杨亚培1,2#* 徐慧3 董秋立4（1 山东大学附属省立医院心内科 250021；2 聊城市人民医院中心实验室 252000；3 山东省警官总医院心内科；4 河北省任丘市华北石油管理局总医院心内科）
【摘要】肾素- 血管紧张素系统(RAS) 由一系列酶、激素及其受体组成，在动脉粥样硬化（AS）发生发展过程中起重要作用。肾素（Renin）可特异性催化血管紧张素原转化为血管紧张素I，后者再转化为血管紧张素II（AII），从而激活RAS。RAS 的激活可导致血管内皮功能减退，炎症反应加剧，AS 斑块不稳定，促进AS 病变的演进发展。Renin 作为AII 上游的RAS 成员，在心脑血管遗传学研究中越来越受到重视，因此本实验在前期构建了人Renin 基因腺相关病毒表达载体的基础上，通过体外细胞实验，进一步探究Renin 基因高表达对AS 中RAS 系统及相关炎症因子表达的影响，为AS 的治疗提供新的靶标和思路。
【关键词】动脉粥样硬化（AS）；肾素- 血管紧张素系统(RAS)；肾素（Renin）；单核细胞趋化因子（MCP）-1【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165（2015）09-0482-02
1 材料与方法1.1 材料辣根过氧化物酶标记二抗系武汉博士德生物公司产品；β-actin 单克隆抗体系美国Santa Cruz 公司产品；预染蛋白marker购于晶美生物有限公司。兔抗人VIII 因子单克隆抗体、免疫荧光组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法1.2.1 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的原代培养及免疫荧光法鉴定HUVECs，经传代并鉴定后的HUVECs，取生长良好的3-8代用于实验。
1.2.2 细胞转染实验⑴ HUVECs 用ECM 全培养基（含5% 胎牛血清+1% 内皮细胞生长因子+ 青霉素100U/ml+ 链霉素100mg/ml）传代培养。按3×105/ 孔的密度于转染前一天接种于6 孔板，用不含抗生素的ECM 培养基（含5% 胎牛血清+1% 内皮细胞生长因子）继续培养至90-95% 融合时进行转染。设PBS 空白对照组、rAAV2-RFP 空载体转染组和重组rAAV2-Ren-RFP 转染组三组。
⑵ ECM 基础培养基将细胞洗两遍后， 按MOI 值(v.g./cell)5×105 计算加入rAAV2-Ren-RFP 或rAAV2-RFP 的病毒体积数，于Ep 管中将需加入的rAAV2-Ren-RFP 或rAAV2-RFP 与ECM 基础培养基混合。
⑶ 将上述rAAV2-Ren-RFP 或rAAV2-RFP 与ECM 基础培养基混合液分别加入每孔细胞中，每孔细胞加200ul，双孔复孔。
置于培养箱中培养，1h 后吸弃每孔液体，加入1ml/ 孔含5%FBS 和1%内皮细胞生长因子的ECM 培养基，同时加入10-50mmol/l 的丁酸钠以增强其表达。
⑷ 分别于病毒感染24、48 及72h，于荧光显微镜下观察荧光强度，选定荧光强度强且细胞状态良好的条件进行后续实验。
⑸ 依上述最佳条件收获细胞，Western blot 检测细胞中Renin和炎症相关蛋白表达情况1.3 统计学分析实验数据以均数± 标准差（x±s）表示，采用SPSS20.0 软件进行配对t 检验统计学分析，P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果2.1 HUVECs 的培养及鉴定倒置相差显微镜下连续观察，原代培养HUVECs 于4h 后出现贴壁生长，形态开始时呈圆形，之后逐渐呈梭形或多角形生长，细胞边界清晰，胞浆丰富，核内染色质清亮稀疏，可见1-2 个核仁。细胞单层生长，镜下呈典型“铺路石”样特征（图1）。
经VIII 因子相关抗原特异性单克隆抗体的免疫荧光染色法，检测HUVECsVIII 因子抗原为阳性。
2.2 转染最适条件的确定由于构建的重组rAAV2-Ren-RFP 带有RFP 标签，以此为依据分别于病毒转染24h、48h 和72h 在荧光显微镜下监测显示，转染HUVECs48h 后荧光亮度最强（图2）。
3 讨论AS 是由多种致病因素共同作用于血管壁而引起的慢性炎症性疾病，是冠心病和脑梗死共同的病理基础，血脂代谢异常、内皮细胞损伤以及炎症等均是AS 发生发展的重要因素，其中炎症在AS 发生演进中占有重要地位[1,2]。AS 不稳定性斑块的形成与脂质代谢障碍、血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞异常增殖、巨噬细胞内皮下浸润等多种因素有关。血管内皮细胞损伤和功能减退是AS 发生、发展的关键步骤之一[3]。血管内皮细胞损伤后可表达ICAM-1、PAI-1 等活性物质。粘附分子能介导淋巴细胞和单核细胞与内皮细胞的粘附，并介导它们穿过内皮细胞进入血管壁，促进AS 的形成。血管内皮细胞功能减退，可能诱导单核细胞和淋巴细胞等白细胞向血管炎症部位游走、粘附、聚集并穿越血管壁，促进AS 的形成和发展[4-6]。
Renin 是Renin 原在激活酶催化作用下生成的一种天冬氨酰基蛋白酶，可特异性催化血管紧张素原转化为血管紧张素I，后者再转化为血管紧张素II，从而激活RAS。这是RAS 级联反应中的限速步骤[7-8]。血管紧张素II（AngII）是RAS 重要的末端活性产物，通过作用于AT1 和AT2 而发挥其生物学效应。近几年随着研究的深入，发现Renin 和其前体Renin 原，通过与Renin 原受体（RnR）结合，借由两种途径发挥生物学作用，一种是依赖血管紧张素途径，即催化血管紧张素原转化为AngI，进而在心血管系统中发挥重要作用；另一种是非血管紧张素途径，即通过不生成Ang 的方式直接激活细胞内信号通路产生生物学作用[9]。Renin 原是Renin 的前体，呈低活性，在内肽酶作用下，Renin 原被降解为Renin。研究表明2nmol/L 的人Renin 原在体外实验中能促进平滑肌细胞的增殖，10nmol/L 的Renin 能促进Renin 受体的磷酸化。本实验在前期构建了Renin 基因腺相关病毒的表达载体基础上，在细胞实验中观察了Renin 过表达对AS 斑块及相关炎症因子的影响，本研究初步探讨了Renin 在AS 发生发展过程中的作用，为AS 的研究提供新的理论依据和技术策略。研究发现Renin 基因高表达能促进AS 的发生发展。Renin 高表达，通过激活RAS 使血管紧张素I、血管紧张素II 生成增多，而血管紧张素原生成减少，进而使血管炎症因子、粘附分子的基因和蛋白表达增加，进一步加重了内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖等的炎症反应；血管紧张素II 表达上调促进了氧化应激，使氧自由基生成增加，后者在一定程度上又促使AS 斑块不稳定性增加，加剧了AS 的病变程度。
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论文作者:杨亚培1,2#* 徐慧3 董秋立
论文发表刊物:《医师在线》2015年5月第9期供稿
论文发表时间:2015/7/7
标签：血管论文; 细胞论文; 内皮论文; 转染论文; 紧张论文; 炎症论文; 培养基论文; 《医师在线》2015年5月第9期供稿论文;