呼海燕[1]2001年在《AVP和OT对大鼠DRG神经元膜的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的 研究精氨酸加压素(Arginine vasopressin，AVP)和催产素(Oxytocin,OT)对大鼠背根神经节(DRG)神经元的作用并探讨其作用机制。 方法 1．实验应用细胞内微电极记录技术，记录离体灌流DRG神经膜电位。 2．所得资料均用X±SE表示，用t检验进行统计学处理。 结果 1．在受检的120个细胞中，绝大多数(81.67％)在滴加AVP后产生明显的超极化反应；在受检的92个神经元中，绝大多数(77.17％)在滴加OT后亦产生明显的超极化。 2．滴加AVP(10~(-5)mol／L)和OT(10~(-5)mol／L)后膜电导分别增加约19.34％(P＜0.05)和16.26％(P＜0.05)。 3．灌流平衡液中的NaCl以氯化胆碱(CH-Cl)置代和用Cd~(2+)阻断Ca~(2+)通道后，AVP和OT引起超极化反应的幅值均无明显变化(P＞0.05)，而加入K~+通道阻断剂四乙铵(TEA)后，AVP和OT引起的超极化反应幅值均明显减小(P＞0.05)。 4．AVP引起的超极化反应可被AVP V_1受体拮抗剂阻断，OT引起的超极化反应可被OT受体拮抗剂阻断(P＞0.01)。 t1WNfgitj qBg结论 1．DRG神经元膜上存在AVP V；受体和OT受体。 2．AVP和OT引起的超极化反应是通过神经无膜上AVP和OT受体介导的K”外流所致。 3．AVP和OT均可使DRG神经元膜产生超极化，对初级感觉信息的传入”具有一定的抑制作用，可能参与感龈息传入的调制。
魏小洁[2]2012年在《催产素对大鼠切割疼痛痛觉调制的作用及机制》文中研究表明目的观察大鼠后足切割后中枢神经系统内催产素的变化规律,腹腔、鞘内和侧脑室内给予外源性催产素对大鼠后足切割痛的痛觉调制作用,并用催产素受体阻断剂atosiban和阿片类受体阻断剂纳洛酮预先阻断相应受体,研究中枢内催产素痛觉调制作用与这两种受体间的关系,探讨其简单作用机制。方法1.雄性SD大鼠随机分为切割痛组和空白对照组,切割痛组按照Brennanl996年介绍的方法建立大鼠后足切割痛模型,空白对照组不做任何处理。切割痛组大鼠在切割后的30min、1h、3h、6h和24h取脊髓腰膨大和脑进行免疫荧光检测OT、OTR阳性细胞表达,取背角和PVN行Western-blot以及RT-PCR测定,检测OT. OTR转录和蛋白表达变化。2.雄性SD大鼠随机分为3组：腹腔注射组、鞘内注射组、侧脑室注射组；腹腔注射组分为100μl生理盐水、0.5nmol、1nmol和2.5nmol四个剂量组,鞘内注射组和侧脑室注射组分为10μl(5μl)生理盐水、0.05nmol、0.1nmol和口0.25nmol四个剂量组。腹腔注射组大鼠在注射后的30min、1h、3h、6h、12h、24h,鞘内和侧脑室内注射大鼠在注射后的10min、30min、1h、3h、6h、12h、24h进行机械性痛阈测定。3.雄性SD大鼠随机分为2大组：鞘内注射组、侧脑室注射组。每个大组又分为如下小组：①生理盐水+OT0.05nmol组；②生理盐水+OT0.1nmol组；③生理盐水+OT0.25nmol组；④tosiban1.0nmol+OT0.05nmol组；⑤atosiban1.0nmol+OT0.1nmol组；⑥atosiban1.0nmol+OT0.25nmol组；⑦纳洛酮0.5μg+OT0.05nmol组；⑧纳洛酮0.5μg+OT0.1nmol组；⑨纳洛酮0.5μg+OT0.25nmol组。各组大鼠在切割给药后的10min、30min、1h、3h、6h、12h、24h进行机械性痛阈测定,检测其变化情况。结果1.