凌云峰[1]2001年在《转化生长因子β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体在肝细胞癌中的表达》文中指出目的：探讨TGFβ1、TGFβRⅠ和TGFβRⅡ在肝细胞癌（HCC）发生发展过程中的作用及其与HBV感染的关系。 方法：运用免疫组织化学SABC法对36例HCC和42例HCC癌旁肝组织的转化生长因子β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体、乙肝病毒表面抗原表达情况进行研究。 结果：TGFβ1在36例肝癌组织和42例癌旁肝组织的阳性率分别为69.4％、81.0％，两者差异无显着性（P＞0.05），半定量分析TGFβ1在肝癌组织表达阳性面积百分比为17.23±11.78％，癌旁肝组织为38.47±15.34％，差异有显着性意义（P＜0.05）。TGFβRⅠ在HCC、癌旁肝组织的阳性率分别为41.7％，73.8％，差别有非常显着性意义（P＜0.01）。TGFβRⅡ在肝细胞癌、癌旁肝组织阳性率分别为47.2％、85.7％，差别有非常显着性意义（P＜0.01）。在癌旁肝组织中HBsAg阳性率为78.5％。在36例HCC中，TGFβ1阳性面积百分比在HBsAg阳性组为19.83±12.34％，而在HBsAg阴性组为8.98±3.34％，两者有显着性差异（P＜0.05）。在42例癌旁肝组织中，TGFβ1阳性面积百分比在HBsAg阳性组为43.89±13.07％而在HBsAg阴性组为23.44±10.60％，两者有非常显着性差异（P＜0.01）。在HBsAg阳性组中，36例HCC阳性表达TGFβ R Ⅱ的有6例，阴性表达TGFβ R Ⅱ的有17 例，而在 HBSAg阴性组中，HCC阳性表达 TGF fi R 11的有 9例，阴 性表达 TGF fi R 11的有 4例。 结论：肝癌细胞和癌旁肝细胞中均高度表达TGF pl，两者阳性 率无差异，但阳性面积百分比后者显着高于前者，提示TGF pl表达 降低可能与肝细胞的恶性转化和生长失控有关。TGF pl通过自分泌 和旁分泌形式调节肝癌细胞生长，其过度表达而不能抑制癌细胞的恶 性增殖，可能与肝癌细胞中 TGF 5 R 11及 TGF fi RI表达降低有关。 本地区乙肝病毒感染是肝细胞癌发生的重要相关因素，HBV感染与 肝癌细胞中 TGF PI高度表达及 TGF i R 11表达降低有关。
凌云峰, 冯震博, 何如昆, 吕自力[2]2005年在《转化生长因子β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体在肝细胞癌中的表达》文中进行了进一步梳理运用免疫组化方法对 36例HCC和 4 2例癌旁肝组织的TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体表达情况进行研究。TGFβ1在 36例肝癌组织和 4 2例癌旁肝组织的阳性率分别为 6 9 4 %、81% ,两者差异无显着性 (P >0 0 5 ) ,半定量分析TGFβ1在肝癌组织表达阳性面积百分比为 (17 2 3± 11 78) % ,癌旁肝组织为 (38 4 7± 15 34) % ,差异有显着性意义 (P <0 0 5 )。TGFβRⅠ在HCC、癌旁肝组织的阳性率分别为 4 1 7%、73 8% ,TGFβRⅡ在HCC、癌旁肝组织阳性率分别为 4 7 2 %、85 7% ,差异均有非常显着性意义 (P <0 0 1)。肝癌细胞和癌旁肝细胞中均高度表达TGFβ1,两者阳性率无差异 ,但阳性面积百分比后者显着高于前者 ,提示TGFβ1表达降低可能与肝细胞的恶性转化和生长失控有关。TGFβ1过度表达而不能抑制癌细胞的恶性增殖 ,可能与肝癌细胞中TGFβRⅠ和TGFβRⅡ表达降低有关
王海全[3]2016年在《转化生长因子β1通过Wnt/β-catenin信号通路诱导人肝癌细胞SMMC-7721上皮间质转化的实验研究》文中研究指明肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是目前我国临床上较为常见的恶性肿瘤,位于常见肿瘤的第六位及肿瘤相关性死亡原因的第叁位,且近年来呈现逐渐上升的趋势。虽然随着科学技术的不断发展和外科手术技术的不断提高,目前大部分早期确诊的肝癌患者都能够实行根治性切除,但是肝癌患者的5年总体生存率仍然很低。其中最重要的因素是肝癌具有极强的侵袭和转移能力,术后5年内极易出现肿瘤复发及远处转移,很多患者在术后1-2年就会出现肝内或肝外复发、转移。所以,如何有效的控制肝癌术后复发转移是我们治疗肝癌的临床难题。肿瘤微环境包括肿瘤细胞或者间质细胞分泌的多种细胞因子、趋化因子和生长因子,它们共同组成了肿瘤细胞在体内生长、增殖、甚至是转移相关所必须的体内微环境,在肿瘤发生发展和促进肿瘤细胞侵袭转移中都发挥着关键作用。转化生长因子p1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)在肝脏等消化系统恶性肿瘤中发挥着复杂的调控作用,包括维持肿瘤干细胞的稳态,促进肝纤维化进程,作为肿瘤抑制因子参与免疫调节等。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指机体内的上皮细胞受某些体内外因素刺激后向具有间质细胞表型特征发生转变的生物学进程,目前广泛认为EMT是肿瘤侵袭转移的重要方式。细胞因子作为肿瘤微环境的一种成分,也参与了多种肿瘤的发生与发展。目前文献证明,包括TGF-β1在内的细胞因子能够以诱导肿瘤细胞发生EMT样改变的方式促进肿瘤细胞侵袭及转移。TGF-β1作为近年来的研究热点细胞因子,已被证明在肿瘤侵袭转移中起到非常重要的作用,在肝癌侵袭转移中也扮演非常重要的角色。基于上述研究背景,我们推测,肝癌微环境中细胞因子TGF-β1亦可能通过促进肝癌细胞发生EMT的方式促进肝癌细胞侵袭转移。为了验证此假说,本课题主要从以下几个方面开展研究：1.通过体外实验验证TGF-β1是否能够诱导肝癌细胞SMMC-7721发生EMT样改变,并且观察其对肝癌细胞SMMC-7721体外增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响,探讨可能的分子机制。2.针对可能的信号通路中的关键蛋白设计干扰载体siRNA处理肝癌细胞,观察其对TGF-β1诱导的肝癌细胞的形态学以及体外增殖、迁移和侵袭等生物学特性改变。3.采用、Western blot检测EMT相关蛋白及信号通路相关蛋白表达变化,探讨可能涉及的信号通路和分子机制。4.采集临床肝癌组织标本,采用免疫组织化学方法检测肝癌组织中TGF-β1蛋白、信号通路关键蛋白以及EMT相关蛋白表达情况。5.收集肝相关肝癌患者的临床病理学资料,对数据进行分析及统计学处理,获得TGF-β1与肝癌患者临床相关指标、EMT相关标志物等的相关性实验证据。