王静[1]2016年在《血清胆红素水平与2型糖尿病及其并发症发生的关联研究》文中研究说明糖尿病目前已经成为世界范围的严重公共卫生问题,2015年全球约有4.15亿糖尿病患者。而中国已成为糖尿病患者最多的国家,成人患者约有1亿960万,卫生支出约为510亿美元。糖尿病的流行,给中国了造成沉重的医疗和经济负担,而糖尿病中,大约90%的比例为2型糖尿病。2型糖尿病的病理生理机制复杂,氧化应激在其中起到重要作用。长期的高血糖导致氧化应激,直接损伤生物大分子,还可以通过影响各种细胞信号传导途径和诱导炎症,导致胰岛素抵抗、p细胞功能受损和大血管及微血管损伤,进而影响糖尿病及并发症进程。胆红素是血红素代谢的主要产物,是一种较强的内源性抗氧化剂。胆红素可以消耗氧化应激产物,减轻氧化损伤；同时胆红素还可以通过影响促炎反应,产生抗炎抗凋亡作用。实验研究已发现胆红素可以保护p细胞,增强胰岛素敏感性,减轻血管反应。较多的人群横断面研究发现血清胆红素水平与2型糖尿病及并发症负相关,但前瞻性研究的证据很少,且结果并不一致。另一方面,胆红素的水平受遗传影响,与基因多态性有关。本课题组前期有关血清胆红素水平的全基因组关联研究(Genome wide association study, GWAS)发现尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UDP-Glucuronosyltransferasel A1, UGT1A1)和溶质载体有机阴离子转运蛋白1B3(solute carrier organic anion transporter 1B3,SLCO1B3)基因多态性对中国人群的血清胆红素水平有显着影响。最近有孟德尔随机化研究认为白种人中的iUGT1A1基因多态性与2型糖尿病发生有因果关系。但目前有关2型糖尿病的多个GWAS研究并没有发现SLCO1B3和UGT1A1与糖尿病发生有关,且白种人的结果并不适于中国人群。因此在中国人群中,血清胆红素水平是否与2型糖尿病发生有关；胆红素相关基因多态性是否通过影响胆红素水平与2型糖尿病发生因果关联；同时,高的血清胆红素水平对糖尿病患者的大血管及微血管并发症是否有保护作用仍需要进一步研究。为了回答上述问题,本研究以东风-同济队列2008年基线资料为基础,根据2013年第一次随访得到的指标变化及疾病结局,同时,结合课题组前期血清胆红素水平的GWAS的基因分析结果,对叁种血清胆红素与2型糖尿病及其并发症(冠心病和糖尿病肾病)的发生进行了分析,主要内容分为如下叁部分：第一部分血清胆红素水平与2型糖尿病的关联研究第一节血清胆红素水平与2型糖尿病患病关联—横断面分析目的：在中国中老年人群中探讨叁种血清胆红素水平与2型糖尿病患病的关系,为进一步探索血清胆红素是否能成为2型糖尿病发病风险生物标志物提供科学依据。方法：选择东风-同济队列2008年基线人群中血清胆红素和血糖检测有效,尿胆原和尿胆红素正常,总胆红素水平低于34.2μmol/L,无自报肝病、恶性疾病,肝功能相对正常的对象共19,259人。采用问卷调查收集研究对象人口学资料、疾病史、家族史、生活习惯等信息。采用全自动生化仪检测血清胆红素、血糖、血脂、肝肾功能等。2型糖尿病患者被定义为：空腹血糖≥7.0 mmol/L,和/或使用降糖药物,和/或自报患有被医生诊断的糖尿病。采用多元Logistic回归模型分析研究对象罹患2型糖尿病风险。结果：研究人群糖尿病患病率为18.5%,总胆红素、直接胆红素和间接胆红素水平分别为13.3 (10.4-17.0)、3.8 (3.1-4.6)、9.5 (7.2-12.4)μmol/L在校正了年龄、性别、体质指数、中心性肥胖、教育、吸烟、饮酒、锻炼、家族糖尿病史、肝功能、疾病史(高血压、冠心病、中风)后,血清总胆红素水平在第2-3四分位数的个体相对于第1四分位数个体2型糖尿病的比值比(Odd ratios, ORs)和95%置信区间(confidence intervals, CIs)分别为0.88(0.74-1.03)、0.78(0.67-0.92)、0.82(0.69-0.96), Ptrend=0.01;在直接胆红素中分别为0.86(0.73-1.01)、0.75(0.63-0.88)、0.74(0.62-0.88), P trend< 0.001;在间接胆红素中为0.87(0.74-1.02)、0.77(0.66-0.91)、0.84(0.71-0.99), P trend= 0.025。与空腹血糖正常的研究对象相比,叁种血清胆红素水平在空腹血糖受损人群中略有升高,在新发糖尿病病人中最高(所有P≤0.05),在糖尿病现患病人中,叁种血清胆红素水平随着糖尿病病程延长逐渐降低,在糖尿病病程>10年的对象中达到最低(与空腹血糖正常对象相比,所有P<0.001)。结论：我们首次在中国中老年人群中进行了叁种血清胆红素与2型糖尿病患病关联的研究。发现血清总胆红素与2型糖尿病风险负相关,同时也发现直接胆红素和间接胆红素与2型糖尿病风险呈负相关。与既往研究不同,我们发现血清胆红素与人群血糖代谢状态有关：在糖尿病前期及新发糖尿病患者中,叁种血清胆红素是升高的；在糖尿病现患人群中,胆红素水平随着糖尿病病程的延长而降低。由于横断面研究的局限性,血清胆红素与2型糖尿病风险关联如何,还需要前瞻性研究提供深入证据。第二节血清胆红素水平与2型糖尿病发生关联—前瞻性分析目的：探讨叁种血清胆红素水平与2型糖尿病发生的关联,评价血清胆红素水平是否可以成为2型糖尿病发病风险的生物标志物。方法：在第一节横断面研究的基础上,我们排除2008年基线患有糖尿病、冠心病或中风的个体,进一步排除失访对象,纳入12,530个研究对象进行2型糖尿病发病的前瞻性分析。2013年随访问卷与基线问卷相似,血样采集、血糖、血脂、肝肾功能等指标检测也与08年方法相同。2型糖尿病患者被定义为：空腹血糖≥7.0mmol/L,和/或使用降糖药物,和/或在随访期内自报患有被医生诊断的糖尿病。采用Cox比例风险模型计算2型糖尿病的风险比(hazard ratio, HR)和95%CI。同时,我们基于新加坡华人健康研究(Singapore Chinese Health Study, SCHS),采用巢式病例对照设计,选择509对性别、年龄匹配的病例和对照,采用条件Logistic回归分析计算OR和95%CI。