A活性的OUFI域和第498一745个氨基酸为具有二鸟昔酸环化酶活性的DU「2域(也称GGOE「基序)，这两个酶可能参与调控细胞内信号分子环二鸟昔酸的浓度。xo口rP凡基因产物的功能域分析表明第1 92一329个氨基酸为HD域，属于依赖金属的磷酸水解酶家族。关于信号分子环二鸟昔酸与病原菌在植物上的致病的相关性目前还未见报道。平板检测表明xo口p决流基因能很好地恢复rP绍一突变体GxNI 258产Ds「的能力，xo口rP凡基因也能很好地恢复pdeA一突变体GXN 1 256产胞外多糖和DSF的能力。 广西大学硕士学位论文 水稻植株剪叶接种试验表明cheB一突变体GXN 1 255在水稻上引起的病斑长度与13751的没有显着差异，但是水稻植株喷雾接种试验表明cheB一突变体GXN 1 255在水稻上引起的病情指数是1 3751的48.91%。毛细管趋化应答试验表明ch出一突变体的趋化能力显着降低，说明cheB基因与xo口的趋化应答有关，xo。的ch出基因与其在水稻上的致病性有关可能是通过控制其趋向水孔有关。进一步说明趋化性可能在植物病原细菌致病的早期起重要作用。
邹丽芳[2]2007年在《水稻黄单胞菌遗传操作体系的建立及hrp基因和avrBs3/pthA家族基因的功能研究》文中提出水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)和水稻细菌性条斑病(baeterial leaf streak,BLS),在生产上造成水稻损失严重。这两种病原菌已成为水稻的两个模式病原菌。为精确和高通量地研究Xoo和Xooc的致病相关基因的功能、基因间相互作用以及调控,如hrp基因,即决定Xoo和Xooc在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response,HR)和在寄主植物上具有致病性(pathogenieity)的基因,本研究利用pK18mobGⅡ载体建立了一种基于单交换的基因定点插入突变体系和利用自杀性载体pKMS1建立一种基于负选择标记基因sacB的两次同源交换的无标记敲除技术。成功获得了水稻白叶枯病菌PXO99~A菌株的3个hrpF和4个hrcV插入突变体以及RS105的4个hrpF和4个hrcV插入突变体。RS105的hrcV,hrpF、hrpE、hpaB和hpa1的单基因敲除突变体,hpa1和hpa2、hpa1和hrpF、hrpE和hrpF以及hpaB和hrpF的双基因敲除突变体;hpaB、hpa1和hrpF及hpa2、hpa1和hrpF的叁基因敲除突变体。多基因敲除技术的建立为研究水稻黄单胞菌致病相关基因的功能以及在致病过程中基因间相互作用奠定了遗传学基础。有证据表明水稻黄单胞菌都含有15个以上的avrBs3/PthA家族基因,它们具有几乎一样的5'端和3'端,不同的只是中间102 bp重复单元的重复数不同。本研究以avrBs3/pthA家族成员avrXa3的3'端含有核定位信号和酸性转录活化域的359bp的DNA片段构建探针,对中国菌系的白叶枯病菌和条斑病菌的基因组DNA进行Southern杂交分析,发现这两种病原菌的不同小种间所含有的avrBs3/pthA基因的拷贝数不同,有些条带在所有的小种中都存在,有些条带是某个小种所特有的。毒性弱的小种含有较少的avrBs3/pthA家族成员,毒性强的小种含有较多的avrBs3/PthA家族成员和较多的102 bp重复单元的重复数。以相同的359 bp的DNA片段为探针进行菌落原位杂交,从条斑病菌RS105菌株的基因文库中筛选到35个阳性克隆,经过酶切和Southern杂交后归类为28个avrBs3/PthA基因。34个阳性克隆分别导入白叶枯病菌PXO99~A菌株中,进行水稻近等基因系苗期注射接种和成株期剪叶接种,发现含有p6、p8、p9、p10和p14的克隆在含有抗病基因Xa10的水稻品种IRBB10上产生特异性的HR(Hypersensitive response)反应。序列测定结果显示它们均是avrBs3/pthA家族的成员,分别命名为avr/pth6、avr/pth8、avr/pth9、avr/pth10和avr/pth14。蛋白质序列比对发现,这5个蛋白质的C端均缺少水稻白叶枯病菌avrBs3/pthA家族特有的SGsVGGTI残基。基因旁侧序列比较发现,水稻条斑病菌的avrBs3/pthA基因在启动子区存在特有的GTTTCTG序列,avr/pth14在启动子区和终止子区存在一段顺式元件,具有转座子转移的特征.将avr/pth6和avr/pth8的BamHⅠ片段替换avrXa3基因相应的BamHⅠ片段,构建为新的融合基因avrBre6和avrBre8,这两个融合基因仍可使PXO99~A菌株在IRBB10上具有无毒性。