本课题主要分为叁个部分：第一部分TGF-β1通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进肝癌细胞侵袭转移的机制研究目的观察并获得TGF-β1体外诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进其增殖、侵袭和转移等生物学行为的实验证据。方法首先将不同浓度细胞因子TGF-β1 (5,10,20ng/mL)加入到完全培养基中与肝癌细胞SMMC-7721共培养,通过光学显微镜观察形态学变化,MTT检测肝癌细胞增殖指数的变化情况,细胞划痕实验和Transwell小室穿过实验检测TGF-β1对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,蛋白印迹实验检测TGF-β1作用前后上皮间质转化相关标志物蛋白的表达情况。结果不同浓度细胞因子TGF-β1 (5,10,20 ng/mL)与肝癌细胞SMMC-7721分别共培养48 h后,肝癌细胞形态发生了明显变化,细胞间隙从紧密逐渐变得松散,细胞形态从立方形逐渐伸出触角并向成纤维细胞样转变,结果提示TGF-β1能够诱导肝癌细胞发生EMT样转变,并且呈现浓度依赖性。MTT结果显示：TGF-β1能够显着促进肝癌细胞SMMC-7721体外增殖,并且具有时间和剂量依赖性。细胞划痕实验和’Transwell小室穿过实验结果显示：TGF-β1能够显着增强肝癌细胞SMMC-7721体外迁移和侵袭能力。蛋白印迹实验检测上皮间质转化相关标志物蛋白表达情况,结果显示：TGF-β1作用后肝癌细胞SMMC-7721上皮细胞特征性标志物E-cadherin蛋白表达呈现下调趋势,与此同时间质细胞特征性标志物Vimentin蛋白和β-catenin蛋白表达上调,这些结果提示我们TGF-β1有可能是通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞发生EMT样改变,从而促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的改变。结论细胞因子TGF-β1能够通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变的方式改变肝癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为,并且可能是通过Wnt/p-catenin信号通路发挥作用。第二部分下调表达β-catenin部分抑制TGF-β1诱导的肝癌细胞生物学特性的机制研究目的运用小干扰RNA技术下调表达β-catenin来评价Wnt/β-catenin信号通路在TGF-β1诱导肝癌细胞发生生物学行为改变中的作用。方法首先通过蛋白印迹实验验证siRNA-β-catenin的干扰效果；肝癌细胞转染对照质粒和siRNA-β-catenin后分别加入细胞因子TGF-β1进行共培养,再分别采用MTT、细胞划痕实验、Transwell实验检测肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的改变；蛋白印迹实验检测转染siRNA-β-catenin后加入细胞因子TGF-β1诱导的肝癌细胞中EMT相关标志物蛋白表达变化。结果siRNA-β-catenin能够显着下调肝癌细胞中P-catenin蛋白的表达；MTT结果显示：siRNA-β-catenin转染肝癌细胞后能够显着抑制TGF-β1诱导的促进肝癌细胞增殖的作用；细胞划痕实验和Transwell实验也证实转染了siRNA-β-eatenin的肝癌细胞能够部分抵抗TGF-β1诱导的促进细胞迁移和侵袭的作用；蛋白印迹实验结果显示siRNA-β-catenin转染肝癌细胞后,能够抑制TGF-β1诱导的EMT样改变,表现为EMT相关标志物蛋白的表达变化。这些结果提示我们β-catenin可能是TGF-β1诱导肝癌细胞发生EMT样改变影响其增殖、迁移、侵袭等生物学行为中的关键蛋白。结论下调肝癌细胞中β-catenin蛋白表达能够部分抑制TGF-β1诱导的EMT样改变以及相关生物学行为改变,提示β-catenin可能是TGF-β1诱导肝癌细胞发生EMT样改变中的关键蛋白分子。第叁部分肝癌组织中TGF-β1高表达对肝癌预后预测的意义目的探讨临床肝癌患者组织样本中TGF-β1、β-catenin和EMT相关蛋白表达水平与临床病理学指标的相关性。方法采用免疫组织化学法检测TGF-β1、β-catenin、E-cadherin及vimentin在62例肝癌患者组织样本中的表达水平,然后将TGF-β1与肝癌患者的临床病理学资料进行相关性分析。结果TGF-β1阳性表达于肝癌细胞胞浆内,根据免疫组化结果判断标准显示：62例肝癌组织样本中48.39%(30/62)高表达TGF-β1。同时发现高表达TGF-β1肝癌组织样本中同时表现出β-catenin高表达,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加。相关性分析结果发现高表达TGF-pl与E-cadherin的表达呈负相关(4/30,13.33%),和β-catenin和Vimentin的表达呈正相关(29/30,96.67%；27/30,90%)(表1)。根据免疫组化评分结果我们组织样本分为高表达TGF-β1组(n=30)和低表达TGF-β1组(n=32),TGF-β1的表达情况与肝癌患者临床病理学指标的相关性结果见表2。TGF-β1的高表达与肿瘤大小(P=0.000),是否有血管侵犯(P= 0.014), AFP水平(P=0.043),肿瘤数目(P=0.008)和分化程度(P=0.007)具有显着相关性。结论肝癌组织中高表达TGF-β1伴随着β-catenin表达增加,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加,这些结果提示我们在体内随着TGF-含量的升高,肝癌细胞可能通过Wnt/β-catenin信号通路诱导肝癌细胞发生EMT样改变从而发生侵袭转移的潜能随之增加,TGF-β1可能成为未来临床上进行肝癌干预治疗一个新靶点。全文结论TGF-β1能够通过诱导肝癌细胞SMMC-7721发生EMT样改变的方式促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为,其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路调控。临床试验进一步证明,TGF-β1在肝癌组织中高表达,且与β-catenin信号通路蛋白以及EMT标志物相关蛋白存在相关性。TGF-β1表达水平与肿瘤大小、肿瘤数目、AFP水平、分化程度以及是否有血管侵犯等肝癌临床病理指标存在明显的相关性。