切割痛大鼠与空白对照组大鼠相比,在切割后的30min开始持续至至少6h PVN内的OT阳性细胞数量明显下降,WB显示在该时间段内PVN内的OT蛋白总量明显下降,而mRNA却在切割后的30min至1h内升高；脊髓腰膨大背角Ⅰ、Ⅱ板层内OT阳性细胞数和蛋白表达量在切割后的30min至6h开始上升,而RT-PCR显示在脊髓腰膨大处无OT m RNA出现；无论切割前后PVN内均未见OTR的表达,而脊髓腰膨大背角Ⅰ、Ⅱ板层内OTR在切割后30min至至少12h表达上升。2.腹腔注射0.5nmol、1nmol或2.5nmolOT对大鼠切割痛足机械痛阈无影响；侧脑室内注射0.05nmol、0.1nmol或0..25nmolOT对大鼠切割痛足机械痛阈有剂量依赖性地提高,其持续时间从给药后10min至6h；鞘内给药同样会使切割痛大鼠产生剂量依赖性机械痛阈增强；侧脑室和鞘内注射OT对切割痛的镇痛作用均有封顶作用。3.鞘内和侧脑室内预注射atosiban都可以阻断OT对切割痛的镇痛作用,且增加OT剂量并不能逆转该效应；而鞘内和侧脑室内预注射纳洛酮可以部分阻断OT的镇痛作用,OT剂量增加时该阻断作用减弱,在OT剂量达到0.25nmol时其镇痛作用再次出现。结论1.切割痛大鼠PVN内OT转录增加而蛋白表达减少,脊髓内OT虽无转录但蛋白表达增加,表明切割后PVN内合成的OT转运至脊髓和(或)其他位置发挥痛觉调制作用。2.无论切割与否大鼠PVN内OTR表达均阴性,而切割后腰膨大背角浅层内的OTR表达增加,表明PVN本身痛觉调制作用不大,而脊髓可能更为重要。3.腹腔注射OT对切割痛无镇痛作用,而鞘内和侧脑室内注射OT均能产生剂量依赖的镇痛作用。4.鞘内和侧脑室内预注射atosiban对能完全阻断OT的镇痛作用,而预注射纳洛酮则不能完全阻断。表明OT的镇痛作用主要通过OTR发挥,同时部分作用于阿片受体。
李静[3]2014年在《缩宫素对正常及TNBS结肠炎模型大鼠肠道敏感性的影响及其机制》文中提出第一部分缩宫素对正常大鼠肠系膜传入神经敏感性及内脏痛觉的影响目的：缩宫素(Oxytocin, OT)是一种由含二硫键的九肽激素,广泛存在于中枢神经系统和外周器官。我们近些年的研究发现,OT是消化道的一种内源性神经肽,调节消化道的运动和分泌等功能。OT在中枢和外周神经系统中发挥重要的镇痛作用。疼痛是很多功能性胃肠疾病的共同症状,临床缺乏有效的治疗手段。有研究提示OT能缓解肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)病人和内脏高敏感大鼠的疼痛症状,但机制不清。本研究的目的是探究OT对大鼠肠系膜传入神经机械和化学敏感性及内脏痛觉的影响,以期揭示OT在消化道传入神经水平的镇痛作用及其机制。方法：1.肠段准备与离体肠系膜传入神经放电记录大鼠2%戊巴比妥钠麻醉后,行腹正中切开术,游离长约2cm带有肠系膜血管的空肠段并固定于器官灌流浴槽。持续肠腔内外灌流并供给95%O2和5%CO2。肠段近心端与压力换能器相连以记录肠内压变化。拉出肠系膜血管束及结缔组织到外槽,分离肠系膜血管旁神经束和结缔组织,分别置于双极铂金记录电极。神经放电信号经CED前置放大器后经Micro1401系统输入电脑,用Spike2软件记录和分析。2.建立大鼠内脏高敏感模型将硅胶导管一端系有气囊,另一端与内脏扩张器相连。大鼠吸入异氟醚轻微麻醉后,将气囊自肛门插入结直肠内,使气囊末端深入肛门内1-2cm,固定硅胶管。每只大鼠接受1h结直肠扩张(Colorectal distension, CRD)刺激,即将气囊迅速充气至80mmHg,维持30s后放气,经30s间隔后再次充气,该充放气循环反复60次。3.痛觉敏感性的行为学测试内脏高敏感模型建立4h后,进行痛觉反应的行为学测试。通过梯度式CRD刺激,向囊内依次注射0.4ml、0.8ml、1.2ml和1.6ml的水,每次扩张持续20s,刺激间隔5min,反复2-3次,观察大鼠腹壁撤退反射(Abdominal withdraw reflex, AWR)并进行评分。