(浙江省平湖市中医院 浙江平湖 314200)
【摘要】目的：本文主要研究鸦胆子油乳（Fructus bruceae emulsion，FBE）对多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）细胞的毒性作用，并探讨其诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的机制。方法：CCK8法检测鸦胆子油乳对多发性骨髓瘤细胞的抑制率，流式细胞术检测鸦胆子油乳对多发性骨髓瘤细胞的凋亡和ROS生成的影响，最后通过CCK8观察N-乙酰半胱氨酸对多发性骨髓瘤细胞活力的恢复。结果：CCK8结果显示鸦胆子油可显著降低多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞的活力，并且呈现剂量和时间依赖关系。在12小时其半数抑制率（IC50浓度）为382μg/ml，24小时其IC50浓度为296μg/ml，48小时其IC50浓度为198μg/ml。流式细胞术检测发现鸦胆子油乳能够增加多发性骨髓瘤细胞ROS的生成，并诱导其凋亡。最后用ROS清除剂预处理RPMI-8226细胞发现可以有效的恢复鸦胆子油乳诱导的细胞死亡。结论：鸦胆子油乳在体外可以有效的激活ROS生成，诱导多发性骨髓瘤细胞氧化应激损伤，从而激活细胞凋亡。
【关键词】多发性骨髓瘤；鸦胆子油；凋亡；氧化应激
【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）18-0048-03
鸦胆子是苦木科，鸦胆子属，其种子是中药中重要的抗肿瘤药物，目前鸦胆子油乳是已经上市的抗肿瘤药物。鸦胆子油的主要成分为不饱和脂肪酸，与肿瘤细胞有特异性的亲和力，可直接进入肿瘤细胞并破坏其质膜系统和线粒体，使肿瘤细胞凋亡[1]。目前鸦胆子油主要运用在消化道肿瘤、肺癌、宫颈癌中[2,3]，而在多发性骨髓瘤中运用的研究较少，为探讨鸦胆子油乳对人多发性骨髓瘤细胞的作用及机制，我们选取了人多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226为研究对象，观察鸦胆子油乳对RPMI-8226细胞生物学特性的影响，初步探讨其分子机制，旨在为鸦胆子油乳在多发性骨髓瘤治疗方面的临床应用提供实验依据。
1.方法
1.1 细胞系
人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞株由中国科学院上海细胞库引入。培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，置于5％ CO2培养箱中常规培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。
1.2 主要药物与试剂
鸦胆子油乳购自浙江九旭制药有限公司，RPMI-1640、胎牛血清、青霉素-链霉素购自GIBCO公司，DCFH-DA、N-乙酰半胱氨酸（NAC）购自Sigma公司，CCK8、磷酸盐缓冲液购自碧云天公司。
1.3 细胞活性
将对数生长期的RPMI-8226细胞离心收获，将密度调整为300000/ml，接种100ul细胞悬液于96孔板中，每组3个复孔，鸦胆子油终浓度分别为：0，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml。置于37℃二氧化碳培养箱中分别培养12小时、24小时、48小时，加入10μl CCK8试剂，37度反应2小时，450nm处检测吸光度，并计算抑制率。
1.4 流式细胞术
细胞凋亡采用碧云天Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒，细胞采用浓度梯度的鸦胆子油乳处理后，离心收集细胞，弃上清，PBS轻轻重悬并计数。取20万重悬的细胞加入195μl结合液重悬细胞，加入5μl Annexin V-APC/PI室温避光孵育15分钟，进行流式细胞仪检测。
1.5统计学分析