刘超, 陈双, 区庆嘉[4]1999年在《转化生长因子-β_1及其Ⅱ型受体在肝细胞癌中的基因表达》文中认为目的 探讨转化生长因子 β1(TGF β1)及其Ⅱ型受体 (TGF βRⅡ )在肝细胞癌中的基因表达。 方法 用RT PCR和免疫组化技术 ,分别检测 3 0例肝癌组织和癌旁肝组织中TGF β1及TGF βRⅡ在mRNA和蛋白水平的表达。 结果 ( 1)TGF β1mRNA阳性表达 ,在肝癌组织中为 2 4 /3 0 ,癌旁肝组织中为 2 6/3 0 ,P >0 0 5 ;但TGF β1蛋白水平在肝癌组织阳性表达低于癌旁肝组织 (P <0 0 1) ;( 2 )TGF βRⅡmRNA阳性表达 ,在肝癌组织中为 11/3 0 ,癌旁肝组织为 2 3 /3 0 ,P <0 0 1;( 3 )肝癌组织中TGF βRⅡmRNA表达越低 ,肝癌细胞分化程度越差 (P <0 0 1) ,出现门静脉转移和癌栓可能性越大(P <0 0 5 )。 结论 肝癌细胞在TGF β1的蛋白水平和TGF βRⅡ的mRNA水平表达异常 ,是其重要生物学特性之一。
马蓉[5]2007年在《TβRⅠ，Smad4和Bad在肝细胞癌中的表达及意义》文中提出目的:探讨转化生长因子β(TGF-β)通路中的转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ),Smad4蛋白以及Bad蛋白在肝细胞癌中的变化及其可能的作用机制。方法:应用免疫组化EnVision二步法,检测46例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC),25例肝硬化及19例正常肝组织中TβRⅠ,Smad4与Bad蛋白的表达。结果:1.TβRⅠ蛋白在正常肝组织组、肝硬化组、肝细胞癌组的蛋白阳性表达率分别为68.42%(13/19)、72.00%(18/25)、32.61%(15/46)、正常肝组织组的蛋白阳性表达率68.42%(13/19)高于肝细胞癌组的蛋白阳性表达率32.61%(15/46),两者比较差异有显着性(P＜0.01)。肝硬化组的蛋白阳性表达率72.00%(18/25)高于肝细胞癌组的蛋白阳性表达率32.61%(15/46),两者比较差异有显着性(P＜0.01)。2.Smad4蛋白在正常肝组织组、肝硬化组、肝细胞癌组的蛋白阳性表达率分别为73.68%(14/19)、68.00%(17/25)、30.43%(14/46)、正常肝组织组的蛋白阳性表达率73.68%(14/19)高于肝细胞癌组的蛋白阳性表达率30.43%(14/46),两者比较差异有显着性(P＜0.01)。肝硬化组的蛋白阳性表达率68.00%(17/25)高于肝细胞癌组的蛋白阳性表达率30.43%(14/46),两者比较差异有显着性(P＜0.01)。3.Bad蛋白在正常肝组织组、肝硬化组、肝细胞癌组的蛋白阳性表达率分别为21.53%(4/19)、72.00%(18/25)、60.87%(28/46)、肝细胞癌组的蛋白阳性表达率60.87%(28/46)高于正常肝组织组的蛋白阳性表达率21.53%(4/19),两者比较差异有显着性(P＜0.01)。肝硬化组的蛋白阳性表达率72.00%(18/25)高于正常肝组织组的蛋白阳性表达率21.53%(4/19),两者比较差异有显着性(P＜0.01)。4.肝细胞癌中TβRⅠ表达与Smad4表达之间存在着正相关性P＜0.01。结论:TβRⅠ,Smad4和Bad与HCC发生、发展密切相关。
季国忠, 赵志泉, 缪林, 刘政, 张平[6]2002年在《TGF-β_1、TGF-β_1RⅡ、NF-κB在肝细胞癌血管形成中的作用及机制探讨》文中进行了进一步梳理目的 探讨转化生长因子 β1(TGF - β1)、转化生长因子 β1Ⅱ型受体 (TGF - β1RⅡ )、核转录因子 -κB(NF -κB)在肝细胞癌 (HCC)血管形成中的作用及其机制。方法 用免疫组化技术 ,分别检测 36例肝癌组织和癌旁肝组织中TGF - β1、TGF - β1RⅡ及NF -κB蛋白的表达 ;以CD3 4 标记血管内皮细胞 ,观察TGF - β1及TGF- β1RⅡ蛋白与微血管密度 (MVD)的关系 ;同时观察NF -κB与TGF - β1的关系。结果 (1)肝癌组织TGF - β1蛋白表达明显高于癌旁组织 (P <0 0 1) ;肝癌组织TGF - β1RⅡ蛋白表达明显低于癌旁组织 (P <0 0 1)。(2 )肝癌组织中MVD明显高于癌旁组织 (P <0 0 1)。(3)肝癌组织中TGF - β1蛋白阳性表达与MVD呈正相关 ;TGF -β1RⅡ蛋白阳性表达与MVD呈负相关。 (4)NF -κB蛋白阳性表达与TGF - β1蛋白阳性表达呈正相关。结论 肝癌细胞中TGF - β1、TGF - β1RⅡ、NF -κB蛋白表达异常 ,并与MVD相关 ,提示它们在肝细胞癌血管形成中发挥重要作用 ,NF -κB可能在介导TGF - β1的活化或产生中发挥一定的作用
陈丽[7]2003年在《TGF-β/SMAD信号通路分子在原发性肝细胞癌中的表达及意义研究》文中提出目的：研究TGF-β/SMAD信号通路主要组成分子TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4、Smad7在原发性肝细胞癌患者肝组织中的表达状况,旨在探讨该信号通路在原发性肝细胞癌发生发展的作用和临床意义。方法：应用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法检测39对人肝细胞癌组织、相应癌旁肝组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4、Smad7的mRNA表达率及表达水平，综合分析它们的表达变化与相应临床指标，包括患者年龄、肿瘤大小、有无胞膜、分化程度、有无门静脉癌栓及患者血清AFP水平的关系。结果：⑴ 39例肝癌组织中TGF-β1mRNA的阳性表达率明显高于癌旁组织（分别为92.3％和71.8％，P<0.05）；TGF-βRⅡmRNA的阳性表达率在癌组织和癌旁组织中无显着差异（分别为43.6％和41.0％，P>0.05）,<WP=5>但两者的缺失率都大于50％；癌组织Smad4mRNA的阳性表达率明显高于癌旁组织（分别为94.9％和74.4％，P<0.05）；而Smad7mRNA的阳性表达率癌组织低于癌旁组织（分别为76.9％和94.4％，P<0.05）。⑵ TGF-β1mRNA和Smad7mRNA均阳性表达的肝癌组织及其癌旁组织中，其表达水平无显着性差异（P分别为0.327和0.491）； 而Smad4 mRNA的表达水平癌组织显着高于癌旁组织（P=0.000）。⑶ TGF-βRⅡ在有胞膜的肿瘤和伴门静脉癌栓的患者中表达阳性率明显高于无胞膜的肿瘤和不伴门静脉癌栓的患者（P＝0.019和P＝0.039）。Smad4、Smad7的阳性表达与患者有无门静脉癌栓有关：Smad4在有门静脉癌栓的患者阳性表达率（10/13）明显低于无门静脉癌栓的患者（26/26）（P＝0.031）；而Smad7在有门静脉癌栓的患者中的阳性表达率（12/13）明显高于无门静脉癌栓的患者（15/26）（P＝0.034）。而TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4、Smad7mRNA的表达率与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、AFP值高低及HBsAg感染等临床病理指标无显着性相关。结论：肝细胞癌组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4、Smad7的表达率及表达水平与相应癌旁组织间显示差异，并且它们的表达与反映肝癌预后的重要临床指标相关，提示TGF-β/SMAD信号通路在肝细胞癌发生发展中可能起重要作用，监测病人该通路中的上述组成分子变化可能有助于临床治疗预后的判断。