4.统计分析实验过程中连续记录神经纤维的自发放电,并以3s为单位用直方图实时记录动作电位的放电频率。在某一特定时间段内放电次数最多的3s期间的放电频率称为放电峰值。在化学性刺激时,将加药后不同时间段放电峰值减去加药前120s内的放电峰值作为统计值,即标准化基础值(Baseline)为O。观察不同药物对肠内压的作用时,采取加入溶剂对照或药物刺激后120s内肠内压平均值减去加药前120s内平均值作为统计值。在机械扩张刺激时,将每升高10cmH2O作为一个区间,该区间内的肠神经放电频率平均值减去加药前120s的神经放电频率的平均值作为统计值。观察药物对机械扩张刺激的影响时,同时运用Spike2的模板匹配法则进行单根神经放电分析。在对痛觉敏感性的行为学测试中,取每个剂量AWR评分的均值进行统计分析。数据用均数±标准误(mean±SEM)表示。用One-way ANOVA后Dunnett's检验来分析多个实验组和一个对照组数据之间的差异。以P<0.05作为显着性差异的临界值。n代表每组中动物数量。结果：1.OT对大鼠肠系膜传入神经自发放电的影响待神经放电稳定10min后,向器官浴槽内的肠段浆膜面加入10-7M的OT,2min内肠系膜传入神经放电频率并没有发生改变,各时间段放电频率与对照组相比没有明显差异(P>0.05,n=6)。2.OT对肠系膜传入神经缓激肽(Bradykinin,BK)敏感性的影响向器官浴槽中的肠段浆膜面加入OT(10-8M,5×10-8M,10-7M和10-6M)孵育2min后发现,高浓度OT能够明显减弱BK诱发的传入神经放电频率增加,而低浓度OT则没有明显作用,OT的作用表现出浓度依赖性。加入10-7M和10-6M OT后,BK诱发的放电峰值与对照组(102.4±14.limp s-1)相比分别减少到44.9±6.8imp s-1(10-7M,P<0.05,n=6)和33.1士12.2imp s-1(10-6M,尸<0.05,,n=6),而低浓度(10-8M和5×10-8M)的OT对BK诱发的放电增多并没有显着作用(P>0.05,n=6)。在器官浴槽中加入OTR阻断剂atosiban(10-6M)预孵育10min后再加入OT(atosiban+OT+BK组),发现BK诱发的放电峰值较Vehicle+OT+BK组提高了118%(P<0.05,n=6),提示atosiban减弱OT抑制BK诱发传入神经放电的作用。3.OT和BK对肠内压的作用肠道浆膜面加入OT(10-7M)2min内,肠内压从1.7±0.2cmH20降低到1.2±0.1cmH20(P<0.05,n=6)；BK能也引起平均肠内压下降(P<0.05,n=6),所以BK诱发的神经放电增加与肠内压的变化无关。4.一氧化氮合酶(Nitro oxide synthetase,NOS)阻断剂对OT作用的影响为了验证OT是否通过一氧化氮(Nitro oxide,NO)介导其镇痛作用,我们观察了非特异性NOS阻断剂L-NAME对OT抑制BK诱发放电的影响。在器官浴槽中加入L-NAME(10-4M)预孵育10min,再依次加入OT和BK后发现BK诱发放电峰值较对照组提高了160%(P<0.05,n=6)。5.硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP)对肠系膜传入神经BK敏感性的影响为了研究NO对肠系膜传入神经BK敏感性的影响,我们向器官浴槽中加入NO供体SNP(4mM)预孵育5min,再加入BK,发现BK诱发放电峰值降低到22.8±4.6imp S-1,明显低于对照组的放电峰值(102.4±14.1imp s-1,尸<0.01,n=6).6.OT在传入神经对机械扩张刺激反应中的作用通过机械扩张肠段,观察肠内压逐渐升高60cmH2O的过程中传入神经放电的变化,对41根机械敏感性传入神经进行放电分析。