结果：在东风-同济队列中,平均4.5年的随访期内总共观察到772个2型糖尿病新发病例。在血清直接胆红素中,与处于最小四分位数的个体相比,最高四分数位个体发生2型糖尿病的风险比为1.29 (95%CI,1.03-1.61;Ptrend=0.03)。在SCHS中,我们观察到相似的结果：血清直接胆红素中,最高叁分位数个体相对最低叁分位数个体发生2型糖尿病的OR为1.63 (95%CI,1.03-2.58;Ptrend-0.02)。在两个队列中,血清总胆红素和间接胆红素和2型糖尿病的发生均没有统计学关联。结论：通过两个前瞻性的队列研究,我们发现血清直接胆红素水平升高,可以增加中国中老年人群2型糖尿病发生风险。第叁节血清胆红素相关基因多态性与2型糖尿病的关联目的：胆红素相关基因多态性影响血清胆红素水平,但是这种基因多态性是否与中国人群2型糖尿病发生有因果关系,值得进一步探讨。方法：我们基于东风-同济队列全基因组关联研究的数据,选择UGT1A1基因rs6742078和SLCO1B3基因rs2417940在9,502人中进行分析。利用广义线性模型比较不同基因型的血清胆红素水平,采用多元非条件Logistic回归分析单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)与2型糖尿病的关联。结果：UGT1A1基因rs6742078和SLCO1B3基因的rs2417940与人群血清胆红素水平有关：rs6742078 CC型的对象叁种血清胆红素水平均低于CA和AA型,AA型对象血清胆红素水平最高。rs2417940CC型对象胆红素水平最低,其次是CT杂合型,而TT纯合型对象血清胆红素水平最高。但rs6742078和rs2417940与2型糖尿病风险关联没有统计学意义。结论：UGT1A1和SLCO1B3基因多态性显着影响中国中老年人群的血清胆红素水平,但与人群2型糖尿病发病风险无关。胆红素相关基因多态性与2型糖尿病的关联需要纳入更多的基因位点进行分析,在更大范围和不同种族的人群中确认。第二部分血清胆红素水平与2型糖尿病患者发生冠心病的关联目的：探讨叁种血清胆红素水平与2型糖尿病患者冠心病(coronary heart diseage, CHD)发病风险的关联,分析相关影响因素,为2型糖尿病患者并发CHD的预防及控制提供科学依据。方法：我们选择东风-同济队列2008年血清胆红素测量有效的糖尿病患者,在排除基线自报冠心病、中风、恶性疾病、肝病等疾病的对象及2013年失访对象后,共2,918例糖尿病患者纳入分析。相关指标检测、糖尿病患者的确认及信息收集见第1部分。采用WHO标准结合冠脉造影检查诊断冠心病,采用Cox比例风险模型计算CHD的HR和95%CI。结果：在随访期内(12,017人年)共发生440个CHD病例。在总胆红素中,校正了性别、年龄、BMI、腹型肥胖、教育水平、吸烟、饮酒、运动、CHD家族史、高血压病史、高脂血症病史、肝功能、收缩压、降压药的使用、甘油叁酯、高密度脂蛋白、降脂药的使用、空腹血糖、降糖药的使用及糖尿病病程后,与Q1相比,处于Q2-4分位的个体发生CHD的HRs(95%CIs)分别为0.95(0.72-1.25),0.89(0.68-1.17)和0.80(0.60-1.06),Ptrend=0.10:在间接胆红素中为0.78(0.60-1.03),0.84(0.64-1.10)和0.75(0.56-0.99),Ptrend=0.08,虽然线性趋势处于临界水平,但间接胆红素水平处于最高分位水平的个体与最低分位的个体相比,发生CHD的风险显着降低(P=0.044)；而在直接胆红素中,Q2-4分位的个体的对应的HRs(95%CIs)分别为0.65(0.50-0.86),0.79(0.60-1.04)和0.77(0.58.1.02),Ptrend=0.24.饮酒可能与总胆红素和间接胆红素在糖尿病患者CHD发生中产生交互作用(Pinteraction=0.021和0.037),这种交互作用在直接胆红素中未观察到。结论：2型糖尿病患者中,血清间接胆红素水平较高的个体相对于那些胆红素水平较低的个体CHD的发病风险更低,这种负向关联独立于其他CHD传统危险因素,而且在饮酒者中更加明显。第叁部分 血清胆红素水平与糖尿病肾病的关联目的：探讨叁种血清胆红素水平与糖尿病肾病(Diabetic kidney disease, DKD)发生风险的关联,分析相关影响因素,为DKD的预防及控制提供科学依据。方法：我们选择东风-同济队列2008年血清胆红素、肌酐测量有效的糖尿病患者,在排除患恶性疾病、肝脏疾病的对象及2013未检测肌酐或基线估计的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)<60 ml min-1 1.73 m-2的对象后,共2,958人纳入分析。相关指标检测、糖尿病患者的确认及信息收集见第1部分。研究终点定义为在5年随访期间eGFR下降≥30%,出现此结局的对象被视为发生DKD。采用广义线性模型计算相对危险度(relative risk, RR)及其95%CI。结果：在5年的随访期中,2,958例糖尿病患者中有330个eGFR下降超过30%,发生率约为11.5%。在调整了性别、年龄、腹型肥胖、教育水平、吸烟、饮酒、运动、收缩压、甘油叁酯、高密度脂蛋白、降压药物使用、降脂药物使用、肝功能、空腹血糖,降糖药物使用及糖尿病病程后,血清总胆红素水平第二和最大叁分位数与最小叁分位数相比,RR(95 %CI)分别为0.83 (0.64-1.09),0.75 (0.56-0.99), Ptrend=0.04。在间接胆红素中,我们观察到了类似关联：在完全校正模型中,与最低叁分位个体比较,第2叁分位和最大叁分位个体发生DKD的RR(95%CI)分别为0.74(0.57-0.97)和0.75 (0.57-0.98), Ptrend= 0.04.但是,直接胆红素水平与DKD发生的关联没有统计学意义。吸烟和总胆红素及间接胆红素在DKD发生中有交互作用(Pinteraction=0.01和0.02),这种交互作用在直接胆红素中未观察到。结论：血清总胆红素和间接胆红素水平升高,对DKD发生有保护作用,并独立于其他传统的DKD危险因素。吸烟者中高水平的胆红素对DKD的保护作用更加明显。