申安[8]2003年在《Smad_4、TGFβ_1及其受体TGFβRⅡ在肝细胞癌中的表达及意义》文中研究说明肝细胞癌(Hepatocellulal Careinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，它具有高侵袭、生长快、转移早，预后差的临床病理特征。Hcc的发生、发展及转移是一个复杂的多因素参与的过程。其中转化生长因子p(Transfo而ng growthfactorp，TGF一p)传导途径是HcC的发生、发展及转移的一条重要途径。因此研究TGF一p传导途径与HCc的关系，有助于揭示Hcc发生、发展及转移的机制。在TGF一p传导途径中，TGF pl，TGF p Rn及Sma山是TGFp传导途径中叁个重要成份，在此传导途径中，TGF p Rn先与TGF pl结合，TGF p Rl识别并与之结合形成TGF p RH一TGF pl一TGF p Rl复合物，其GS区磷酸化，与胞质内R一Smads(reeeptor一regulated Smads，如SmadZ，Smad3)结合，使之磷酸化。磷酸化的R一Slnads再与Sma山结合移至细胞核，与序列特异的DNA蛋白结合，激活特定的靶基因，通过介导阻滞Gl期，促进分化，促进凋亡等抑制细胞生长。若其中任一因子失活均可导致TGFp一Smad信号传导中断，生长失控，诱导癌症，而在该通路中最常改变的是Sma山。已有实验证实，TGF一p传导途径的改变是诱导肿瘤发生的重要途径，且TGF pl对肿瘤生长具有双向调节作用，叁者与肿瘤转移和预后关系密切，故研究TGFp:、TGF p Rll及sma山在Hcc中的表达，有助于了解TGF一p传导途径对HCC的发生、发展、转移及预后的作用，为临床诊断、判断病程及预后，寻找Hcc的新的治疗方法提供理论依据。叁者在Hcc中的研究，国内尚未见文献报道。本研究利用免疫组化SABC法，联合检测45郑州大学2(X]3届硕士毕业论文smad4、TGF pl及其受体TGF日Rn在肝细胞癌中的表达及愈义例HCC中的TGF pl、TGF p R 11及Smad4的表达。借以探讨叁者的表达与HCC的关系，叁者之间的相关性，以及临床病理意义。材料与方法 肝细胞癌手术切除标本45例，36例带癌旁组织。其中男兑例，女13例;年龄27·69岁，平均51.5岁。血清A卫P阳性者34例(放免法>4oo呵ml为阳性)，占75.6%(34/45)。HBsAg阳性者32例，占71.1%(32/45)。肿瘤直径(d):d蕊scm者n例，scm<d蕊10cm者25例，d>1 ocm者9例，平均直径7.6cm。最大直径13em。按照Edmondson一Steiner组织学分级标准，I级4例，11级15例，m级20例，W级6例。包膜浸润，包膜不完整或无包膜者31例，有完整包膜者14例。有癌栓者16例。根据临床病理资料标本分为高侵袭性转移组和低侵袭转移组，凡符合下列条件之一者，归为高侵袭转称组:①肝门淋巴结转移，②门静脉有癌栓者，③同一肝叶内主癌灶周围肿瘤数目)2个卫星结节或伴有包膜侵袭破坏者，45例HCC中，高侵袭转移组27例，低侵袭转移组18例。所有病人手术前均未行放疗、化疗、肝动脉栓塞及免疫治疗等，3例外伤性肝破裂患者手术切除标本，作为正常对照。使用鼠抗人smad4单克隆抗体，兔抗人TGFp;、TGFp Rn多克隆抗体。通过免疫组化SABC法检测叁者在45例HCC中的表达水平，染色结果按反应强度及面积判断，评分标准参考ShimiZu方法，根据两项之和，)3分者为阳性，余为阴性，统计学分析采用SPSs10.0软件对数据进行处理，计数资料比较用x“检验或Fishe:确切概率计算法，以P<0 .05认为具备显着性差异。结果1.正常对照组Slna山、TGF p Rn均呈阳性表达，而TGF pl全呈阴性表达。2.Hee中smad4、TGFp;和TGFp Rll的阳性率分别为51.1%(23/45)，62.2% (28/45)和42.2%(19/45)。叁者在癌旁组织中的阳性表达率分别为50.1%(29/36)，13.8%(5/31)和83.6%(30/36)，叁组比较均具有显着性差异(p<0.05)。3 .smad4、ToF pl及TeF p R 11的表达与Hee患者年龄、性别、AFP、HBsAg及肿瘤大小均无关(P>0 .05)，且Sma山与HCC病理分级无关(P>0 .05)，而TGFpl在Hcc的高分化组(I+H级)与低分化组(m+W级)中的阳性表达率分别为36.3%(7/19)和84.0%(21/26)，两组相比较有显着差异(p<0.05)。TGFp郑州大学2003届硕士毕业论文SM、TGFp；及其受体TGFpRll在肝细胞癌中的表达及意义R 11在 HCC的高分化组（IA级）与低分化组（Ill＋IV级）中的阳性表达率分别为 63．2％（12／19）和 26．9％（7／2俩组相比较有显着差异（P＜0．05）。4．有癌栓组 Sma山、TGF fil及 TGF i R 11的阳性表达率分别为 32．1％归／16卜87．5％OV16）和18．8％（／16），与无癌栓组的62．1％（1／29）、48．2％（1心29）及55．2％（16／29）相比较均有显着性差异（P＜0．05）。5．包膜完整组S。山、TGF pl和TGF p R 11的阳性率分别为78石％＊1八4人35．7％（／1对和64．3％（／14），与包膜不完整组的38．7％（12／31），74．1％（2／31）及32．3％仰31）相比较，叁者均有显着性差异（P＜0．05）。6．高侵袭转移组与低侵袭转移组的 Smad4、TGF DI和 TGF D R 11的阳性表达率之间有显着性差异（P＜o．05）。7．HCC中的TGF pl、TGF p R 11与Sma山的阳性事之间均无相关关系（分别为 P＝0．162，rs＝－0．212和 P＝0．448，rs＝0．116），TGF＊ 与TGFD Rll之间呈负相关性 （P＝0．0017，IS?