其中12根(29.3%)为低阈值神经纤维,肠内压低于20cmH2O时放电频率达到最高；17根(41.4%)为高阈值神经纤维,肠内压升高超过高20cmH2O开始放电,升高60cmH2O放电达最高峰,一般认为这类纤维为脊神经中的内脏痛觉传入纤维；其余12根(29.3%)为宽阈值神经纤维,在低于20cmH20时放电增加,并在肠内压增高到60cmH2O放电频率达到最高。OT明显降低了高阈值神经纤维对机械扩张的反应(P<0.05)：但对其他种类神经纤维没有影响。7.OT对CRD诱发急性内脏痛的调节为了进一步检验OT对内脏痛觉的影响及机制,我们建立了内脏高敏感大鼠模型并研究OT对其痛觉敏感性的影响。腹腔注射OT (1mg kg-1)使大鼠对CRD1.2ml刺激的AWR评分从2.7±0.1显着降低至1.7±0.2(P=0.004,n=5)；而当CRD压力增高到1.6ml时,AWR评分从3.3±0.3下降至2±0.3(P<0.05,n=5)。用atosiban (0.5mg kg-1,i.p.)预处理后给予OT,CRD压力为1.2ml的AWR评分较给予OT时提高了82%(P<0.05,n=6)。用L-NAME (20mg kg-1,i.p.)预处理再给予OT,也能产生类似atosiban的作用(P<0.05,n=7)。结论：OT降低大鼠空肠肠系膜传入神经对BK和高压机械刺激的敏感性,下调内脏高敏感大鼠的痛觉,其中对BK敏感性的调节是通过激活NOS实现的,提示OT可能是消化道内重要的镇痛物质。第二部分nNOS-NO-KATp通路在OT抑制正常大鼠肠系膜传入神经对BK敏感性中的作用目的：大鼠肌间神经丛神经元表达OTR并分泌OT,因此OT是消化道的内源性神经肽,通过自分泌和旁分泌调节消化道功能。NO作为一种重要的气体分子参与外周镇痛作用,ATP敏感性钾通道(ATP-activated potassium channel,KATP channel)与NO介导的镇痛作用有关。OT能够升高肌间神经丛神经元胞内钙离子浓度,因此我们推测,OT可能激活肌间神经元内的神经元型一氧化氮合酶(Neuronal nitro oxide synthetase,nNOS),通过NO作用于KATP通道抑制肠系膜传入神经的敏感性。本部分就以上假设进行验证。方法：1.肠段准备与离体肠系膜传入神经放电记录同第一部分。2.组织内NO检测首先制备大鼠空肠纵行肌-肌间神经丛(Longitudinal muscle myenteric plexus,LMMP)标本。取大鼠空肠肠段置于铺有硅胶的操作皿中,持续通含95%O2和5%CO2的混合气体,镜下剥离肠段粘膜层、粘膜下层和环行肌层,余留的部分即为LMMP标本。每个样本取LMMP组织0.1g。将LMMP样本分为四组,在Krebs液中加入生理盐水或不同药物进行孵育分别是生理盐水(vehicle)、vehicle+OT(10-M)、atosiban(10-6M)+OT(10-7M)、NPLA(10-6M)+OT(10-7M)。先于Krebs液中加入生理盐水或阻断剂孵育10min,再加入OT继续孵育10min。组织匀浆后在4℃离心10min(2500rpm)。收集上清液,按照NO试剂盒说明配制各试剂及标准品,并进行测定。利用分光光度计在550nm波长处测定OD值,并按公式计算NO含量。3.荧光NO探针检测NOLMMP标本用木瓜蛋白酶(10mg ml-1)37℃消化后,Krebs液冲洗,置于含有DAF-FM(10-5M)的HBSS/HEPES混合溶液中37℃孵育1h。而后将LMMP移至加入不同试剂的混合溶液中,分别是生理盐水、OT(10-7M)或L-NAME(10-4M),孵育10min后再加入OT(10-7M)。冲洗后,4%多聚甲醛固定,75%甘油封片后在共聚焦显微镜下观察并拍照。