于金凤[1]2003年在《中国冬小麦主产区及云南丝核菌属真菌的遗传多样性研究》文中研究表明丝核菌属（Rhizoctonia DC）真菌属半知菌门的丝孢纲（Hyphomycetes），无孢目（Agonomycetales），有性阶段为Ceratobasidium、Thanatephorus等担子菌的属，甚至与子囊菌（Ascorhizoctonia）有关。其遗传分化与遗传多样性非常丰富，在无性阶段、有性阶段、在致病力及形态特征等方面都存在较大差异。通常以菌丝和菌核的形态习居于土壤，能引起多种植物病害，因此丝核菌属真菌的研究受到国内外许多学者的关注。丝核菌属真菌特殊的形态特征使其种间的区分和鉴定相当困难，70年代提出的菌丝融合群分类法是当前对该属真菌最成功的分类手段，但它不能提供融合群间或亚群间及融合群内或亚群内更多的遗传分化及系统演化信息。分子生物学手段是检测包含丝核菌在内的真菌群体遗传变异规律的极其有用的工具。本研究（1）利用RAPD DNA分子标记手段及rDNA-ITS序列分析方法对中国冬小麦主产区小麦纹枯病菌的遗传分化问题进行了探讨；（2）利用RAPD DNA分子标记手段对采集自云南不同生态区域，分属不同融合群的菌株的遗传多样性进行了检测；（3）利用RAPD DNA分子标记手段及rDNA-ITS序列分析方法对发生在玉米、水稻两种不同寄主上的AG1-IA群内菌株的遗传分化状况进行了探讨。弄清了所研究的丝核菌属真菌的遗传分化与菌株本身的致病力分化、寄主以及生态环境条件间的关系，为将来利用基因工程等分子手段来控制该类群真菌的发生及危害奠定了重要的理论基础。主要研究结果如下：1. 将采自山东境内的55个小麦纹枯病菌菌株，按地区筛选出37个菌株进行苗期致病性的测定。根据不同菌株在叁个测试的小麦品种上平均病情指数的大小，即致病力的大小利用UPGMA法将将供试的37个菌株分为强致病组（包含4个菌株）、较强致病组（7个菌株）、中等致病组（18个菌株）和弱致病组（8个菌株）四种类型，表明山东小麦纹枯病菌的致病力存在明显的分化。2. 利用RAPD DNA分子标记手段对已进行了致病性测定的36个菌株的遗传多样性进行了研究。选用15个随机引物对供试菌株进行RAPD 扩增，共获得171个RAPD标记，其中多态性标记161个，占94.15%。利用UPGMA法构建的分子系统树可以看出：遗传距离0.33，可将受试菌株分为4个RAPD组，WK-6、WK-37和WK-13都是单菌株群，其余33个菌株构成一组，它们都属于AG-D成员，进一步的分析发现：遗传距离0.25，可将33个AG-D群菌株再分为7个RAPD组。说明受试的小麦纹枯病菌株间存在丰富的遗传多样性。且供试分离物的RAPD分组与菌株致病力的大小无明显的相关性。将采自河北、安徽、河南、陕西、江苏、山东等中国冬小麦主产省份的37小麦纹枯病菌代表性菌株进行RAPD分析结果表明：遗传距离为0.3时，受试的37个菌株<WP=12>3. 被分为3个RAPD 组，其中最大组的菌株均为AG-D融合群的成员，另外两个组分别包括两个和一个菌株，由于它们和和标准菌株AG-D的遗传距离比较远，其归属有待于进一步鉴定。对属于AG-D的成员进一步分析发现，来自不同省份的小麦纹枯菌株的大多数都具区域相似性，来自河南、山东、河北、安徽及江苏的菌株关系更加密切，与来自陕西的菌株之间存在明显的遗传分化。说明小麦纹枯病AG-D融合群菌株的遗传分化与大区域的生态环境条件存在较密切的相关性。4. 在对小麦纹枯病菌菌株进行RAPD 分析的基础上，从供试的72个菌株中有目的地选取21个菌株，对其5.8S rDNA-ITS区序列进行分析比较，并构建23个菌株分子系统发育树，由序列比较结果及所构建的分子系统发育树可以看出：引致小麦纹枯病的双核丝核菌其5.8S rDNA-ITS区序列的相似度在52.1%-99.8%的范围内，受试菌株被明显地分为3个不同的组。其中较大的组是AG-D（或CAG-1）群的成员，其5.8S rDNA及ITS1、ITS2区的核苷酸序列之间的相似度很高，相似度为97%-99.8%之间，不同菌株其ITS区序列共有26个位点发生了缺失、插入、突变等变异。