齐阳[9]2016年在《核糖体蛋白S5抑制肝癌细胞间质转化和肿瘤干细胞产生》文中认为研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤之一。乙肝和丙肝病毒感染,黄曲霉素B1暴露和肝纤维化是肝细胞癌发生发展的主要危险因素。目前手术切除、肝脏移植、放化疗等是常用的治疗手段,但是大部分肝癌患者术后仍会出现全身性转移和复发,因而愈后情况并不乐观。越来越多的研究报道,肝细胞癌的转移与上皮细胞间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)密切相关。EMT是指上皮细胞丢失细胞极性变成可移动的间充质细胞的过程。在各种刺激因子作用下,肝细胞癌细胞发生EMT过程可获得对化疗药的抵抗、迁移侵袭能力增强和干性等特征。转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGFβ)作为一种多功能细胞因子,可激活细胞内多条信号通路参与EMT过程,是一个最强的EMT诱导剂。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)或肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TIC)是指肿瘤细胞中具有干细胞特征且能够发展为异质性肿瘤的一小部分细胞。肿瘤干细胞可通过自我更新和分化产生大量肿瘤细胞,具有放化疗抵抗,同时在体内具有很高的成瘤性。有研究表明,EMT与细胞获得干细胞特征密切相关。例如,Twist、Snail高表达或TGFβ刺激可诱导人乳腺上皮细胞发生EMT,获得CD44high/CD24low乳腺癌干细胞。类似地,乳腺癌干细胞也可由CD8+T细胞诱导乳腺癌上皮细胞发生EMT过程获得。核糖体蛋白表达异常与多种肿瘤有关。核糖体蛋白S5(ribosomal protein S5,RPS5)参与构成真核生物核糖体40S小亚基,主要与细胞内蛋白质合成相关。研究发现RPS5在肝癌中高表达,在结肠癌中低表达。近年来发现RPS5还有核糖体外功能。例如,RPS5能抑制鼠红白血病(murine erythroleukemia,MEL)细胞分化。课题组前期研究发现,RPS5能抑制肝星状细胞活化和EMT进程以及实验性肝纤维化,这些作用与其降低AKT在Ser473和Thr308位点的磷酸化,以及降低下游蛋白分子GSK3β和P70S6K的磷酸化密切相关。此外,还发现RPS5是苦参碱衍生物MASM的靶点。MASM通过稳定肝星状细胞和实验动物模型肝脏内RPS5蛋白表达,发挥抗肝纤维化作用。目前关于RPS5与肝癌细胞EMT过程和肿瘤干细胞产生之间的研究,国内外均未见报道。研究目的本课题将探讨RPS5与肝癌细胞EMT过程和肿瘤干细胞产生的关系。此外,鉴于RPS5作为MASM的靶蛋白,我们还将研究MASM对肝肿瘤干细胞产生的作用。通过以上研究,阐明RPS5与肝癌之间的关系,进一步明确RPS5参与调控的相关分子机制,探讨RPS5作为肝癌治疗潜在新靶点的可能性。研究方法一、RPS5在肝癌细胞EMT中的作用1、RPS5在TGFβ1诱导肝癌细胞发生EMT过程中表达变化以TGFβ1诱导肝癌细胞Huh7和HCCLM3 EMT为模型,观察不同浓度的TGFβ1刺激Huh7和HCCLM3细胞不同时间后肝癌细胞的形态改变,并抽提细胞蛋白和总RNA。用Western blots和Real time PCR分别检测EMT相关指标(ZO-1、E-cadherin、N-cadherin和vimentin)及RPS5在蛋白和m RNA水平的表达变化。2、RPS5敲减对肝癌细胞EMT的影响(1)Huh7细胞分别转染RPS5的叁个小干扰序列和对照Control si RNA,72 h后抽提细胞蛋白和总RNA。Real time PCR和Western blots检测叁个小干扰序列的干扰效果,并考察RPS5敲减后对EMT标志物E-cadherin和vimentin蛋白表达的影响。(2)构建表达shRPS5和对照sh NC载体,包装成Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒。慢病毒感染Huh7细胞72 h后,细胞加或不加TGFβ1再处理48 h,抽提细胞RNA和蛋白。Real time PCR和Western blots检测EMT相关指标和RPS5的表达变化。部分实验将Huh7细胞接种于细胞爬片上,感染Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒。用免疫细胞荧光方法检测细胞中EMT标志物蛋白表达水平的变化。3、RPS5表达下调诱导EMT的作用机制研究Huh7细胞用2.5 ng/ml TGFβ1刺激48 h和72 h后,或感染Lenti-shRPS5和Lenti-sh NC 72 h后,加或不加TGFβ1处理48 h,抽提细胞蛋白。Western blots检测PI3K/AKT/GSK3β,ERK和Smad2通路蛋白。4、RPS5过表达对RPS5 shRNA促进的EMT进程的影响构建过表达RPS5载体(该RPS5序列转录的RPS5m RNA不能被RPS5shRNA所识别,称之为RPS5突变体RPS5-mutant)和对照GFP载体,包装成Lenti-GFP和Lenti-RPS5-mutant慢病毒。Huh7细胞感染Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒24 h后,再感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5-mutant慢病毒。继续培养96h后抽提细胞蛋白。Western blots检测RPS5及EMT标志物(E-cadherin和vimentin)蛋白,同时检测EMT相关信号通路蛋白。5、RPS5过表达对肝癌细胞迁移能力的影响构建过表达RPS5载体(该RPS5基因序列与人源的RPS5基因序列一致),包装Lenti-RPS5慢病毒和对照Lenti-GFP慢病毒。Huh7和HCCLM3用TGFβ1刺激不同时间,或感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒72 h后,Transwell迁移实验评价肝癌细胞的迁移能力。二、RPS5在肝肿瘤干细胞产生中的作用1、RPS5过表达对肝肿瘤干细胞样细胞产生的影响(1)Huh7细胞感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒并用嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系Huh7-GFP和Huh7-RPS5。