4.免疫荧光叁重标记LMMP标本用4%多聚甲醛室温固定后,PBS洗3次,3%过氧化氢溶液孵育10min以去除内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗3次,10%的驴血清孵育1h以封闭非特异性染色。以上步骤均在室温进行。分别加入待定位蛋白的一抗混合液4℃孵育12-16h,PBS冲洗3次,加入相应荧光二抗混合液室温下孵育2h后,75%甘油封片后在共聚焦显微镜观察并拍照。5.统计分析同第一部分。结果：1. nNOS特异性阻断剂NPLA对OT作用的影响在器官浴槽中加入NPLA(10-6M)预孵育10min,再依次加入OT和BK后BK诱发放电峰值较对照组提高了230%(P<0.05,n=6),该结果与第一部分L-NAME的作用类似,说明OT可能主要通过激活nNOS抑制肠系膜传入神经对BK的敏感性。2.OT对空肠LMMP组织中NO水平的影响以上实验表明OT可能通过nNOS增加NO的生成,从而抑制BK诱发的放电。为验证该假设,我们进一步采用化学和荧光探针两种技术检测OT对LMMP组织内NO水平的影响。加入OT(10-7M)孵育10min,空肠LMMP中NO含量较基础值(3.3±0.6μmol g-1protein)提高了170%(P<0.01,n=8),而OTR阻断剂atosiban(10-6M)或NPLA(10-6M)均可明显减弱OT的这种作用(P<0.05,n=8)。用NO荧光探针技术发现在LMMP中NO阳性颗粒主要位于神经元的胞体,加入OT(10-7M)孵育10min,LMMP神经元上NO荧光强度明显增高,而经阻断剂L-NAME(10-4M)预孵育后,再加入OT,NO荧光强度较OT组明显减弱。3. Calbindin28K、nNOS和OTR在LMMP神经元上的表达在最近的一项研究中我们发现在肌间神经丛的钙结合蛋白(Calbindin28K)阳性神经元上表达OTR,且后者被激活后使钙离子内流增加。由于nNOS的激活依赖钙离子,结合以上的实验结果,我们推测OTR可能通过升高细胞内钙离子浓度激活肌间神经丛中的nNOS.为了检验该假设,我们首先对LMMP上表达Calbindin28K.nNOS和OTR的神经元分别进行了计数,发现其中有74.2%(63/93)calbindin阳性的初级感觉神经元同时表达nNOS和OTR。4.ω-Agatoxin IVA和ω-conotoxin GVIA对OT作用的影响经P型钙通道特异性阻断剂ω-Agatoxi IVA(3×10-8M)孵育后加入OT作用2min,发现BK诱发的肠系膜传入神经放电峰值由对照组的28.9±10.8imp s-1增高至87.9±7.4imp s-1(P<0.05,n=6),说明OT对传入神经BK敏感性的抑制得到部分逆转；经N型钙通道特异性阻断剂-conotoxin GVIA(10-7M)孵育后依次加入OT和BK,发现BK诱发放电峰值曲50.3士11.9imp s-1增高至106.3±20.3imp s-1(P<0.05,n=6),说明OT的作用也部分得到逆转。5.格列本脲对OT作用的影响KATP通道阻断剂格列本脲(Glibenclamide,10-6M)预孵育10min后,再加入OT,BK诱发放电峰值较对照组(23.9±11.7imp s-1)有明显增高(59.1±9.1imp s-1,P<0.05,n=6),说明OT对传入神经BK敏感性的抑制可能是通过开放KATP通道实现的。结论：OT激活肠肌间神经系统内感觉神经元的nNOS,释放的NO可能作用于传入神经纤维末梢KATP通道,从而降低传入神经对BK的敏感性。第叁部分OT对TNBS结肠炎模型大鼠肠道局部炎症和内脏痛觉的影响及其机制目的：炎症性肠病(Inflammatoryboweldisease, IBD)是一种肠道慢性复发性疾病,其发病机制尚不明确且临床缺乏有效的治疗方法。