从水稻条斑病菌中克隆avrBs3/pthA家族基因还未见报道。本研究的结果揭示,Xooc中存在avrBs3/pthA家族基因,可能因为Xooc中某种因子的存在,限制了avrBs3/PthA基因的无毒性功能,这也可能是水稻缺少抗条斑病的主效抗性基因的原因。hrcV基因在动植物病原细菌中高度保守,基因产物是Ⅲ型分泌系统的组成蛋白,推测形成一环状结构,位于细菌的内膜。本研究通过单交换同源重组分别获得了PX099~A的PXV268、PXV917、PXV106和PXV452插入突变体以及RS105的RSV268、RSV917、RSV106和RSV452突变体;通过双交换同源重组获得了RS105的菌株hrcV缺失突变体RS105△hrcV.PXV268和RSV268突变体在非寄主上仍能激发HR,在水稻仍具有致病性.其余的hrV突变体PXV917、PXV106、PXV452和RSV917、RSV106、RSV452丧失了在水稻上的致病性和在非寄主上激发HR反应的能力.HrcV的突变体与Ⅲ型组分蛋白HrcN、HrcJ、HrcR以及TTSS效应分子Avr/pth28、AvrXa3和Avr/pth13的酵母双杂交结果揭示:HrcJ和HrcR蛋白主要与HrcV蛋白N端互作;HrcN蛋白主要与HrcV蛋白C端互作;HrcV蛋白C缺失可能影响AvrBs3/pthA蛋白的分泌。黄单胞菌通过hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)经Hrppilus和HrpF形成的translocon将T3SS效应分子转运至寄主细胞中从而导致寄主产生抗(感)病性.hpa1编码的蛋白Hpa1是一类harpin蛋白,可在非寄主烟草上激发HR,hpa2基因在各类黄单胞菌中高度保守,编码类似溶菌酶的蛋白.在本研究发现,ArpF和hpal基因单突变以及hpa1和hap2基因双突变后Xooc(RS105)仍可在非寄主烟草上产生HR以及在水稻上可形成水渍(water soaking)症状,但是症状不能有效扩展.hrpF和hpa1基因双突变体以及hrpF、hpa1和hpa2的叁突变体则丧失了激发烟草产生HR反应和在水稻上形成水渍症状的能力。喷雾接种发现,hrpF突变体不能侵染水稻形成条斑症状,hpa1突变体以及hpa1和hpa2的双突变体能够形成短小的条斑。电镜扫描显示,hpa1和hrpF单突变体均可通过气孔侵染水稻,而hrpF和hpa1双突变体以及hrpF,hpa1和hpa2的叁突变体则丧失了在水稻气孔细胞处聚集的能力。扫描电镜显示,hrpF和hpa1单突变以及hpa1和hpa2双突变体均能与水稻细胞互作,但hrpF和hpa1双突变体以及hrpF、hpa1和hpa2的叁突变体则丧失了与水稻细胞互作的能力。这提示,hrpF和hpa1基因协同作用是水稻条斑病菌水渍症状形成的主要因素,或者HrpF和Hpa1是两个主要的转运蛋白;hrpF基因是水渍症状扩展的主要因子;hrpF和hpa1基因突变不影响病菌通过气孔侵染水稻,但因突变后影响其它效应分子与水稻细胞的互作从而影响了病害症状的扩展或者与水稻建立营养寄生关系的能力。hrpF和hpa1基因功能的分析将加快Xooc与水稻的互作研究,为从分子水平解析条斑病水渍症状的形成机制奠定了基础。hpaB和hrpE基因XooC在水稻上致病性和烟草上HR反应所必需的。hrpB和hrpE基因突变,则Xooc丧失了在烟草上激发HR的能力和在水稻上的致病性。hpaB和hrpF双突变体仍能使XooC保持在烟草上的HR反应,但丧失了在水稻上的致病性.hrpF、hpaB和hpa1叁突变体丧失了激发烟草HR应的能力和在水稻上的致病性。突变体与水稻愈伤细胞的互作结果显示:hpaB突变体以及hrpF和hpaB的双突变体都能够与水稻愈伤细胞互作,hrpF、hpaB和APa1的叁突变体以及ArpE突变体丧失了与水稻愈伤细胞互作的能力。扫描电镜的结果显示:hrpE基因突变,Hrp plius装置不能够形成是致病性丧失的主要因素。HpaB可能特异性控制能够引起水渍症状的效应分子的分泌;不依赖HpaB分泌但经址HrpF转运进入植物细胞的某些(个)效应分子能够抑制烟草的HR反应;Hpa1是不经过HrpF进入植物细胞的一类Harpin蛋白。本研究获得了水稻白叶枯病菌PXO99~A菌株的叁个hrpF突变体PXF322、PXF410和PXF744。叁个突变体通过注射接菌在苗期水稻叶片中仍能够引起水渍状病斑和具有激发烟草产生HR反应的能力。通过剪叶接种成株期水稻结果发现,叁个突变体丧失了在水稻叶片上引起白叶枯症状的能力,功能互补子能够恢复突变体在水稻上形成与野生型相似的病斑长度。以上结果证明,Xoo的hrpF是影响水稻白叶枯病菌致病性的关键基因,但是hrpF的突变并不能完全阻止T3SS效应分子与寄主和非寄主植物的互作。