Western blots方法确证稳转细胞系中RPS5蛋白高表达,流式细胞仪检测RPS5对Ep CAM+和CD133+细胞数目的影响。(2)Huh7-GFP和Huh7-RPS5细胞悬浮培养于干细胞培养基中,7天后计数第1代球体细胞个数并拍照比较球体大小。将第1代球体细胞继续培养7天后计数第2代球体细胞个数。(3)瞬时感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒5天的Huh7细胞或Huh7-GFP和Huh7-RPS5稳转细胞,抽提细胞RNA。Real time PCR方法检测干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2,Oct3/4)的表达。(4)不同浓度梯度的多柔比星(Doxorubicin,DOX)处理Huh7-GFP和Huh7-RPS5稳转细胞72 h后,CCK8方法检测细胞增殖情况,评价细胞对DOX的敏感性。2、8个肝癌细胞系RPS5表达水平的比较培养人正常肝细胞系LO2和8个人肝癌细胞系MHCC-97H、MHCC-97L、Hep3B、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Hep G2、HCCLM3和Huh7,抽提细胞蛋白。Western blots检测不同细胞株RPS5蛋白表达水平。3、比较不同RPS5表达水平的肝癌细胞系其肿瘤干细胞特征选择RPS5相对高表达细胞LM3和相对低表达细胞Huh7进行以下实验:(1)流式细胞仪检测LM3和Huh7细胞中Ep CAM+和CD133+细胞数目。(2)用干细胞培养基培养LM3和Huh7细胞7天后,拍照观察球体细胞大小并计数球体细胞个数。(3)Real time PCR方法检测LM3和Huh7细胞中干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2,Oct3/4)表达。(4)用不同浓度梯度的DOX和5-氟尿嘧啶(5-FU)处理LM3和Huh7细胞72 h后,CCK8方法检测细胞增殖情况。叁、苦参碱衍生物MASM在肝肿瘤干细胞产生中的作用1、MASM体外对肝肿瘤干细胞的作用(1)MASM(0,2,10和20μM)处理Huh7和Hep3B球体细胞72 h后,流式细胞仪检测球体细胞中Ep CAM+和CD133+细胞数及凋亡细胞数。Real time PCR检测球体细胞中干性相关基因(CD133,Ep CAM,Sox2和Oct3/4)和肝细胞相关基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)表达变化。(2)用上述不同浓度的MASM处理Huh7和Hep3B球体细胞7天后,拍照观察第1代球体细胞大小并计数球体个数。将各组第1代球体细胞在无药条件下再培养7天后计数第2代球体个数。依此法,培养获得第3代球体细胞并计数。2、MASM对体内肝癌种植瘤的生长及肝肿瘤干细胞生成的影响将人的肝癌细胞Huh7接种于裸鼠皮下构建异种移植瘤模型。细胞接种24h后给予药物处理。药物处理分组:(1)生理盐水组;(2)MASM处理组(10 mg/kg,每天灌胃给药);(3)DOX组(6 mg/kg,腹腔注射,每周一次);(4)DOX和MASM联合给药组。给药处理21天。待皮下种植瘤长出后,测量并计算肿瘤体积大小。实验结束后手术剥离皮下种植瘤拍照并称重。取MASM处理组和生理盐水组肿瘤组织,经胰酶消化后获得单细胞悬液,在干细胞培养基中培养观察肿瘤干细胞成球能力的差异。Real time PCR检测MASM处理组和生理盐水组肿瘤组织中干性相关基因以及肝细胞相关基因表达的差异。3、MASM作用机制研究(1)MASM(0,2,10和20μM)处理Hep3B和Huh7细胞72 h后,抽提细胞蛋白。Western blots检测PI3K/AKT/m TOR/P70S6K和GSK3β/β-catenin信号通路蛋白。(2)用10μM的CHIR-99021(GSK3β特异性抑制剂)与10μM MASM单独或联合处理Hep3B和Huh7细胞72 h后,抽提细胞蛋白。Western blots检测GSK3β/β-catenin信号通路蛋白的表达变化。结果一、RPS5在肝癌细胞EMT中的作用(一)RPS5在TGFβ1诱导肝癌细胞发生EMT过程中表达下调TGFβ1处理Huh7细胞48 h或72 h后,细胞由典型的卵圆形上皮细胞形态变为长梭形间质细胞形态。Western blots和Real time PCR结果表明,TGFβ1处理后可显着下调上皮细胞标志物E-cadherin,而上调间质细胞标志物N-cadherin和vimentin(p<0.01),同时RPS5 m RNA和蛋白表达水平显着下调(p<0.01)。TGFβ1处理LM3细胞第5天开始LM3细胞呈现长梭形间质细胞形态,同时上调vimentin m RNA和蛋白表达水平,下调E-cadherin和RPS5(p<0.01)。提示RPS5在EMT中可能发挥重要的作用。(二)RPS5敲减促进肝癌细胞EMT1、RPS5 si RNA促进Huh7肝癌细胞发生EMTRPS5 si RNA转染细胞72 h后,RPS5 si RNA3可显着下调RPS5 m RNA和蛋白水平,同时减少E-cadherin表达(p<0.05),而增加N-cadherin和vimentin表达(p<0.01),表明单独的RPS5表达下调即可诱导肝癌细胞发生EMT。2、RPS5 shRNA慢病毒感染细胞敲减RPS5促进EMT进程与RPS5 si RNA作用相似,RPS5shRNA慢病毒感染细胞后可显着减少RPS5m RNA和蛋白表达(p<0.01),同时显着下调E-cadherin m RNA和蛋白表达(p<0.05),上调vimentin表达(p<0.05)。免疫细胞荧光结果表明,RPS5敲减后的细胞中E-cadherin表达明显下调,而vimentin表达明显上调。并且RPS5的作用不依赖于TGFβ1。(叁)RPS5表达下调诱导EMT的作用机制1、TGFβ1刺激诱导EMT过程激活的细胞信号通路TGFβ1处理Huh7细胞诱导EMT发生,激活了AKT,ERK和Smad2信号通路,显着增加AKT,ERK和Smad2磷酸化水平。这与文献报道结果是一致的。2、RPS5 shRNA慢病毒感染细胞敲减RPS5促进EMT的作用机制RPS5敲减后激活了AKT,ERK和Smad2信号通路,增加了AKT,ERK和Smad2磷酸化水平。(四)RPS5过表达逆转RPS5 shRNA促进的EMT进程和相关信号通路1、RPS5过表达逆转RPS5 shRNA促进的EMT进程在RPS5敲减的细胞中感染Lenti-RPS5-mutant慢病毒后,RPS5表达水平显着增加(p<0.05),同时下调的E-cadherin表达和上调的vimentin表达被部分恢复。