吴永刚[2]2016年在《复方芪麻胶囊对高血压血管内皮保护机制及应用研究》文中研究指明第一部分 临床研究目的：通过临床观察复方芪麻胶囊对气虚痰浊型高血压患者中医症状积分、血压、血流介导的内皮依赖性舒张功能(FMD)、血管紧张素Ⅱ及内皮微颗粒(EMPs)水平的影响,探讨复方芪麻胶囊的临床降压疗效及其对高血压患者的血管内皮保护作用。方法：选取1级、2级气虚痰浊型原发性高血压患者80例,随机分为对照组及治疗组各40例,对照组予以硝苯地平控释片口服,治疗组在对照组基础上加用复方芪麻胶囊口服,疗程均为2个月。观察治疗前后患者中医症状积分、血压、肱动脉血流介导的舒张功能(FMD)、血管紧张素II (AngⅡ)及血浆内皮微颗粒水平(EMPs)的变化。结果：(1)共有74例患者完成研究,其中对照组36例,治疗组38例,治疗前两组患者在性别、年龄、病程、血压级别、中医症状积分、FMD、AngⅡ及EMPs水平方面比较,差异无统计学意义(P>O.05)。(2)两组在改善中医症状积分方面比较：治疗后,两组中医症状积分均较治疗前显着下降(P<O.05),治疗组中医症状积分差值及总有效率显着高于对照组(P<O.05)。(3)两组的降压疗效比较：治疗后,两组SBP及DBP均较治疗前显着下降(P<0.05)；治疗组患者治疗前后SBP差值(即SBP下降幅度)显着高于对照组(P<0.05),DBP下降幅度则无显着差异(P>0.05)。(4)两组对FMD影响的比较：两组FMD水平均较治疗前显着上升(P<0.05),但治疗组FMD水平的升高程度显着高于对照组(P<O.05)。(5)两组对AngⅡ水平影响的比较：与治疗前相比,对照组AngⅡII平无显着变化(P>O.05)；治疗组的AngⅡ水平较治疗前显着下降且下降程度也显着高于对照组(P<0.05)。(6)两组对血浆EMPs水平影响的比较：两组EMPs水平均较治疗前显着下降(P<0.05),但治疗组EMPs水平的下降程度显着高于对照组(P<0.05)。结论：(1)复方芪麻胶囊不仅能够降压,而且可以改善气虚痰浊型高血压患者的临床症状；(2)复方芪麻胶囊具有降低内皮损伤因子EMPs及AngⅡ的能力,以发挥保护内皮功能的作用。第二部分实验研究实验一：复方芪麻胶囊对高血压大鼠血管内皮损伤的作用机制研究目的：观察复方芪麻胶囊对自发性高血压大鼠血压、血管内皮活性物质(NO、ET-1及AngⅡ)、氧化应激相关因子(SOD及MDA)和主动脉血管内皮形态学的影响,探讨复方芪麻胶囊对高血压血管内皮发挥保护作用的可能机制。方法：随机将50只14周龄的自发性高血压大鼠(SHR)分为SHR组(给予蒸馏水,10ml/Kg/d)、硝苯地平组(硝苯地平,2.7mg/Kg/d)、硝苯地平+芪麻组(硝苯地平,2.7mg/Kg/d+复方芪麻胶囊,0.9288g/Kg/d)、芪麻高剂量组(复方芪麻胶囊,3.7125g/Kg/d)和芪麻低剂量组(复方芪麻胶囊,0.9288g/Kg/d),每组10只,以WKY大鼠10只作为正常对照(给予蒸馏水,10ml/Kg/d),每日灌胃一次,各组大鼠在初次给药前及给药后每2周分别采用无创尾动脉测压法进行测压,给药时间为8周。8周后,进行腹主动脉取血,收集并检测血清中NO、ET-1、AngⅡ、SOD和MDA的水平。取lcm长的主动脉组织行HE染色并于倒置显微镜下观察其组织形态,并分别采用qRT-PCR及Western Blot技术检测主动脉组织中eNOS、NOX4及Sirtl在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果：(1)血压水平比较：①从第2周开始,硝苯地平组SBP和DBP水平就显着低于SHR组(P<0.05),硝苯地平+芪麻组SBP也显着低于SHR组(P<0.05)；从第4周开始,其余各组SBP及DBP均低于SHR组,差异有统计学意义(P<0.01或P<O.05)。②从第2周开始,与治疗前相比,硝苯地平组及硝苯地平+芪麻组,SBP及DBP出现明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)；芪麻高剂量组,从第4周开始SBP及DBP出现显着下降(P<0.01)；芪麻低剂量则从第8周开始出现显着下降(P<0.01)。(2)血清NO水平比较：与WKY组相比,其余各组血清NO水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组血清NO水平显着上升(P<0.01)；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量血清NO水平明显上升(P<0.05)；但硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量血清NO水平无显着差异(P>0.05)。(3)血清ET-1水平比较：与WKY组相比,SHR组血清ET-1水平显着升高(P<0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组及芪麻低剂量组ET-1水平显着下降(P<0.05)；硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组组间两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)血清AngⅡ水平比较：与WKY组相比,SHR组血清AngⅡ水平显着升高(P<0.01)；与SHR组相比,硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组及芪麻高剂量组AngⅡ水平显着下降(P<0.05),芪麻低剂量组AngⅡ均数水平较SHR组有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。(5)血清MDA水平比较：与WKY组相比,SHR组血清MDA显着升高(P<0.01)；与SHR组相比,各组MDA水平显着下降(P<O.05),与硝苯地平组相比,芪麻高剂量组MDA水平显着下降(P<0.05)。