根据其变异情况，以支持率大于500的分组作为有效分组判断指标，18个菌株又被分为5个聚类组。说明被测菌株的遗传多样性也能通过rDNA-ITS区的序列分析结果表现出来。但AG-D群不同菌株的分组尚未达到将其划分为不同亚群的水平。另外两个组分别各由3个菌株组成，与AG-D群菌株的相似系数为52.1%-54.2%。初步推断它们应是区别于AG-D群的另外融合群或亚群的菌株。5. 利用12个随机引物对来自云南省不同地理环境的立枯丝核菌第一融合群的13个菌株进行遗传分化关系研究。结果表明：受试菌株被标记的DNA谱带多态性检测率为100%，受试的不同菌株间几乎无同质的DNA谱带，利用UPGMA法构建分子系统树分析发现，遗传距离0.5将其划分为9个RAPD组，遗传距离0.95将其划分为3个RAPD组，表明受试的AG1-IA融合群的13个菌株具有明显的遗传分化。6. 利用RAPD分子标记手段对来自云南省不同地理环境的第四融合群和第六融合群的14个菌株进行遗传多样性分析，12个引物对供试的14个菌株共标记产生164条特异性的DNA谱带，多态性检测率为100%。UPGMA法构建的分子系统树分析发现：遗传距离0.41将供试的14个菌株分为两个RAPD组，第一组由属于AG-4 群的8个菌株构成，第二组由属于AG-6群的6个菌株构成。进一步的分析还发现，AG-4群的菌株
周瑜[2]2016年在《糜子丝黑穗病菌遗传多样性及综合防控技术研究》文中研究说明糜子生育期短、抗旱、耐瘠、营养丰富,是干旱半干旱地区重要的粮食作物和经济作物。丝黑穗病是糜子生产上的主要病害,是制约糜子产量和品质的重要因素。因此,分析病原菌遗传多样性水平和毒力分化程度,研究糜子丝黑穗病抗性生理机制,筛选高效防治药剂,明确适宜栽培措施,对抗病品种选育及病害绿色防控具有十分重要的意义。由于糜子属区域性作物,目前国内外关于糜子及糜子丝黑穗病的相关研究鲜有报道,本试验利用RAPD和SSR分子标记技术对来自我国糜子主产区的病原菌进行遗传多样性分析,鉴定糜子种质资源和育成品种丝黑穗病抗性水平,筛选鉴别寄主并对病原菌进行毒力分析,比较分析糜子不同生育时期感染丝黑穗病后叶片抗氧化酶系、抗病相关酶活性,蛋白质、糖含量,及同工酶谱带的变化和差异,通过室内毒力测定和田间药效试验,筛选防治糜子丝黑穗病高效杀菌剂,并且研究不同播期对抗、感品种丝黑穗病发病及产量的影响。主要研究结论如下:(1)田间调查结果显示,糜子丝黑穗病为害的穗部症状主要表现为黑粉包状、簇叶状、刺猬头和黑粉粒4种类型。糜子丝黑穗病菌冬孢子在光学显微镜下,呈褐色,球形,扫描电子显微镜下可见壁表具微小突起。冬孢子形态特征和ITS序列比对结果表明,本试验所用菌株为Sporisorium destruens。冬孢子萌发的最适温度为25℃,最适pH为5,甲醛处理促进萌发。丝黑穗病菌最适碳源和氮源为葡萄糖和KNO3,25℃比较适合此病菌生长和产孢,pH为7时生长最快、产孢量最大,在Czapek和PDA培养基上生长较好。(2)来自我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、陕西和甘肃的糜子丝黑穗病菌(S.destruens)遗传变异程度不高,遗传背景比较单一。选出的28条RAPD引物和40对SSR引物分别扩增出381和119条谱带,其中多态性谱带373和109条,多态率分别为97.90%和91.60%。RAPD的多态性水平及检测效率高于SSR。两种标记的聚类结果有差异。将两种标记的数据结合进行聚类,结果显示,在遗传相似系数为0.7425时,51个菌株可以分为3个系谱群。菌株的遗传多态性和地理分布及寄主品种之间没有明显的相关性。(3)连续3年丝黑穗病抗性鉴定结果显示,261份种质资源的抗性差异明显,抗病种质所占比重较大,其中12MD-2和12MD-250连续3年均表现免疫;66份育成品种中,来自俄罗斯的品种blest jachee和orlovski karlik表现高抗,而我国的品种均未表现出稳定抗性。参试糜子种质资源中,3份具有高抗、矮秆、早熟和高产等优良性状,可直接用于实际生产。我国S.destruens存在毒力分化现象,根据各鉴别寄主对各菌株的抗性等级,可将16个菌株分为3个致病类型。