越来越多的证据表明免疫系统在IBD的发病和进展中发挥了重要作用；肥大细胞参与了包括IBD在内的各类炎症性胃肠疾病的发病过程；OT除了具有经典的生理功能外,还在某些病理条件下发挥保护作用如促进胃溃疡愈合、提高缺血性皮瓣的存活率等,并且OT类似物可抑制小鼠肠道高敏感；在小鼠腹腔和子宫的肥大细胞上均有OTR表达,因此我们假设OT可能通过抑制肠道肥大细胞的脱颗粒抑制TNBS诱发的肠道炎症反应和内脏高敏感性。方法：1. TNBS诱导肠炎模型建立与分组采用Morris等报道的2,4,6-叁硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)诱导结肠炎改良技术,将5%TNBS0.6ml溶于无水乙醇0.2m1(后者用于破坏粘膜屏障)备用,相当于30mg TNBS溶于25%(v/v)酒精。大鼠灌肠实验前一天16：00pm开始禁食自由禁水,次日8：00开始灌肠。灌肠前轻揉大鼠腹部,使其尽可能排尽残余粪便。腹腔注射10%水合氯醛(0.3g kg-1),待大鼠麻醉后,将聚乙烯导管轻柔经肛门送入肠道,至导管前端距肛门约8cm处。分别抽取生理盐水或配好的TNBS溶液通过导管缓慢注入至结肠肠管内。使大鼠头部向下,维持大鼠倒立状态10min,以防药物反流。观察其生命体征无异常后,放入饲养笼内,灌肠后4h进行喂食,不限制饮水。1.1在研究OT对结肠局部炎症作用的实验中,将实验动物随机分为3组：(1) Control组,生理盐水灌肠。生理盐水灌肠后第1天开始每天给予生理盐水灌肠至第7天。(2) TNBS+Saline组,TNBS灌肠后第1天开始每天给予生理盐水灌肠至第7天。(3) TNBS+OT组,TNBS灌肠后第1天开始每天给予OT灌肠(1mg kg-1)至第7天。1.2在研究炎症对大鼠内脏敏感性影响的实验中,将实验动物随机分为2组：(1) Vehicle组,生理盐水灌肠。(2) TNBS组,TNBS灌肠。1.3在研究OT对肠炎模型大鼠内脏敏感性影响的实验中,将实验动物随机分为3组：(1) Control组,TNBS灌肠后第1天开始每天给予生理盐水灌肠至第7天。(2) Vehicle+OT组,TNBS灌肠后第1天开始每天先给予生理盐水灌肠,30min后给予OT (1mg kg-1)灌肠至第7天。(3) Atosiban+OT组,TNBS灌肠后第1天开始每天先给予atosiban(0.5mg kg-1),30min后给予OT(1mg kg-1)灌肠至第7天。2.一般情况观察大鼠灌肠实验后,每天观察大鼠的一般状况,包括精神、活动、饮食、毛发光泽、大便性状等。分别称量大鼠灌肠前和灌肠后第7天的体重并进行比较。镜下检测大便红细胞数时,高倍镜下(×400)视野内红细胞数>10者为阳性。3.结肠粘连程度及炎症损伤的宏观形态评价结肠与周围组织粘连评分：大鼠灌肠后第7天,给药后2h以2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉大鼠后,处死动物,作腹正中剖开术,观察结肠与周围组织粘连情况。肉眼观察炎症损伤宏观形态评分：观察结肠与周围组织粘连情况后,取出距肛门8cm处至肛门之间的结肠组织,沿肠系膜剖开,粘膜面向上平铺固定。肉眼观察结肠损伤的严重程度并拍照,进行评分。测量结肠重量：肉眼观察结肠损伤严重程度后,称量记录结肠组织湿重。4.HE染色及炎症损伤的组织形态学评分在距肛门2.5cm、5cm及7.5cm处取结肠组织,10%甲醛固定,常规石蜡包埋,连续4μm切片,常规HE染色。每个组织块选取3张切片,每张切片随机选取3个视野,观察炎症浸润,坏死及再生程度。对肠道炎症程度进行评分,各视野评分的平均值为该组织最终炎症评分。5.髓过氧化物酶(MPO)活性检测称量结肠组织湿重,制备5%组织匀浆,不离心。