(6)血清SOD水平比较：与WKY组相比,SHR组、硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组及芪麻低剂量组血清SOD显着下降(P<0.01)；与SHR组相比,各治疗组SOD水平显着升高(P<O.01)；与硝苯地平组相比,芪麻高剂量组SOD水平显着升高(P<0.05)。(7)主动脉形态学比较：WKY组大鼠主动脉内膜光滑,内皮细胞完整,中膜平滑肌细胞排列整齐；SHR组主动脉内膜连续性被破坏,内皮细胞可见局部缺损,中膜平滑肌细胞排列不规则；硝苯地平组可见主动脉内膜光整性欠佳,中膜平滑肌细胞排列整齐；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组、芪麻低剂量组主动脉壁各层细胞排列规则,内皮细胞未见明显局部缺损或增厚。(8)主动脉eNOS mRNA水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组、硝苯地平组eNOS mRNA表达显着下降(P<0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS mRNA表达水平显着升高(P<O.05)；硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS mRNA表达水平两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(9)主动脉Sirtl mRNA水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组、硝苯地平组Sirtl mRNA表达显着下降(P<0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl mRNA表达水平显着升高(P<O.05)；硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(10)主动脉eNOS蛋白水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组及硝苯地平组eNOS蛋白表达水平显着下降(P<0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS蛋白的表达水平显着升高(P<0.05)；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS蛋白的表达水平显着升高(P<O.05)。(11)主动脉NOX4蛋白水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组NOX4蛋白水平表达显着升高(P<0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组NOX4蛋白水平表达显着降低(P<0.05)；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组NOX4蛋白水平的表达显着降低(P<0.05)。(12)主动脉Sirtl蛋白水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组Sirtl蛋白水平的表达显着下降<P<0.01)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl蛋白水平的表达水平显着升高(P<0.05)；与硝苯地平组相比,芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl蛋白水平的表达水平显着升高(P<O.05)。结论：(1)自发性高血压大鼠存在内皮结构和功能的障碍；(2)复方芪麻胶囊能够增加SHR血清NO并降低ET-1及AngⅡ水平调节内皮依赖性血管舒张功能；(3)复方芪麻胶囊能够通过增加SHR血清SOD并降低MDA水平提高内皮细胞抗氧化应激能力；(4)复方芪麻胶囊具有保护SHR主动脉内皮结构的作用；(5)硝苯地平与复方芪麻胶囊两药联用可发挥更好的降压及保护血管内皮的优势；(6)复方芪麻胶囊可能通过上调主动脉内皮细胞Sirt1、eNOS的表达促进NO的合成释放,并通过抑制NOX4的表达降低氧化应激反应,从而起到保护血管内皮的作用。实验二：复方芪麻胶囊含药血清对AngⅡ诱导损伤HUVECs的保护作用及机制研究目的：利用AngⅡ刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立内皮细胞损伤模型,观察复方芪麻胶囊含药血清对细胞凋亡及NO、ROS合成的影响,探讨复方芪麻胶囊对Sirt1、 eNOS及NOX4的调控途径,从细胞水平揭示其改善高血压内皮细胞损伤潜在的分子机制。方法：(1)用MTT法检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs)被不同浓度AngⅡ(10-8mol/L、 10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L)干预一定时间(12h、24h、48h)后的细胞活性情况,最终确定建立HUVECs损伤模型的AngⅡ浓度为10-6mol/L,作用时间为24h。(2)用MTT法检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs)被不同浓度复方芪麻胶囊含药血清(5%、10%、20%)干预一定时间(12h、24h、48h)后的细胞活性变化,最终表明5%、10%、20%复方芪麻胶囊含药血清均无细胞毒性。(3) HUVECs分组培养(①空白组；②模型组；③5%复方芪麻胶囊含药血清组；④10%复方芪麻胶囊含药血清组；⑤20%复方芪麻胶囊含药血清组；⑥阿托伐他汀钙组),24h后收集细胞或上清进行相关实验检测。(4)用MTT法检测各组HUVECs的活性。(5)在倒置显微镜观察各组HUVECs的形态学变化。(6)用硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养基中一氧化氮(NO)的浓度。