唐唯[3]2007年在《水稻黄单胞菌效应物转运系统的检测与新的效应物的鉴定》文中研究表明效应物是能通过病原细菌Ⅲ型分泌系统转运至植物或动物细胞内，起到识别或致病作用的蛋白质，效应物对病原细菌的致病至关重要。效应物蛋白从结构上可以分为信号区和功能区，目前已经证明了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris)的无毒基因产物AvrBs1第1—58个氨基酸是转运信号，第59—445个氨基酸是负责在辣椒ECW-10R上引起过敏反应的功能区。目前，缺少有效、快速的鉴定水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv．oryzae)效应物的方法。本研究以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv．campestris)的无毒基因产物AvrBs1的过敏反应诱导功能区作为报道，选择在启动子区有PIP-BOX 5个受hrpX调控的基因，Xoo1832，Xoo1842，Xoo2905，Xoo4134和Xoo4365，PCR扩增信号序列后同框连接到报告基因上游，叁亲本结合的方法导入Xoo13751和突变体hrcV~-，过敏反应检测最终确定Xoo4134是一个新的效应物基因，突变体植株试验证明，该基因和致病性有一定关系。本研究同时也证明了该报道系统能在Xoo中工作，因此该系统可以作为Xoo中鉴定新的效应物的良好平台。
韩志成[4]2010年在《水稻黄单胞菌clp基因的克隆及功能研究》文中进行了进一步梳理水稻黄单胞菌包含两个致病变种Xanthomonas orzae pv. oryzae (Xoo)和X. oryzae pv. oryzicola (Xooc),在水稻上分别引起白叶枯病和细菌性条斑病。在本研究中,我们鉴定了水稻白叶枯病菌PX099菌株和水稻条斑病菌Rs105菌株clp基因的部分功能,明确了clp基因对这两种植物病原菌在致病性,游动性,趋化性,胞外多糖和毒力方面的影响。(一)根据水稻黄单胞菌clp基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻条斑病菌中克隆了clp同源基因,命名为clp。通过缺失突变构建了Rs105的clp基因突变体,经PCR验证确认。与野生型菌株Rs105相比,clp基因突变体并不影响正常生长,并且仍可激发非寄主烟草的过敏性反应。有趣的是,clp基因突变体鞭毛没有缺失,但是却极大减弱了游动性,并基本丧失致病性。此外,在有氧条件下,该突变体对葡萄糖几乎不产生趋化性应答。明显地,与野生型菌株相比,clp突变体减少了胞外多糖的分泌量,并且显着削弱了在成株期水稻上的毒力。结果显示,水稻条斑病菌的clp基因对其在水稻上的致病力起重要作用。(二)根据黄单胞菌clp基因的序列设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)中克隆了clp基因,命名为clpxoo。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。通过缺失突变的方法,构建了clp的缺失突变体。对游动性及葡萄糖的趋化应答能力检测发现,clp基因突变株的游动性和趋化能力明显降低,且在试管沉降实验中差异显着,但是在电镜下观察发现clp突变株的鞭毛和野生菌差异不大。胞外多糖检测发现,clp突变株的胞外多糖产量减少。利用剪叶接种法接种感病寄主IR24,突变体的致病能力降低；不过和野生型菌株一样,突变株也能激发非寄主的烟草过敏性反应。推测clp基因与水稻白叶枯病菌的毒力,鞭毛活动能力和趋化性相关。