将组织匀浆按照MPO试剂盒说明书加样,取出后立即在460nm处测吸光度,而推算MPO活性。6.肥大细胞甲苯胺蓝染色结肠粘膜肥大细胞染色采用甲苯胺蓝改良染色法。石蜡切片经0.5%甲苯胺蓝溶液染色20min后蒸馏水漂洗,用0.5%冰醋酸分色1min至肥大细胞颗粒呈紫色。蒸馏水漂洗后吹干,中性树胶封片。置于镜下观察并拍照,每张切片随机选取10个高倍视野(×400)肥大细胞数量的总和作为统计值。7.OTR免疫组织化学染色石蜡切片滴加羊抗大鼠OTR一抗,4℃孵育过夜,滴加二抗,DAB显色,中性树脂胶封片。显微镜下观察拍照并进行分析。8.OT的检测每只大鼠取0.1g远端结肠,0.1M PBS冲洗。加入1ml0.1M PBS制备匀浆,然后置于-20℃过夜,反复冻融2次,将组织匀浆于2-8℃5000g离心5min取上清液。用大鼠OT试剂盒按照说明书进行测定。9.痛觉敏感性的行为学测试同第一部分。10.组胺的检测根据之前报道的方法检测结肠自发释放的组胺浓度。取约0.1g结肠组织置于含有2ml Hanks液中,持续通95%O2/5%CO2,维持37℃。孵育25min后,吸出200μl移至95℃加热7min,以防止组胺酶快速变性；离心后吸取清液备用；最后称量组织干重；利用大鼠组胺高选择性酶联免疫试剂盒测定上清液中组胺含量。11.统计分析数据用均数±标准误(mean±SEM)表示。用One-way ANOVA后Dunnett's检验来分析多个实验组和一个对照组数据之间的差异。以P<0.05作为显着性差异的临界值。n代表每组中样本数量。结果：1.OT对结肠炎模型大鼠一般情况的影响在制作模型期间,Control组大鼠活泼,毛发有光泽,大便成形,潜血阴性,体重增加。TNBS+Saline组大鼠第3天时大便频率开始增加,大便不成形或稀便,精神萎靡、竖毛、懒动、厌食,第7天时大鼠出现大便镜下红细胞阳性或肉眼血便,大多数大鼠肛门粘有粪便,偶见血便。大鼠体重增加量从47.7g±5.7g(Control组,n=7)明显减少至25.7g±6.7g(TNBS+Saline组,P<0.05,n=9)。TNBS灌肠后连续7天进行OT(1mg kg-1)灌肠,发现OT能明显改善上述症状,大鼠大便可成形,第7天时仅少数大鼠出现大便红细胞阳性,并无肉眼血便,灌肠7天后大鼠体重增加量也较TNBS+Saline组提高了40.6%。2.OT对结肠粘连程度、宏观形态和结肠湿重的影响灌肠后第7天,Control组大鼠结肠没有发生粘连,而在大多数TNBS+Saline组大鼠中出现结肠浆膜与邻近器官发生多处粘连,TNBS+Saline组结肠的粘连程度评分明显高于Control组大鼠(P<0.05),而TNBS+OT组粘连程度评分较TNBS+Saline组有所下降(P<0.05)。肉眼观察大鼠结肠粘膜变化发现,Control组大鼠粘膜完整光滑、无溃疡；TNBS+Saline组结肠粘膜充血水肿,有溃疡形成,病变部位发生狭窄；TNBS+OT组中的结肠粘膜溃疡面积明显减小。造模后第7天TNBS+Saline组的结肠宏观损伤评分显着高于Control组(P<0.05),当连续给予OT灌肠7天后,宏观损伤评分与TNBS+Saline组相比明显下降(P<0.05)。·称量结肠湿重可以作为炎性水肿、肠壁增厚的间接指标。TNBS+Saline组大鼠结肠段湿重与Control组(0.5±0.04g)相比,显着增加(1.3±0.3g,P<0.05)；TNBS+OT组的结肠湿重则降低至0.9±0.3g(P<0.05)。3.OT对结肠组织形态学表现的影响造模后第7天取结肠组织做石蜡切片HE染色,观察结肠局部炎症的组织形态学表现。TNBS诱导结肠炎症表现为粘膜腺体排列变形、水肿,可见上皮剥落、炎性渗出物,主要表现为中性粒细胞浸润、坏死和再生。