(7)用流式细胞技术检测各组HUVECs的活性氧水平及细胞凋亡率情况。(8) qRT-PCR技术检测各组HUVECs中eNOS、NOX4及Sirtl在mRNA水平的表达情况。(9) Western Blot技术检测各组HUVECs中eNOS、NOX4及Sirtl在蛋白水平的表达情况。结果：(1)细胞活性比较：与空白组相比,模型组细胞活性显着降低(P<O.01)；与模型组相比,各浓度复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组的细胞活性显着升高(P<0.01)。(2)细胞形态学观察：空白组内皮细胞呈扁平状圆形或梭状铺路石状排列,核仁明显,轮廓清晰；模型组多数细胞皱缩呈圆形或椭圆形,细胞间间隙变大,核仁显示不清；复方芪麻胶囊含药血清组中部分细胞皱缩呈圆形或椭圆形,细胞间联系较紧密,核仁较清晰,其中10%复方芪麻胶囊含药血清细胞形态较低浓度含药血清的细胞形态改善；经阿托伐他汀钙处理的细胞形态与正常组相似。(3)NO水平的比较：与空白组相比,其余各组的细胞培养基中NO水平显着降低(P<0.01)；与模型组相比,各浓度复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组培养基中NO水平显着升高(P<0.05)；各药物干预组中,NO含量以10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组最高,其次为20%复方芪麻胶囊含药血清组,最低为5%复方芪麻胶囊含药血清组(P<O.05)。(4) HUVECs内ROS水平的比较：与空白组相比,其余各组的细胞内ROS含量显着升高(P<0.01)；与模型组相比,各药物干预组的ROS含量显着降低(P<0.05)；各药物干预组间的ROS含量均存在显着差异,其中10%复方芪麻胶囊含药血清组细胞内ROS含量最低,其次是阿托伐他汀钙组,再次是20%复方芪麻胶囊含药血清组,ROS含量最高为5%复方芪麻胶囊含药血清组(P<O.05)。(5)HUVECs凋亡水平的比较：与空白组相比,其余各组凋亡率显着升高(P<0.01)；与模型组相比,各药物干预组的细胞凋亡率显着降低(P<O.01)；各药物干预组间的细胞凋亡率也存在显着差异,其中10%复方芪麻胶囊含药血清组与阿托伐他汀钙组的细胞凋亡率最低(P>0.05),其次是20%复方芪麻胶囊含药血清组,细胞凋亡率最高为5%复方芪麻胶囊含药血清组(P<0.01)。(6) eNOS mRNA水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞eNOS mRNA表达显着下降(P<0.05)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组eNOS mRNA表达水平显着升高(P<0.01)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组eNOS mRNA表达显着下降(P<0.05); apocynin组及sirtinol组两者eNOS mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。(7) NOX4 mRNA水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞NOX4 mRNA表达显着升高(P<0.01)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及apocynin组NOX4 mRNA表达水平显着降低(P<0.01), sirtinol组NOX4 mRNA表达水平显着升高(P<0.01)；与sirtinol组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及apocynin组NOX4 mRNA表达水平显着降低(O<0.01)。(8)Sirtl mRNA水平表达的比较：与空白组相比,模型组、apocynin组及sirtinol组Sirtl mRNA表达显着下降(P<0.05)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组Sirtl mRNA表达水平显着升高(P<0.01), sirtinol组Sirtl mRNA表达水平显着降低(P<0.05)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组Sirtl mRNA表达显着降低(P<0.05)；与apocynin组相比,sirtinol组Sirtl mRNA表达水平显着降低(P<0.05)。(9) eNOS蛋白水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞eNOS蛋白水平表达显着下降(P<0.01)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组eNOS蛋白水平表达显着升高(P<0.01),sirtinol组eNOS蛋白水平表达显着降低(P<0.01)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组Sirtl蛋白水平表达显着降低(P<0.05)；与sirtinol组相比,apocynin组eNOS蛋白水平表达显着升高(P<0.01)。(10)NOX4蛋白水平表达的比较：与空白组相比,模型组、10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及sirtinol组细胞NOX4蛋白水平表达显着升高(P<0.01)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及apocynin组NOX4蛋白表达显着降低(P<0.01),sirtinol组NOX4蛋白水平表达显着升高(P<0.01)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,sirtinol组NOX4蛋白水平表达显着升高(P<0.01)；与sirtinol组相比,apocynin组NOX4蛋白水平表达显着降低(P<0.01)。