表明RPS5可抑制EMT过程。2、RPS5过表达逆转RPS5 shRNA激活的AKT和ERK通路在RPS5敲减的细胞中感染RPS5过表达突变体慢病毒Lenti-RPS5-mutant后,可明显降低RPS5敲减后升高的AKT(Ser473)及其下游m TOR(Ser2448)磷酸化水平以及ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化水平,而对升高的Smad2(Ser465/467)磷酸化无显着影响。提示RPS5通过抑制AKT和ERK通路阻止EMT进程。(五)RPS5过表达抑制肝癌细胞迁移能力Transwell迁移实验结果显示,TGFβ1处理Huh7或LM3细胞后细胞迁移数明显多于对照组。这与文献报道结果是一致的。RPS5过表达细胞迁移数明显少于对照组。表明RPS5过表达抑制肝癌细胞迁移能力。这可能与RPS5抑制EMT过程有关。二、RPS5在肝肿瘤干细胞产生中的作用(一)RPS5过表达抑制肝肿瘤干细胞样细胞的产生1、Huh7细胞RPS5过表达抑制肝肿瘤干细胞样细胞的产生Western blots结果确证Huh7-RPS5稳转细胞系中RPS5明显高表达。与对照Huh7-GFP细胞相比,RPS5过表达的Huh7细胞中CD133+干细胞的数目明显减少(83.76%vs.70.90%,p<0.05),而对Ep CAM+细胞数无显着影响(98.77%vs.96.51%)。2、RPS5过表达抑制Huh7成球能力和自我更新能力细胞悬浮成球培养实验显示,Huh7-RPS5细胞系产生的球体个数显着少于Huh7-GFP细胞系(99±8 vs.70±4个,p<0.05),表明RPS5过表达抑制Huh7细胞成球能力。第二代球体细胞计数发现,Huh7-RPS5细胞系的球体个数依然少于Huh7-GFP细胞系(50±2 vs.38±3个,p<0.05)。表明RPS5过表达抑制Huh7细胞自我更新能力。3、Huh7细胞RPS5过表达抑制干性相关基因的表达Huh7细胞瞬时转染RPS5过表达慢病毒5天后可显着降低干性相关基因Ep CAM,Sox2和Oct3/4 m RNA水平(p<0.05),但对CD133无影响。RPS5稳转细胞系Huh7-RPS5中Ep CAM和CD133在m RNA水平的表达显着下降(p<0.05),而Sox2和Oct3/4表达无明显变化。4、RPS5过表达对DOX的耐药性降低耐药性实验结果表明,RPS5过表达可略微增加Huh7细胞对DOX的敏感性。DOX对Huh7-GFP细胞的IC50值为0.34μM,而对Huh7-RPS5细胞的IC50值为0.23μM。(二)8个肝癌细胞系RPS5表达水平的比较Western blots结果表明,LM3,PLC/PRF/5和Hep G2细胞中RPS5表达水平相对较高,而Huh7,SMMC-7721,Hep3B,MHCC-97H和MHCC-97L细胞中RPS5表达水平相对较低,与正常肝细胞系LO2表达水平相当。(叁)比较不同RPS5表达水平的肝癌细胞系的肿瘤干细胞特征1、Ep CAM+/CD133+肝肿瘤干细胞数比较流式细胞仪检测结果表明,RPS5相对高表达LM3细胞中CD133+细胞数明显少于Huh7细胞(7.33%vs.81.11%,p<0.01),而Ep CAM+细胞数两者无显着差异(89.46%vs.96.26%)。2、肝癌细胞成球能力的比较RPS5相对高表达LM3细胞球体个数明显少于RPS5相对低表达Huh7细胞个数(62±2个和104±4个,p<0.05)。3、干性相关基因表达水平的比较Real time PCR结果表明,RPS5相对高表达LM3细胞中Ep CAM和CD133在m RNA水平表达显着低于RPS5相对低表达Huh7细胞(p<0.01),而Sox2和Oct3/4表达水平无显着差异。4、耐药性比较RPS5相对高表达细胞株LM3对DOX的敏感性较RPS5低表达Huh7细胞高(IC50值:0.12μM vs.0.90μM,p<0.05);LM3对5-FU的敏感性较Huh7相对较高(IC50值:76.5μM vs.454.5μM,p<0.05)。叁、苦参碱衍生物MASM抑制肝肿瘤干细胞产生(一)MASM体外抑制肝肿瘤干细胞1、MASM减少球体细胞Ep CAM+/CD133+细胞数目流式细胞仪检测结果显示,MASM(10μM和20μM)处理Hep3B和Huh7球体细胞72 h可显着减少两种球体细胞Ep CAM+/CD133+的细胞数目,Hep3B球体细胞中Ep CAM+/CD133+的细胞数目由对照组的97.0%分别降低为86.5%和76.5%,Huh7球体细胞中Ep CAM+/CD133+的细胞数目由对照组的94.1%分别降低为82.1%和73.4%。2、MASM对球体细胞凋亡的影响MASM(10μM和20μM)处理Hep3B和Huh7球体细胞72 h可以不同程度的诱导球体细胞的凋亡,Hep3B球体细胞的凋亡率由对照组15.4%增加到21.1%和27.4%,Huh7球体细胞的凋亡率由对照组10.4%增加到13.5%和17.8%。3、MASM抑制肝癌球体细胞生长和自我更新(1)MASM(10μM和20μM)与Hep3B和Huh7球体细胞共孵育7天可以显着减少第1代球体细胞数目和球体大小,表明MASM能抑制肝癌球体细胞的生长。(2)将第1代球体细胞消化后在无药情况下,继续培养第2代和第3代球体细胞。结果显示药物处理组球体细胞个数依然少于对照组,提示MASM抑制肝癌球体细胞的自我更新。4、MASM诱导肝肿瘤干细胞向肝细胞分化MASM处理Hep3B和Huh7球体细胞72 h,可浓度依赖性地降低干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2和Oct3/4)的表达水平(p<0.05),而显着增加肝细胞相关基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)的表达水平(p<0.05),提示MASM诱导肝肿瘤干细胞向肝细胞分化。(二)MASM抑制体内肝癌细胞异种移植瘤的生长及肝癌干细胞生成1、MASM抑制体内肝癌种植瘤的生长体内实验结果表明,MASM(10 mg/kg)连续灌胃给药21天可以显着抑制Huh7细胞异种移植瘤的生长。MASM对肿瘤生长的抑制作用与DOX作用相当,二者合用后效果更佳。实验结束后剥离肿瘤拍照并称重,瘤块大小和重量的结果与前述的肿瘤生长曲线结果一致。表明MASM可以抑制体内异种移植瘤的生长。2、MASM抑制体内肝肿瘤干细胞成球能力瘤块组织消化分散为单细胞,再用干细胞培养基培养7天,结果显示MASM处理组的球体个数显着少于对照组的球体个数(26±5 vs.75±7,p<0.05)。