王超[5]2006年在《水稻黄单胞菌水稻致病变种的xrvA基因的功能鉴定》文中研究指明本实验室以前工作表明，含有水稻黄单胞菌水稻致病变种(以下简称Xoo)13751 DNA的重组质粒pGXN3400上有一个基因xrvA能调控该菌胞外多糖的产生及致病性，并已完成了xrvA的序列测定。xrvA基因为402 bp，可编码一个含134个氨基酸的产物，该产物与地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(以下简称Xac)的xrvA基因的相似性为98％，相同性为96％。为了了解水稻黄单胞菌水稻致病变种xrvA基因在其致病过程中的作用，我们用同源自杀质粒单位点整合突变方法构建了该菌的突变体GXN1280。通过在水稻上的毒性检测发现无论是高接种浓度还是低接种浓度下，GXN1280在水稻上的致病性均比野生型菌株13751显着降低，说明xrvA基因与其在水稻上的致病性有关；胞外多糖摇瓶发酵检测表明胞外多糖的产量也比野生型菌株13751显着降低。而且xrvA基因对纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶活性没有影响，xrvA基因不调控DSF因子的产生。通过病原菌生长动力学实验说明了xrvA基因突变体GXN1280能够降低病原菌在植株体内的致病性和病原菌在植株体内的生长情况无关。GXN1280也不影响病菌在培养基中的生长。过量表达菌株GX03098质粒在水稻体内生长不稳定。说明xrvA基因在病菌在致病过程中的作用可能是通过正向调控胞外多糖的合成来起作用的。
杨万风[6]2006年在《水稻黄单胞菌gacA、ppsA和zur基因的克隆及功能分析》文中研究表明水稻黄单胞菌包含两个致病变种Xanthomonas orzae pv.oryzae(Xoo)和X.oryzae pv.oryzicola(Xooc)，在水稻上分别引起白叶枯病和细菌性条斑病。本研究对水稻黄单胞菌gacA、ppsA和zur基因进行克隆与鉴定，并对基因进行序列分析。用同源重组的方式构建相应基因的插入突变株，通过与野生型菌株进行表型比较来推知基因相应功能。 (一) 根据已公布基因组的X.axonopodis pv.citri(Xac)和X.campestris pv.campestris(Xcc)的gacA基因序列，设计简并引物GF／GR，采用PCR的方式从Xoo菌株PXO99和Xooc菌株RsGD42染色体中扩增了gacA基因的同源片断。核酸序列分析表明，gacA基因全长648bp，编码215个氨基酸的蛋白。Xoo和Xooc gacA基因只有2个碱基的差别。在与其它种gacA基因比较发现其在Xanthomonas属中是保守的。NCBI网站蛋白保守域搜索结果表明，GacA属于LuxR蛋白家族相似蛋白的一员。其具有一个CheB结构功能域，可能参与调控细菌的趋化性。 以引物XOR1／XOR2扩增gacA基因的内部片断，连接于PMD18-T，获得重组质粒pXOR和pXORs，电击转化质粒于野生型菌株电转感受态细胞中。通过单交叉同源重组的方式将重组质粒整合入基因组染色体中获得突变株。PCR和Southern杂交验证质粒插入的正确性。通过对0.1％Tryptone趋化性的调控来看，突变株较野生型的趋化性有了一定程度的下降。但对其它一些表型的测定结果证明，gacA基因并不是水稻黄单胞菌的全局性调控子。 (二)水稻白叶枯病菌基因组全序列已公布。通过基因组注释发现，Xoo只有一条糖异生路径，也就是苹果酸酶-磷酸烯醇式丙酮酸合成酶途径。本研究通过单交换同源重组的方式构建了磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因(ppsA)的非极性哭变体OSPAM。碳源利用检测显示，野生型菌株PXO99和互补菌株COSPAM能够在以柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸、丙酮酸、甘油或乙酸作为唯一碳源的基本培养基上正常生长，而OSPAM则不能正常生长。说明PPSA途径是PXO99在糖异生过程中从四碳二羧酸合成磷酸烯醇式丙酮酸的唯一途径，这一结果和基因组注释相符。利用剪叶接种法接种感病寄主汕优63，突变体产生的病斑长度明显低于野生型。寄主叶内生长测定结果显示OSPAM的生长比PXO99低一个数量级。这些结果表明糖异生过程是白叶枯病菌致病及在寄主体内生长必需的。 (叁)锌吸收调控蛋白(Zur)存在于许多细菌中，当细胞内的锌离子浓度过高
张鼎鼎[7]2010年在《水稻条斑病菌hrcQ基因的功能以及hrpG在稻黄单胞菌两个致病变种中的互置性》文中提出水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)属于革兰氏阴性植物病原细菌,侵染水稻引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS),是东南亚国家和中国水稻上的重要细菌病害。水稻条斑病菌的hrcQ基因在动植物病原细菌中高度保守。不同植物病原细菌的HrcQ蛋白因在N端有变化,推测可能与分泌的效应分子特异性有关。水稻条斑病菌HrcQ蛋白对Ⅲ型分泌装置的(type III secretion system, T3SS)形成以及对效应分子的分泌性影响还不清楚。