(11) Sirtl蛋白水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞Sirtl蛋白水平表达显着下降(P<0.05)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组Sirtl蛋白水平表达显着升高(P<0.01),sirtinol组Sirtl蛋白水平表达显着降低(P<0.05)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组Sirtl蛋白水平表达显着降低(P<0.05)；与sirtinol组相比,apocynin组Sirtl蛋白表达显着升高(P<0.05)。结论：(1) 10-6mol/L浓度的AngⅡ干预24h可用于制作HUVECs的损伤模型。(2)复方芪麻胶囊含药血清可以改善受损的HUVECs的细胞形态,其中以10%浓度效果最佳。(3)复方芪麻胶囊含药血清能够明显提高HUVECs培养基中NO的水平,并抑制ROS的产生以减轻氧化应激对细胞造成的损伤,其中以10%浓度效果最佳。(4)复方芪麻胶囊含药血清能够明显抑制HUVECs的凋亡,其中以10%浓度干预后的细胞凋亡率最低。(5) AngⅡ能够抑制HUVECs中eNOS及Sirtl的表达并促进NOX4的表达,从而对内皮细胞造成损伤；(6)复方芪麻胶囊及阿托伐他汀钙能够通过上调人脐静脉内皮细胞eNOS及Sirtl的表达水平并抑制NOX4表达对内皮细胞起保护作用;(7)复方芪麻胶囊可能通过促进上游基因Sirtl的表达,在上调eNOS促进NO生成的同时下调NOX4减少ROS的产生,保护内皮细胞功能。
宋之臻[3]2016年在《当归多糖肝靶向作用及保护急性肝损伤机理的研究》文中研究表明当归,为伞形科多年生草本植物Angelica sinesis (Oliv.) Diels的干燥根,主要产地为我国甘肃岷县。在传统中医药中,当归作为补血活血及调经止痛的要药被广泛使用。当归多糖(Angelica Polysaccharide)是从当归根中提取出的一种水溶性多糖,也是当归的主要活性成分之一。近年来的研究表明,当归多糖有着显着的补血补铁及促进机体免疫的作用,同时也对保护肝功能有着独特的疗效,但其作用机理尚不明确。以当归的干燥根部为原料,采用水提醇沉法提取粗多糖,并经纯化得到精制当归多糖ASP。通过化学及光谱图谱对所得产物的纯度和初级结构进行分析。用荧光物质标记ASP,考察其在大鼠肝脏组织的分布情况、不同浓度下的分子粒径大小及对Toll样受体和甘露糖受体的结合作用,探讨ASP对肝脏的靶向作用。建立刀豆蛋白致肝损伤及酒精性肝损伤两种急性肝损伤模型,通过体内及体外实验考察ASP对急性肝损伤的保护作用及机制,为增加ASP的临床应用范围及药效机制提供实验和理论基础。第一部分 当归多糖的肝靶向作用研究采用传统的水提醇沉法从当归饮片中提取粗多糖,并通过反复冻融、微孔滤膜过滤法及Sephadex G-50色谱层析柱分离纯化,得到白色絮状固体ASP。紫外可见光光谱显示ASP不含核酸和蛋白质,由红外光谱所示特征吸收峰推测ASP为β-D吡喃糖,苯酚-硫酸法测定其糖含量为90.25%,高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定其重均分子量(Mw)为9.4×104Da。ASP经FITC标记后得橙黄色絮状标记产物(FITC-ASP, FA)。FA产率稳定,在紫外可见光及荧光扫描图谱中可见典型的荧光素FITC的特征吸收峰,并且在PBS溶液及血浆中稳定性较好,荧光标记取代度适宜,可成为研究当归多糖肝靶向作用的工具。体内分布实验采用四种浓度剂量(3、6、12及24mg/kg)的FA经尾静脉注射SD大鼠,在给药0.25、0.5、1、1.5、2、3和4 h时采用高效液相色谱仪检测肝脏匀浆液的荧光强度。结果显示,给药后FA迅速分布到肝脏组织并蓄积,至约1.5 h左右达到峰值。随后,肝脏组织中FA的浓度逐渐下降,至4h后基本从肝脏组织中清除。原子力显微镜和布鲁克海文粒度仪实验结果表明,ASP的浓度为1μg/mL至20mg/mL时,ASP在溶液中分散均匀,稳定性较好,其粒径在200nm到3μm之间,在肝脏的被动靶向粒径范围内,可被肝巨噬细胞(Kupffer细胞)摄取而聚集于肝脏组织,产生被动靶向肝脏的作用。Kupffer细胞TLR4及甘露糖受体的体外拮抗实验证实,Kupffer细胞可以通过甘露糖受体与当归多糖ASP产生特异性结合作用,而Kupffer细胞上的TLR4与ASP并没有明显的结合作用。上述结果表明,ASP可通过与甘露糖受体结合产生部分主动肝靶向作用,为后续当归多糖对急性肝损伤保护作用的研究提供实验思路及理论基础。第二部分当归多糖对刀豆蛋白致急性肝损伤小鼠肝保护作用机理研究体内实验采用刀豆蛋白诱导急性肝损伤模型：将小鼠随机分组,低剂量给药组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 1.5 mg/kg;高剂量给药组及ASP毒性试验组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 6 mg/kg;正常对照组及模型组小鼠每日单次尾静脉注射等体积PBS。连续给药14天,于第15天诱导损伤,即模型组及低、高剂量给药组小鼠单次尾静脉注射ConA 15 mg/kg;正常对照组及ASP毒性试验小鼠单次尾静脉注射等体积0.01 M PBS。造模8 h后采用眶动静脉取血法采集血液。造模20 h后称量并记录小鼠体重,处死小鼠后取出肝脏组织,均分并分别采用多聚甲醛固定及-80℃冷冻处理。通过观察肝脏表观形态、苏木精-伊红染色切片显微图片及计算各组小鼠肝指数和转氨酶水平考察ASP对刀豆蛋白致急性肝损伤的保护作用。观察肝脏表观形态可见,造模后小鼠肝脏颜色发黑变暗,有严重的血液淤积现象；低、高剂量给药组小鼠肝脏颜色较模型组均有所恢复。由苏木精-伊红染色图片可以观察到,ConA致急性肝损伤模型建立后,小鼠肝脏组织出现大面积坏死、细胞核固缩、细胞破碎,汇管区及肝实质内有严重的炎性细胞浸润；相比于模型组,低、高剂量给药组小鼠肝脏细胞形态趋于完整,无明显的坏死区域,汇管区和肝实质内炎性细胞数量明显减少。