TNBS+Saline组与Control组相比炎症组织学表现显着,形态学评分由0.28±0.1显着增高至6.8±0.7(P<0.01,n=9),而给予OT处理后与TNBS+Saline组相比结肠组织炎症表现明显减轻,形态学评分降低(P<0.05,n=9)。4.OT对结肠组织内MPO活性的影响用生理盐水或TNBS灌肠后第7天,对结肠组织MPO活性进行了检测。TNBS+Saline组大鼠结肠组织的MPO活性比Control组明显增高(P<0.05,n=9)。经OT连续灌肠7天后,结肠组织的MPO活性比TNBS+Saline组显着降低(P<0.05,n=9)。5.OTR在结肠粘膜肥大细胞的表达及炎症对OT表达的影响通过在结肠标本同一部位相邻的石蜡切片上分别用甲苯胺蓝染色和免疫组化方法标记肠粘膜肥大细胞和OTR。结果显示,用甲苯胺蓝标记肥大细胞的部位同时发现有OTR免疫阳性神经元,并且当用同一切片先用免疫组化染色标记OTR而后用甲苯胺蓝标记的切片上发现部分甲苯胺蓝标记上肥大细胞上表达OTR,说明消化道肥大细胞上表达OTR。OT和OTR在整个胃肠道中都有表达,所以OT可能通过自分泌途径来减轻炎症反应。TNBS灌肠后第7天,TNBS组结肠局部OT浓度较Vehicle组明显增加,说明急性炎症时肠道内源性OT信号系统被激活。6. TNBS对大鼠肠道后内脏敏感性的改变及OT对结肠炎内脏高敏感的影响。首先采用梯度式CRD技术观察TNBS诱导的大鼠结肠炎后肠道感觉敏感性的变化。TNBS灌肠后第7天,行梯度式CRD。当向气囊内注射0.8ml水时,TNBS模型组的AWR评分与Vehicle组评分相比增高了47.1%(P<0.05,n=6)；当注射1.2ml或1.6ml水时,TNBS组评分比Control组分别增高了29.6%和29.1%(P<0.05,n=6)。之后观察了OT是否影响TNBS肠炎大鼠对梯度式CRD刺激的AWR评分。当分别注射0.8ml,1.2ml(?)1.6ml水时,经OT处理后的大鼠与模型大鼠相比AWR评分明显降低(P<0.05,n=6)。经OTR阻断剂atosiban(0.5mg kg-1)预处理后行OT灌肠组的AWR评分分别增长66.7%(1.2m1)和60%(1.6ml),明显高于Vehicle+OT组(P<0.05,n=6)。7.OT对结肠粘膜肥大细胞数量和组胺释放的影响在高倍镜下可观察到经甲苯胺蓝染色后的肥大细胞颗粒呈蓝紫色；发生脱颗粒时蓝紫色颗粒从细胞内释放至细胞外周。TNBS灌肠后第7天,TNBS+Saline组(n=9)结肠粘膜中甲苯胺蓝染色阳性的肥大细胞数量与Control组相比显着降低(P<0.05,n=7)。经OT灌肠处理后,发现肠炎模型大鼠(TNBS+OT组)中粘膜肥大细胞的数量有所增加(P<0.05,n=9)。组胺可以作为肥大细胞脱颗粒的特异性标记物。通过酶联免疫法检测组胺释放量,结果发现TNBS+Saline组(n=9)大鼠结肠释放的组胺浓度比Control组(n=7)增加了44%(P<0.05)；而给予OT处理后炎症结肠组织组胺的释放量与TNBS+Saline组相比降低了30.7%(P<0.05,n=9)。结论：1.结肠粘膜肥大细胞上有OTR的表达,同时TNBS诱发肠道局部OT浓度增高,说明OT作为肠道的内源性神经肽,参与并调节炎症的发生和发展过程。2.外源性OT抑制TNBS诱发的肠道炎症、结肠高敏感性和肥大细胞脱颗粒,说明抑制肥大细胞脱颗粒可能是OT抑制大鼠肠道炎症和内脏高敏感的重要机制之一。
参考文献：
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[2]. 催产素对大鼠切割疼痛痛觉调制的作用及机制[D]. 魏小洁. 中南大学. 2012
[3]. 缩宫素对正常及TNBS结肠炎模型大鼠肠道敏感性的影响及其机制[D]. 李静. 山东大学. 2014
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