本研究利用同源重组方式获得了水稻条斑病菌hrcQ基因的敲除突变体,其丧失了在烟草上激发过敏反应(HR)的能力和在水稻上的致病性。hrcQ基因与水稻细胞互作时受诱导表达。蛋白质-蛋白质互作结果显求,HrcQ可分别与Hpa1、HrcN、HrpB5和HrpB2互作。分泌性检测发现,HrcQ不通过T3SS分泌至胞外。hrcQ基因突变,影响Hpal和HrpB2蛋白分泌。这些结果表明,HrcQ蛋白是形成Ⅲ型分泌装置的基本组分,并通过帮助Hpal和HrpB2等T3SS效应因子的分泌,从而影响病菌在非寄主上的HR和在水稻上的致病性。这为进一步分析水稻黄单胞菌T3SS的形成和分泌机制奠定了基础。hrpG和hrpX是水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)主要的hrp调控基因,控制着编码Ⅲ型分泌装置组分蛋白(type III secretion system,T3SS)基因和效应基因的表达,决定于病原菌在寄主植物上的致病性和在非寄主植物上的HR反应(hypersensitive response, HR)本研究对这两个致病变种的hrpG和hrpX进行了功能互置的研究,结果显示Xoc和Xoo的hrpX能够进行功能互置；Xoc的hrpG互补进Xoo的hrpG突变体,能够恢复突变体在寄主水稻上的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力至野生型水平；Xoo的hrpG互补进Xoc的hrpG突变体后,无法恢复其在寄主植物上的致病性和在非寄主烟草上激发HR的能力,但是并不影响下游hrpX, hrcT、hpa2、hrpD6和hpaR基因的转录表达,也不影响胞外蛋白酶的分泌,这些证据暗示：Xoo和Xoc的hrpX具有相同的功能,能够进行互相置换,Xoc的hrpG除具有Xoo hrpG的功能外,还控制另外一些未知基因的表达,且这些基因的表达不受Xoo hrpG的调控,为揭示这两种病原菌组织特异性的侵染机制提供了线索。
韦珂[8]2005年在《野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病相关基因的鉴定及分析》文中研究说明野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris;简称Xcc)是十字花科植物重要的病原细菌,能广泛的引起十字花科作物的黑腐病。Xcc侵染寄主植物的过程是非常复杂的,一般经过吸附-识别-侵入-繁殖-定殖-扩展-显症7个过程,而且每一个过程都有相应的基因参与;Daniels预测大约有20～100个基因参与Xcc的致病过程,而目前已经实验证实的致病相关基因大约有60多个。可是根据野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株基因组数据,预测的致病相关基因有250多个。由此可见在该病原菌中,尚有许多未知的致病相关基因有待人们去鉴定。目前,寻找致病相关新基因的方法主要有3种:一是构建突变体的方法,该方法是通过构建病原菌基因组中每一个基因的突变体,然后进行致病性检测;二是基因差别表达的方法,该方法是通过GUS报告系统或通过DNA芯片杂交检测在丰富培养基中和寄主体内或模仿寄主体内环境条件的培养基的基因表达差异,一般将那些受寄主诱导的基因作为致病相关基因的候选基因;叁是生物信息学分析法,该方法通过在病原菌基因组中寻找和已报道的其他病原菌的致病相关基因的同源基因作为该病原菌的致病相关基因的候选基因。本研究采用了第一和第叁种方法进行Xcc致病相关新基因的鉴定。首先,在本实验已经构建了Xcc8004的Tn5gusA5插入突变体库并对所有突变体进行了致病性检测的前提下,我们利用标记置换(marker exchange)的方法对10个致病力下降的Tn5gusA5插入突变体重新构建突变体,证实2个与Xcc致病相关的插入位点,通过进一步的非极性突变体的构建及互补证明了hgiA和gpdA基因与该病原菌的致病相关。另外,通过检查Xcc8004基因组注释结果,我们发现Xcc中存在一个与植物病原菌欧文氏菌致病因子调控基因rsmA高度同源的基因-csrA,我们通过定点整合突变的方法获得了该基因的非极性突变体,致病性检测表明该突变体不能在寄主植物满身红萝卜上引起症状。 hgiA基因编码产物为MarR家族转录调控子(MarR family transcriptional regulator)。MarR转录调控子在大肠杆菌中最先是作为非特异抗生素抗性抑制子,翼式双螺旋的结构是该家族成员的共同特征。