(4)糜子接种S.destruens后,SOD活性升高,叁叶期抗病品种的升高幅度显着大于感病品种,且抗病品种的SOD活性显着高于感病品种;抗病品种POD活性持续升高,而感病品种POD活性在后期下降;抗病品种MDA含量低于感病品种。糜子受S.destruens侵染后,抽穗期和灌浆期APX活性与抗性呈负相关;GR活性与抗性成反比;抗病品种AsA含量迅速升高并维持在较高水平,而感病品种升高较慢且后期下降幅度较大;抗、感品种GSH含量在叁叶期和拔节期升高,在抽穗期和灌浆期下降。在S.destruens诱导下,抗病品种PAL活性升高幅度在叁叶期、拔节期和灌浆期均高于感病品种,叁叶期和拔节期抗病品种几丁质酶活性显着高于感病品种,β-1,3-葡聚糖酶活性在抽穗期与抗性呈正相关。接种后,可溶性蛋白含量与发病率无显着相关性;在叁叶期和灌浆期可溶性总糖含量与抗性呈负相关;而还原糖含量在叁叶期和拔节期接种后与抗性呈负相关。丝黑穗病菌侵染能引起不同抗病类型糜子品种POD、EST、SOD和PPO同工酶谱的变化,抗病品种谱带增加数大于感病品种。综上,在糜子抗病育种和生产实践中,SOD、POD、APX、GR、PAL、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,MDA、AsA、GSH、可溶性总糖及还原糖含量,POD、EST和SOD同工酶均可作为鉴别糜子丝黑穗病抗性的辅助指标。(5)通过对戊唑醇、甲基硫菌灵、烯唑醇、多菌灵、苯醚甲环唑和福美双6种药剂的室内毒力测定和两年田间药效试验,结果发现,戊唑醇对冬孢子萌发的抑制作用最强,福美双最弱;烯唑醇对种子萌发抑制作用最大;戊唑醇田间防效最好,其次为烯唑醇、甲基硫菌灵、多菌灵,福美双防治效果最差。多菌灵显着降低主茎倒二叶面积、主茎倒叁叶面积、叶干重和分蘖数,各药剂处理下的单株粒重均有不同程度的减少,但产量均增加,其中戊唑醇处理下的产量两年均最高。戊唑醇能以较低浓度获得较好的防治效果,建议在实际生产中推广利用。(6)不同糜子品种对播期的响应不同,但除05在5个播期均不发病外,其他品种均在播期Ⅰ发病率最高,其他播期无显着差异。抗病品种巴盟小黑糜和05在播期Ⅲ产量最高,因此6月15日左右可作为这两个品种的适宜播期;感病品种杂黍和黄硬糜在播期Ⅱ产量最高,因此可将6月1日作为这两个品种的适宜播期。发病率和5 cm土层温度呈显着负相关,低温有利于丝黑穗病的发生;发病率与20 cm土层水分含量无显着相关性。
赵蕾[3]2003年在《小麦纹枯病菌产生的一种胞外蛋白酶及其致病机理的研究》文中指出小麦纹枯病是我国小麦的主要病害之一，近年来发病面积广，为害严重。为了深入阐明病害的发生机理，进一步揭示细胞壁降解酶在植物－病原互作中的作用，从而为病害的防治提供新的理论依据及防治手段，本文针对病原菌致病因子研究中的薄弱环节，对小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven）产生的胞外蛋白酶及其致病机理进行了研究，具体结果如下：1. 从山东省各地采集到的小麦纹枯病病株上分离到19株小麦纹枯病菌分离系（isolates）。经Giemsa染色鉴定，细胞为双核，菌丝分枝接近直角，符合纹枯菌（Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven）的特点。2. X光片结果显示，小麦纹枯病菌（R. cerealis）在以小麦细胞壁为唯一碳氮源的诱导培养基中可产生多种蛋白酶。最佳产酶时间为48h。培养液经硫酸铵沉淀、SP-Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、Sephadex G-75分子筛层析分离纯化到一种蛋白酶（RCP1）。经SDS-PAGE电泳银染后呈单带，分子量约为40 kD。3. 用azocasein为底物测定了温度和pH对蛋白酶RCP1活性的影响。结果表明：RCP1的最适温度为37℃，最适pH值为8.0。在热稳定性方面，25℃以下保温60min后仍保持原有酶活力的90％。