计算肝指数发现,与正常对照组相比,ConA模型组小鼠肝指数从4.32%上升为6.08%,而经ASP预给药的两组小鼠肝指数较ConA模型组均明显降低。血清转氨酶检测结果发现,ConA模型组小鼠血清AST及ALT较正常对照组小鼠显着上升了近千倍,而低、高剂量给药组小鼠血清AST及ALT水平较ConA模型组均有极显着降低。以上结果表明,ASP对刀豆蛋白致急性肝损伤有良好的肝保护作用。ASP毒性试验组小鼠各指标与正常对照组相比并没有显着改变,证实在实验设计的剂量浓度下ASP对小鼠无毒副作用。采用检测试剂盒和双抗体夹心ELISA法探究ASP对模型小鼠血清细胞因子(TNF-α, IFN-γ, IL-2和IL-6)及抗氧化相关指标(SOD. ROS和MDA)的影响。由结果可知,ConA模型组小鼠血清免疫相关细胞因子TNF-α, IFN-γ, IL-2和IL-6与正常对照组相比显着升高,体内ROS及MDA水平均异常增加,而SOD酶活力明显降低；与ConA模型组相比,低、高剂量组小鼠TNF-α, IFN-γ, IL-2和IL-6水平均有显着降低,体内ROS及MDA水平明显下降,而SOD酶活力显着增加。上述结果显示,预给药ASP能够有效地抑制刀豆蛋白引起的机体免疫炎性及氧化应激反应,提高抗氧化能力,从而减轻刀豆蛋白诱导的肝损伤。采用蛋白质印迹法检测ASP对刀豆蛋白致急性肝损伤小鼠肝脏组织中各通路关键蛋白表达的影响。实验结果显示,相比于ConA模型组,低、高剂量组小鼠肝脏组织中 NF-κB、IKKα、p-IκBα、Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8、p-JNK、Bax、 STAT3、p-STAT3、TLR4和TNFR1的表达水平明显降低,Bcl-2的水平显着升高,但p-Akt的表达量并没有显着差异。由上述结果推测,ASP可能通过以下途径减轻刀豆蛋白诱导的急性肝损伤：(1)减少氧化应激及细胞因子的释放,抑制TNFR1和其配体结合及下游MAPK/JNK和Caspase家族信号通路,一方面阻碍JNK磷酸化及其诱导的Bax活化,减轻线粒体损伤：另一方面抑制Caspase家族级联信号通路激活,减少Caspase-8活性片段的产生,减弱Bax的促凋亡作用。同时,Bax和Caspase-8水平的下降均可以下调Caspase-3的表达,阻碍肝细胞核小体间的DNA裂解和细胞程序性死亡,从而抑制肝细胞的损伤及坏死。(2)抑制TLR4和TNFR1的激活,减少IKKa亚基被磷酸化,从而下调IKK的表达。未活化的IKK不能使IκBα被磷酸化而停留在静息状态,与NF-κB p65/p50亚单位以失活状态存在于细胞质中,阻碍NF-κB活化进入细胞核,从而降低炎性细胞因子的转录水平,减少细胞因子的释放以及肝脏细胞的凋亡坏死。(3)抑制IL-6/STAT3信号通路的过度激活,降低STAT3的磷酸化水平,减少粒细胞和淋巴细胞增殖及细胞因子的大量分泌；同时减少肝细胞分泌急性期反应蛋白,缓解肝细胞损伤坏死。体外实验研究ASP对刀豆蛋白诱导的淋巴细胞体外增殖作用及其对HepG2和HT 29肿瘤细胞的直接细胞毒性作用的影响。将提取的脾总细胞用CFSE标记后分孔刺激,即空白对照孔加入等体积1640完全培养基,ConA模型孔加入ConA(终浓度5μg/mL),ASP给药孔加入ASP(终浓度25μg/mL)和ConA(终浓度5μg/mL),于培养箱中培养72 h后加入混合的荧光标记抗小鼠单抗(PE-Cy7 anti-CD3ε、APC anti-CD4和PE anti-CD19),用流式细胞仪检测细胞增殖。增殖结果表明,ConA可促进CD4+T淋巴细胞和非CD4 T淋巴细胞的增殖,而对B淋巴细胞没有明显作用;ASP给药孔CD4+T淋巴细胞和非CD4 T淋巴细胞的增值指数及百分增殖率均较ConA模型孔有显着降低,而B淋巴细胞增殖现象明显。采用MTT实验考察在刀豆蛋白损害过程中ASP对细胞的直接保护作用。结果表明,相比于ConA模型孔,实验浓度的ASP(10、100和1000 μg/mL)给药后对HepG和HT 29肿瘤细胞的增殖并没有显着变化,推测ASP并不是通过直接作用于被损害细胞而发挥肝保护作用。第叁部分当归多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝保护作用机理研究体内实验采用酒精诱导急性肝损伤模型：将小鼠随机分组,低剂量给药组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 1.5 mg/kg;高剂量给药组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 6 mg/kg;正常对照组及模型组小鼠每日单次尾静脉注射等体积PBS。连续给药14天,于第15天诱导损伤,即模型组及低、高剂量给药组小鼠每次灌胃5mL/kg50%酒精溶液,共灌胃叁次,间隔1 h;正常对照组小鼠每次灌胃等体积超纯水,共灌胃叁次,间隔1h。灌胃后禁食。造模6 h后采集采用眶动静脉取血法收集血液。造模12 h后称量并记录小鼠体重,处死小鼠后取出肝脏组织,均分并分别采用多聚甲醛固定及-80℃冷冻处理。通过观察苏木精-伊红染色切片显微图片及计算各组小鼠肝指数和转氨酶水平考察ASP对酒精致急性肝损伤的保护作用。由苏木精-伊红染色图片可以观察到,与正常对照组相比,酒精模型组小鼠肝脏实质内弥散出现大量炎性细胞及细胞空洞；低剂量给药组小鼠肝脏切片比模型组稍有好转,而高剂量给药组小鼠肝脏细胞形态趋于完整,无明显的细胞空洞,细胞核染色正常,炎性细胞浸润现象消失。计算肝指数发现,酒精造模后小鼠肝指数显着上升,而低、高剂量给药组小鼠肝指数与模型组相比均明显降低。由血清转氨酶实验结果可知,低、高剂量给药组小鼠血清AST及ALT水平较酒精模型组均有显着下降,其ALT平均水平甚至低于正常组小鼠。以上结果初步表明,ASP对酒精诱导的急性肝损伤有良好的肝保护作用。采用检测试剂盒和双抗体夹心ELISA法探究ASP对模型小鼠体内细胞因子(TNF-α, IFN-γ和IL-6)、内毒素LPS及抗氧化相关指标(SOD、CAT、GR、GSH-Px、 GSH、ROS和MDA)的影响。