统计分析采用SPSS19.0分析软件，均以P＜0.05认为有统计学差异。
2.结果
2.1 鸦胆子油乳抑制RPMI-8226细胞增殖
随着鸦胆子油乳加入浓度的升高，RPMI-8226细胞活力受到明显的抑制，在12小时其半数抑制率（IC50浓度）为382μg/ml，24小时其IC50浓度为296μg/ml，48小时其IC50浓度为198μg/ml。在48小时500μg/ml的鸦胆子油乳几乎完全抑制了RPMI-8226细胞的活力。因此，鸦胆子油乳对
图2 鸦胆子油乳诱导RPMI-8226细胞氧自由基的生成
2.3 鸦胆子油乳促进RPMI-8226细胞凋亡
由于鸦胆子油乳显著抑制多发性骨髓瘤细胞活力，激活氧自由基生成。因此，我们下一步检测其对RPMI-8226细胞凋亡的影响，经前述方法处理RPMI-8226细胞后，用Annexin V-APC/PI试剂盒检测细胞凋亡发现，随着FBE的加入，RPMI-8226凋亡细胞比例逐渐升高，并且呈现剂量依赖关系。具有统计学差异，P＜0.05。具体数据如图3。
3.讨论
鸦胆子源于苦木科植物，它的成熟果实鸦胆子味极苦、性寒、有微毒，是一味中药。我国古代广泛用于治疗阿米巴痢疾，1972年报道治疗宫颈癌取得成功以来，经过几十年的基础和临床研究，对其抗实体瘤的作用机制有了一定认识[4，5]。目前研究表明，鸦胆子油的成分中主要包括脂类、糖甙、苦木内酯、鸦胆子酸、鸦胆子酚等，其中主要的抗肿瘤活性成分是鸦胆因D、鸦胆苦醇、鸦胆子甙A等[6]。
目前的研究发现鸦胆子油乳可以显著抑制肺癌[7]、肝癌[8]、宫颈癌[9]、卵巢癌[10]细胞株的活力，同时还能逆转肿瘤细胞耐药，抑制肺癌中血管生成[11]，增加脑胶质瘤放疗敏感性[12]等功效。在血液病中，王芳[13]等研究发现鸦胆子油乳可以诱导急性髓系白血病细胞HL-60凋亡。胡美微[14]等发现鸦胆子油乳可以抑制多耐药K562细胞株的增殖，季春莲等[15]发现鸦胆子油乳可以逆转K562细胞对阿霉素耐药。但是目前尚无鸦胆子油乳对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡等生物学影响的研究。
多发性骨髓瘤是一种起源于B细胞系的恶性肿瘤，其主要特征是能产生单克隆免疫球蛋白，并造成异常浆细胞在骨髓内恶性增殖，从而导致骨髓功能衰竭。如果不进行治疗，进展期多发性骨髓瘤患者的中位生存期仅为6个月，接受传统化疗，中位生存期也不超过3年[16]。多发性骨髓瘤发生发展不仅是异常浆细胞恶性增殖的结果，同时也与凋亡异常相关。细胞凋亡是正常细胞程序性坏死的一种基本生物学行为，表现为细胞萎缩，通透性改变，细胞核染色质凝集，核碎裂，凋亡小体形成。而肿瘤细胞中常常表现出对凋亡的抵抗，因此诱导肿瘤细胞凋亡是近年肿瘤治疗研究的一个重要靶点。
通过我们的研究，发现鸦胆子油乳在体外对RPMI-8226细胞增殖有显著的抑制作用，其抑制率与药物浓度和作用时间呈正相关。在12、24、48小时，其半数抑制率分别为382μg/ml，296μg/ml，198μg/ml。流式细胞术检测发现鸦胆子油乳可以强烈的激活多发性骨髓瘤细胞株中氧自由基的生成，生成量与加入的鸦胆子油乳浓度呈正相关。同时通过流式细胞术检测发现，FBE也能激活多发性骨髓瘤细胞发生凋亡，那么FBE诱导的凋亡是否与ROS的生成相关呢？我们通过在培养基中添加ROS清除剂NAC，结果发现单独的NAC对细胞活力并无影响，但是NAC联合FBE后可以有效的恢复细胞活力，因此证明FBE会上调细胞内ROS水平，导致细胞氧化应激损伤，进而激活细胞发生凋亡。
但因鸦胆子油乳中有效成分复杂，其中含有多种抗肿瘤活性成分，并且某一活性成分还可能具有多种不同的抗肿瘤机制，所以具体机制不易完全阐明。更多的工作需要进一步跟进。
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论文作者:周建芳
论文发表刊物:《心理医生》2018年18期
论文发表时间:2018/7/19
标签：鸦胆子论文; 细胞论文; 凋亡论文; 抑制论文; 多发性骨髓瘤论文; 细胞株论文; 浓度论文; 《心理医生》2018年18期论文;