35℃以上酶失活速度加快，60min后酶活下降了55％，45℃以上处理60min酶活力基本丧失。在pH稳定性方面，以不同pH值，4℃处理1h显示，RCP1在pH6～10的范围内具有很高的稳定性，酶活力基本保持不变。金属离子Na+、Zn2+对酶活无影响，Mn2+、Mg2+对酶活有部分抑制作用，Cu2+、Fe2+、Pb2+对酶活有强烈的抑制作用，Ca2+在低浓度下对酶活有激活作用。4.为进一步鉴定蛋白酶RCP1的性质，本研究进行了专一性底物和抑制剂特性试验。底物专一性测定显示，RCP1能水解胰蛋白酶专一性底物Benz-Phe-Val-Arg-NA，对D-Val-Leu-Arg-NA、Benz-Pro-Phe-Arg-NA和D-Val-Phe-Lys-NA也有活性，说明RCP1能降解Arg和Lys形成的酰胺键和肽键，具有类胰蛋白酶活性。RCP1对凝乳弹性蛋白酶底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-NA和枯草杆菌蛋白酶底物CBZ-Gly-Gly-Leu-NA无活性。抑制剂结果显示，RCP1能被胰蛋白酶抑制剂aprotinin 、leupeptin和soybean trypsin inhibitor强烈抑制，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能部分抑制酶的活性，表明其活性中心有Ser残基，半胱氨酸蛋白酶抑制剂iodoacetamide和天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatin<WP=9>对酶活无影响。以上结果表明，RCP1是丝氨酸蛋白酶中的一种类胰蛋白酶。5. 在RCP1致病机理的研究方面，本研究用提取的小麦细胞壁作为底物，分别测定了酶作用后底物中的蛋白含量及产物中羟脯氨酸含量的变化。结果表明，酶作用后底物中的蛋白含量比对照减少了34.58％。产物中的羟脯氨酸含量明显增高，释放出的羟脯氨酸量是同时加入类胰蛋白酶抑制剂aprotinin处理的3.5倍，说明蛋白酶RCP1能够降解寄主小麦细胞壁。6.为直接观察类胰蛋白酶RCP1对活体小麦组织超微结构的影响，本研究采用了将纯化的RCP1蛋白酶液注入到活体小麦叶片，25℃保温24h后进行电镜观察的新方法，与以往用酶液浸泡植物离体组织的方法相比，方法更为科学，既能保证酶液进入植物组织，又能保证电镜制片时的活体要求，所示结果更为可靠，为今后同类研究积累了经验。得到的植物病原真菌产生的蛋白酶对植物细胞壁及膜系统超微结构影响的电镜照片显示，处理的小麦组织细胞发生了一系列的病理变化，包括细胞壁部分消解、质膜、叶绿体膜被破坏等，说明病原菌在侵染过程中，RCP1参与了寄主细胞壁的降解。7.用测定蛋白酶总酶活的底物azocasein和类胰蛋白酶的特异性底物Benz-Phe-Val-Arg-NA分别对受病菌侵染小麦和健康小麦体内的蛋白酶活性进行了检测。结果表明，受侵染小麦体内的蛋白酶活性在一定时期内随着发病症状的加重而增加。接菌后22天时，受侵染小麦体内的总蛋白酶活是对照的6倍，类胰蛋白酶活为对照的2倍，类胰蛋白酶抑制剂aprotinin 可抑制受侵染小麦体内类胰蛋白酶的活性，说明病原菌（R. cerealis）在小麦体内除了产生类胰蛋白酶RCP1外，也产生其它蛋白酶。8.为了从分子水平上证明小麦纹枯病菌产生的类胰蛋白酶基因在植物中的表达，选用4个植物病原真菌中类胰蛋白酶的N末端最保守的一段序列作为上游引物，类胰蛋白酶的活性部位序列作为下游引物，通过RT－PCR扩增，从受侵染的小麦组织中扩增出了一条片段，而在健康植物中没有此片段，说明受侵染植物中增加的类胰蛋白酶活性来源于病原真菌，健康植物中的类胰蛋白酶与病原真菌产生的类胰蛋白酶不同。
参考文献：
[1]. 中国冬小麦主产区及云南丝核菌属真菌的遗传多样性研究[D]. 于金凤. 山东农业大学. 2003
[2]. 糜子丝黑穗病菌遗传多样性及综合防控技术研究[D]. 周瑜. 西北农林科技大学. 2016
[3]. 小麦纹枯病菌产生的一种胞外蛋白酶及其致病机理的研究[D]. 赵蕾. 山东农业大学. 2003