已经证明欧文氏菌,沙门氏菌,耶尔森氏菌中MarR家族转录调控子在致病过程中发挥重要作用。而Xcc的hgiA基因突变以后,突变体的致病力也明显减弱。用OD_(600)=0.1的接种浓度用剪叶法接种满身红萝卜,接种10天后,接种突变体的叶片病斑长度为3.25mm,而接种野生型菌株8004的叶片的病斑长度为12.5mm,而且突变体的致病缺陷能被hgiA基因反式互补,这一结果证明hgiA基因是病原菌致病所需要的。叶内回收菌体试验结果表明hgiA突变体在寄主叶内的生长量比野生型菌株显着减少,说明hgiA基因是病原菌叶内生长所必需的。我们在8个不同栽培品种的十字花科植物上检测了hgiA突变体的致病力,结果发现在健春(大白菜)(Brassica campestris var.JianChun)、中白78(Brassica campestris var.ZhongBai78)和京丰1号(卷心菜)(Brassica campestris var.JingFengNol)上完全没有致病力,而在花叶白萝卜(萝卜)(Raphanus sativus L.var.radiculus HuaYe)、板叶红袍(萝卜)(Raphanus sativus L.var.radiculus BanYeHongPao)、晚丰(甘蓝)(Brassica oleracea L.var.WanFeng)、鲜红小金钟樱桃(萝卜)(Raphanus sativus L.var.radiculus XianHongXiaoJinZhong)和秋王70(花椰菜)(Brassica oleracea var.QiuWang70)的致病力为野生型菌株的20～30%。尽管该突变体的致病力明显下降,但是我们发现它的致病因子如胞外多糖的产量,胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纤维素酶的活性与野生型菌株比较没有明显差异;而且突变体在丰富培养基和MMX基本培养基中与野生型菌株8004的生长状况也没有差异。为了研究该基因
李小杰[9]2013年在《水稻黄单胞菌Hpa1与AvrBs2蛋白调控植物生长与抗病性的研究》文中研究说明革兰氏阴性植物病原细菌Harpin与Avr蛋白代表Ⅲ型泌出蛋白的不同类型,对致病性与植物抗病防卫反应起不同作用。Avr蛋白属于致病效应因子,需要从细菌细胞转移到植物细胞,才能行使致病功能。Harpin蛋白作为转运子起作用,帮助致病效应蛋白转位。同时,无论是Harpin蛋白还是Avr蛋白,对致病性与植物抗病防卫反应都有双重影响,而Harpin蛋白还有促进植物生长的作用。对这种多重功能的分子机制,目前还不完全清楚。本文选用以前了解比较多的Harpin蛋白Hpal,研究其促进植物生长与抗病防卫反应的分子机理,探讨蛋白结构与亚细胞定位对其功能的影响。另外,还研究了水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)AvrBs2的致病作用,为今后探讨Harpin与Avr蛋白之间的功能关系提供基础。1.Hpal利用乙烯和赤霉素信号调控植物生长与生长相关基因表达前人研究表明,Harpin通过乙烯信号及其调控因子EIN5来促进植物生长,这一效应主要涉及植物伸展素蛋白(expansin, EXP)的作用。植物EXP构成一个很大的蛋白家族,其成员受不同激素的调控,松弛细胞壁、促进细胞伸展,影响植物不同器官或组织的生长。EXP蛋白家族何种成员受何种激素信号调控,还不完全清楚。因此,本文研究了水稻白叶枯病菌Hpa1诱导EXP基因表达与促进植物生长的关系,着重探讨乙烯与赤霉素在这个过程中所起的作用。研究结果表明,当用Hpa1分别处理拟南芥、番茄、烟草和水稻时,植物的生长速度加快,同时叶片含氮量、叶绿素含量及叶绿素a和叶绿素b的比率提高。对Hpa1诱导的EXP基因表达分析结果显示：有11个组织特异性的EXP基因被Hpa1诱导表达,其中有4个与Hpa1诱导的信号通路相关,还有4个是最新鉴定的在烟草或水稻叶片中特异表达的基因。Hpa1处理能够诱导乙烯信号通路关键基因的上调表达,而阻断乙烯信号的响应,能够抑制Hpa1诱导的EXP基因表达和植物促生长作用。在水稻中,Hpa1诱导EXP基因表达和促生长效应与GA3作用类似,而阻断赤霉素的生物合成,Hpa1诱导的EXP基因表达和促进植物生长的作用也会被抑制。由此说明,Hpa1诱导EXP基因表达和促进植物生长需要ET和GA信号的参与。2.Hpa1蛋白生物学功能行使与促进植物生长的作用必需其N-端序列水稻黄单胞菌的Hpa1蛋白,能够促进植物生长,增强植物防卫反应与抗逆性,但机制还没研究清楚。