这与体外结果是一致的。3、MASM促进瘤块组织中肿瘤干细胞向肝细胞的分化Real time PCR结果表明,MASM处理组瘤块组织中干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2和Oct3/4)的表达水平显着低于对照组(p<0.05),而肝细胞相关基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)的表达水平显着高于对照组(p<0.05)。这与体外结果是一致的。(叁)MASM抑制肿瘤干细胞的分子机制1、MASM抑制PI3K/AKT信号通路不同浓度的MASM处理Huh7和Hep3B 72 h后,Western blots结果表明,MASM可以剂量依赖性的抑制PI3K/AKT相关信号通路蛋白的表达,降低PI3K,AKT,m TOR和P70S6K磷酸化水平。2、MASM抑制β-catenin信号通路由于GSK3β是AKT的下游分子,而且GSK3β可以磷酸化β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)导致其进一步的降解,但GSK3β不能磷酸化β-catenin(Ser675)。因此,我们检测MASM对GSK3β和β-catenin磷酸化的影响以及β-catenin及其下游蛋白Cyclin D1的表达水平。结果发现,MASM处理Huh7和Hep3B 72h后,可以显着降低GSK3β(Ser9)磷酸化水平,同时促进β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化,但对β-catenin(Ser675)磷酸化无影响。并且MASM下调β-catenin和Cyclin D1的蛋白表达水平。进一步应用GSK3β特异性抑制剂CHIR验证MASM是否特异地抑制β-catenin信号通路。结果显示:与MASM作用相反,GSK3β特异性抑制剂CHIR可增加GSK3β(Ser9)磷酸化水平,抑制β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化而不影响β-catenin(Ser675)磷酸化,并且上调β-catenin蛋白水平。与MASM单独作用相比,MASM与CHIR合用时,β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化水平则较低,伴随较高的β-catenin蛋白水平。这些结果提示MASM降低肝癌细胞内β-catenin水平可能是通过激活GSK3β,因为GSK3β(Ser9)磷酸化会导致其活性抑制,进而稳定β-catenin。结论1、TGFβ1刺激肝癌细胞发生EMT过程中,伴随RPS5表达下调。2、RPS5表达水平降低可促进肝癌细胞EMT,其作用机制是通过激活AKT和 ERK通路。3、RPS5过表达能抑制肝癌细胞迁移和肝癌干细胞样细胞产生。4、MASM抗肝癌作用与其抑制肝癌干细胞的自我更新及诱导其向肝细胞分化 有关,这些作用可能是通过抑制肝癌细胞PI3K/AKT/m TOR通路和 GSK3β/β-catenin信号通路实现的。
裘捷[10]2006年在《四跨膜蛋白TM4SF4在急性肝损伤和肝癌中的表达变化和功能研究》文中研究说明四跨膜蛋白是一个特殊的细胞膜糖蛋白家族,通常由4个高度疏水的保守跨膜区段,2个较短的胞内区,以及2个差异相对较大的胞外区构成。四跨膜蛋白参与细胞生长增殖、黏附、迁移和浸润等多种功能,是一个极其重要的蛋白质家族。TM4SF4蛋白(Transmembrane 4 superfamily member 4)是一个四跨膜蛋白超家族的成员,最初是作为一个在人小肠上皮细胞和肝细胞中表达的四跨膜糖蛋白被发现的,能够调控细胞密度相关的增殖抑制。我们实验室首先克隆了大鼠中的同源基因rat TM4SF4,并发现它在2/3肝切除后的再生肝中表达升高,推测可能与肝细胞再生相关。但是该蛋白在体内的具体功能和作用机制还不清楚。本论文的第一部分工作,我们采用四氯化碳大鼠急性肝损伤模型,研究了TM4SF4在四氯化碳急性肝损伤中作用。RT-PCR和Western blot检测表明,在四氯化碳急性肝损伤的过程中,TM4SF4的mRNA和蛋白表达都急剧升高。用尾静脉注射的方法,将正义的或反义的TM4SF4表达质粒注入大鼠体内,上调或下调肝脏内TM4SF4的表达;然后用血清ALT/AST活力、肝脏组织学损伤评定等指标来评价肝脏的损伤程度,并用荧光实时定量PCR和Western blot等方法来检测损伤相关基因表达情况的变化。结果表明,TM4SF4的过表达,会加强肝脏的损伤,并使血清ALT、AST活力的升高。而下调TM4SF4基因的表达,则会减轻肝脏的坏死程度,降低血清ALT、AST的活力。TM4SF4的表达上调,还会影响一些生长因子和受体的表达水平,如TNF-α、TNFR1和c-met等。此外,TUNEL检测表明,TM4SF4的表达上调,还能促进CCl4引起的肝细胞凋亡,并且改变一些促凋亡基因和抑凋亡基因的表达。因此,我们的实验表明大鼠TM4SF4基因在四氯化碳诱导的肝脏急性损伤中表达上升,并且在促进肝脏损伤中起重要的作用,其作用机制可能与TNF-α和HGF/c-met信号通路有关。本论文的第二部分工作,我们对TM4SF4蛋白在肝细胞癌中的表达和功能进行了研究。对临床肝癌和癌旁样品的Western blot和免疫组化的检测表明,TM4SF4蛋白在肝细胞癌中高表达,而在相应癌旁组织中的表达明显较低或检测不到。在肝癌细胞中导入TM4SF4表达质粒,TM4SF4基因的高表达能显着促进肝癌细胞的克隆形成能力和细胞增殖速度。采用RNA干扰技术抑制肝癌细胞BEL-7404中TM4SF4基因的表达后,能明显抑制细胞的生长和侵袭能力。免疫荧光共定位实验表明,TM4SF4定位于细胞膜上,并且能在EGF的刺激作用下进入到细胞质中。同时发现抑制TM4SF4的表达,能够使EGFR通路下游JAK激酶和STAT3的磷酸化程度减弱;过表达TM4SF4能够增强STAT3-诱导的启动子的转录活力。我们的实验表明,TM4SF4基因在肝细胞癌中表达上升,TM4SF4的过表达能够促进肝癌细胞的恶性增殖,并参与EGFR/STAT3信号通路的活化。我们的工作第一次对TM4SF4的功能进行了较深入地研究,由此发现了TM4SF4的异常高表达能促进肝脏的损伤和肝癌细胞的恶性增殖,并且第一次对TM4SF4的作用机理进行了初步的探讨,发现TM4SF4与TNF-α、HGF/c-Met和EGFR/STAT3信号通路有关。目前对于这个基因的功能和作用机制、以及表达调控等方面正在进行深入的研究。
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