已有研究表明,Hpal N-端氨基酸对其在非寄主烟草上产生HR是必需的。为了研究Hpa1N-端氨基酸对其生物学功能及植物生长的影响,我们分别构建了全长Hpal和Hpal N-端缺失突变体的原核表达载体,得到了全长Hpa1蛋白和缺失N端的Hpa1蛋白(Hpa1ΔNT).分别用Hpa1和Hpa1ΔNT处理植物,发现HpalΔNT丧失了激发烟草产生HR的能力,同时也大大减弱了植物的抗病防卫反应及抗逆性。对植物生长能力的测定结果表明,Hpa1能够促进植物的营养生长,但不影响生殖生长；Hpa1处理能增强植物生长相关基因的表达和植物叶片细胞的伸长生长；Hpa1处理能促进植物叶片叶的CO2的传导及光合作用,而HpalΔNT则大大削弱了Hpa1所诱导的促生长效应。由此说明,Hpal N-端对其生物学功能的行使及促进植物生长是必需的。3.质外体和细胞质Hpal对H2O2的产生与抗病性发挥不同作用革兰氏阴性植物病原细菌分泌的Harpin蛋白能够激活植物防卫反应信号通路,诱导植物产生抗病性,其中包括Harpin诱导的活性氧爆发,尤其是质外体中H2O2的产生。但是,Harpin蛋白在防卫反应信号通路中是如何被识别的以及产生于植物细胞质外体中的H2O2是如何参与防卫反应的,目前还不是很清楚。本研究以水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1为研究对象,解析其亚细胞定位是否影响了H2O2的产生以及H2O2是如何参与调控植物抗病性的。分别把Hpal和融合了质外体定位信号基因(S)的Hpal(SHpa1)转入拟南芥,产生了转基因拟南芥植株HETAt (Hpal-expressing transgenic Arabidopsis thaliana)&SHETAt (SHpal-expressing transgenic Arabidopsis thaliana)。研究发现,转基因拟南芥对丁香假单胞菌Pst DC3000和大白菜软腐病菌Pcc RL4具有抗性。亚细胞定位显示,Hpa1定位于HETAt的细胞质及SHETAt的质外体和细胞膜。通过对植物中H2O2的检测发现,H2O2主要积累于HETAt的细胞质及SHETA的质外体和细胞质。药理学试验结果表明,H2O产生于HETAt的细胞质和SHETAt的质外体,并且产生于质外体的H2O2依赖于NOX。外源喷施Hpa1处理野生型拟南芥时,其主要定位于细胞质外体并能诱导H2O2在质外体产生,且质外体H2O2能转运至细胞质。用DPI处理喷施Hpa1的野生型拟南芥和SHETAt植物后,抑制了质外体H202的产生,且细胞质中H2O2的积累也大大减少,同时也削弱了植物的抗病能力。以上结果表明,受Hpa1诱导且在质外体产生的H2O2需要从质外体运转到细胞质中才能参与植物防卫反应过程。4.水稻条斑病菌Ⅲ型效应因子AvrBs2的病理功能研究水稻黄单胞菌通过Ⅲ型分泌系统将大量的效应因子注入寄主细胞,使寄主产生抗(感)病性。虽然越来越多的Ⅲ型效应蛋白包括Avr蛋白被鉴定出来,但是关于其蛋白结构与生物学功能的研究目前还不是很多。AvrBs2是第一个被证明能够增强病原细菌在寄主植物中繁殖的Ⅲ型效应蛋白,能够增强野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris pv. vesicatoria(Xcv)的毒性,但是高度保守的AvrBs2效应因子在其它黄单胞菌中的生物学功能目前研究的还不是很清楚,尤其是水稻黄单胞菌。本文拟研究Xoc菌株RS105的AvrBs2效应因子的蛋白结构与生物学功能。通过同源交换,我们获得了avrBs2xoc基因插入突变体。接种试验结果表明,avrBs2突变体和野生型虽然在烟草上引起过敏反应的能力没有明显差异,但突变体却显着降低了病原菌在水稻IR24上的致病性,同时增强了植物病程相关蛋白基因PR-laΔPR-1b的表达。由此我们判断,AvrBs2xoc是一个致病效应因子,且能抑制寄主植物的免疫反应。
王建良[10]2017年在《水稻黄单胞菌PXO99~A抗低氧压力研究以及叁型效应蛋白的发掘》文中指出水稻白叶枯病是由水稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)引起的一种破坏性极大的细菌性病害,长期以来对水稻的产量造成巨大的损失。Xoo对宿主水稻的成功侵染不仅依赖各种致病因子的作用,还需要克服在侵染过程中遭遇的各种环境压力。研究Xoo的毒力因子和其克服环境压力的策略具有重要意义。氧在病原菌与宿主的互作中起重要的作用。研究表明,病原菌在侵染宿主的过程中会诱导宿主局部低氧环境的产生。Xoo侵染水稻的过程中会诱导维管束内低氧环境的产生,使Xoo遭遇低氧环境的胁迫。Xoo是一种好氧细菌,低氧环境不利于其生长繁殖;另一方面,低氧可作为一种信号被Xoo所感知进而调控自身相关基因的表达以适应低氧环境并启动侵染相关的机制。为研究Xoo在低氧胁迫下的应对策略,本课题以Xoo PXO99~A为研究对象探索Xoo在低氧不利条件下的生长、代谢和致病因子的表达调控变化。首先我们对低氧和常氧两种条件下培养的PXO99~A总蛋白进行提取和鉴定。对两种条件下的蛋白质进行比较分析发现在常氧和低氧条件下分别有187和140个蛋白质被特异检测到。通过WEGO(Web Gene Ontology Annotation Plot)对这些常氧和低氧条件下特异检测到的蛋白质进行GO(Gene Ontology)功能分类,可分别分为34和32类。GO富集(GO enrichment)分析发现常氧条件下被特异检测到的蛋白质主要富集在趋化性和细胞壁合成相关途径,而低氧条件下被特异检测到的蛋白质主要富集在芳香族氨基酸合成相关途径。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析显示常氧和低氧条件下被特异检测到的蛋白质分别参与到48和64条代谢途径中,其中分别有17和33条代谢途径是低氧和常氧条件下所特有的。低氧条件下所特有的代谢通路有糖酵解/糖异生、蛋白质运输、丙酸代谢和丁酸代谢等途径。跟据以上分析,我们选取了15个在低氧条件下被特异检测到的蛋白质研究Xoo在适应低氧条件下的毒力机制。选取的15个蛋白可分别参与到细菌粘附、芳香族氨基酸合成、糖酵解、丁酸或丙酸代谢相关途径中。通过同框缺失敲除对15个蛋白的编码基因进行敲除得到10个同框缺失突变体。以敏感水稻MH63为靶标对缺失突变体的致病力进行检测发现乙酰酯合成酶2催化亚基蛋白PXO_02606功能缺失时导致致病力丧失,而葡糖激酶PXO_00609和F5/8 type C结构域蛋白PXO_01697功能缺失时导致致病力下降。进一步的实验发现,PXO_02606的同框缺失突变体在贫瘠培养基XOM2中表现出生长缺陷,其致病力丧失是因为生长缺陷造成的。对PXO_00609和PXO_01697的功能进行初步探索发现,PXO_00609的缺失导致胞外多糖(EPS)产量和运动能力相对野生型菌株明显减弱。以上结果表明,在低氧条件下Xoo通过PXO_00609促进EPS的合成和细菌的扩散进而促进其感染。PXO_01697由N端信号肽、F5/8 type C和AfuC(Alpha-L-fucosidase)保守结构域叁部分组成。AfuC结构域属于岩藻糖苷酶超家族,与碳水化合物的代谢和运输相关。F5/8 type C可与脂质、多糖和蛋白质相互作用并参与到细胞的粘附中。粘附作用是病原菌侵染宿主的关键步骤,粘附因子可被宿主识别而引起宿主的初级免疫反应PTI(PAMP-triggered immunity)反应。利用农杆菌在烟草叶片上瞬时表达PXO_01697发现其可以在引起非宿主植物烟草上引起PTI反应。因此,我们认为PXO_01697通过F5/8 type C结构域特异性的识别并结合宿主细胞壁或细胞外基质的碳水化合物,并通过a-L-岩藻糖苷酶对其进行降解促进Xoo的感染。
参考文献：
[1]. 水稻黄单胞菌水稻致病变种与致病相关的新基因的功能鉴定[D]. 梁莹. 广西大学. 2004
[2]. 水稻黄单胞菌遗传操作体系的建立及hrp基因和avrBs3/pthA家族基因的功能研究[D]. 邹丽芳. 南京农业大学. 2007
[3]. 水稻黄单胞菌效应物转运系统的检测与新的效应物的鉴定[D]. 唐唯. 广西大学. 2007
[4]. 水稻黄单胞菌clp基因的克隆及功能研究[D]. 韩志成. 南京农业大学. 2010
[5]. 水稻黄单胞菌水稻致病变种的xrvA基因的功能鉴定[D]. 王超. 广西大学. 2006
[6]. 水稻黄单胞菌gacA、ppsA和zur基因的克隆及功能分析[D]. 杨万风. 南京农业大学. 2006
[7]. 水稻条斑病菌hrcQ基因的功能以及hrpG在稻黄单胞菌两个致病变种中的互置性[D]. 张鼎鼎. 南京农业大学. 2010
[8]. 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病相关基因的鉴定及分析[D]. 韦珂. 浙江大学. 2005
[9]. 水稻黄单胞菌Hpa1与AvrBs2蛋白调控植物生长与抗病性的研究[D]. 李小杰. 南京农业大学. 2013
[10]. 水稻黄单胞菌PXO99~A抗低氧压力研究以及叁型效应蛋白的发掘[D]. 王建良. 华中农业大学. 2017