由结果可知,酒精模型组小鼠血清及肝脏组织中TNF-α和IFN-γ以及肝脏组织中IL-6水平显着高于正常对照组,但血清IL-6水平没有较明显的改变;相比于模型组,低、高剂量给药组小鼠血清及肝脏组织中TNF-α和IFN-γ明显下降,高剂量给药组肝脏组织中IL-6水平显着低于模型组,但血清IL-6水平没有较明显的改变。酒精造模后,小鼠血清内毒素水平较正常对照组显着性增高,出现内毒素血症;低、高剂量给药组小鼠血清内毒素水平明显低于模型组,内毒素血症得到缓解。低、高剂量组小鼠肝脏SOD、CAT、GR和GSH-Px等酶的活力及GSH水平相比酒精模型组显着提高,而ROS和MDA的水平显着下降。由上述结果推断,预给药ASP能够有效地抑制酒精引起的机体免疫炎性及氧化应激反应,提高抗氧化能力,从而减轻酒精诱导的急性肝损伤。为进一步探究ASP对酒精诱导的氧化应激及脂质过氧化反应的影响,采用流式细胞术及荧光显微成像研究ASP对HepG2细胞中ROS水平的影响；测定ASP对DPPH自由基的清除能力；试剂盒检测小鼠血清及肝脏TG浓度：油红0染色法观察各组小鼠肝脏组织以及药物干预后各孔HepG2细胞的油红O染色显微图片。流式细胞术及显微图片结果表明,相比于模型组,各剂量给药组ASP显着抑制酒精诱导的HepG2细胞ROS水平的升高。ASP对DPPH 自由基的清除能力的实验结果显示,ASP在1-20 mg/mL的浓度范围内对DPPH自由基具有良好的清除作用,而ASP浓度为20mg/mL时,其清除率接近100%。TG检测结果显示,低、高剂量给药组小鼠血清及肝脏TG浓度较模型组均有显着性降低。油红O染色显微图片可见,酒精模型组小鼠肝脏弥散大量橘红色油脂,低剂量给药组小鼠肝脏橘红色脂滴数量比酒精模型组有所减少,而高剂量给药组小鼠肝脏与正常对照组相似,油红O切片中极少见到大片橘红色油脂；酒精模型孔HepG2细胞周围弥散大量粘附的橘红色油脂,各浓度实验孔橘红色脂滴数量比酒精模型孔明显减少,只有零星橘红色油脂。由上述结果推测,ASP能够有效抑制酒精诱导的氧化应激及脂质过氧化反应,减轻急性酒精性肝损伤。体外实验以HepG2细胞为对象,采用MTT法研究ASP对酒精的直接细胞毒性的影响。由MTT实验结果可知,随着酒精浓度的增加,酒精对HepG2细胞的生长抑制现象越来越明显,呈浓度依赖关系,且当酒精浓度高于200mM时,HepG2细胞的生长抑制率超过50%。与酒精对照组相比,各浓度的ASP可以较好地对抗酒精产生的抑制HepG2细胞生长的作用,且当ASP浓度大于50 μg/mL时,其对各实验浓度酒精的细胞毒性均有较好的抑制作用,且呈现良好的浓度依赖关系。由此可知,当归多糖对酒精的直接细胞毒性有良好的抑制效果,阻碍酒精介导的细胞死亡。体外实验用药物干预各孔HepG2细胞后抽提细胞蛋白、体内实验提取各组小鼠肝脏组织总蛋白,采用蛋白质印迹法检测生物样本中各通路关键蛋白的表达。结果显示,低、高剂量组小鼠肝脏组织和酒精诱导的HepG2细胞中Caspase-3、Bax、TLR4和CYP2E1的表达水平与酒精模型组相比均有显着性降低,Bcl-2的表达水平显着性增加。低、高剂量给药组小鼠肝脏组织中NF-κB和p-IκBα的表达水平较模型组有显著下降,但HepG2细胞中NF-κB和p-IκB。的表达水平与酒精模型孔没有显着性差异。由此分析,当归多糖可能通过以下途径减轻酒精诱导的急性肝损伤：(1)减少Bax并增加Bcl-2的表达,下调Bax/Bcl-2的比值,抑制酒精诱导的线粒体凋亡信号通路；同时抑制Caspase家族级联信号通路激活,减少Caspase-3的活化,阻断肝细胞核小体间的DNA裂解和细胞程序性死亡,从而减轻肝细胞的损伤及坏死。(2)通过调节TLR4的过度激活而抑制NF-κB信号通路,阻止IκBα被磷酸化而停留在静息状态,与NF-κB p65/p50亚单位以失活状态存在于细胞质中,阻碍NF-κB解聚活化后进入细胞核内,从而抑制NF-κB依赖的炎性细胞因子相关基因转录,减少细胞因子的释放以及肝脏细胞的损伤坏死。(3)抑制酒精诱导的CYP2E1异常升高,减少其催化的代谢产物ROS的大量产生,下调体内氧化应激水平而减轻肝脏损伤及坏死。
李风[4]2017年在《肝细胞癌患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态及其临床意义研究》文中研究指明第一部分血清IGFBP7基因甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断中的价值研究研究背景在中国,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最常见的致病原因为慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染。HCC发现时通常已处于晚期阶段,错过了最佳的治疗时机。即使在过去的几十年中随着肝癌诊断能力的增强、影像学检查手段的发展以及新的治疗策略的出现,肝癌患者的生存情况及预后仍然不容乐观,五年生存率仍然很低,预后很差。针对肝癌的这些疾病特点,早发现、早治疗对改善患者预后至关重要,是提高生存率的关键。肝组织病理学检查是诊断肝癌最可靠的方法,但其是一种侵入性的有创检查,操作复杂,风险较高,不适用于肝癌的早期筛查。到目前为止,肝癌的筛选和术后随访主要依赖于血清肿瘤标志物和腹部影像学诊断的联合应用。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)为目前临床应用较多的血清标志物,具有无创性和可重复性等优势,但其灵敏性和特异性相对较低。超声等影像学检查手段易受到多种因素的影响,这使得在肿瘤初始阶段及时、有效的诊断肝癌较为困难。因此,完善HCC的早期诊断方法,寻找更为简易、灵敏的非侵入性生物标志物是临床医生亟待解决的问题。肝癌的发生、发展过程受到多种因素的影响,可能与遗传学、表观遗传学改变及环境因素的综合作用有关。作为一种广泛研究的表观遗传学修饰方式,DNA甲基化是调控基因表达的重要手段。到目前为止,越来越多的证据表明异常的DNA甲基化在肿瘤发展过程中发挥重要作用,特定基因的甲基化改变或可作为肿瘤早期诊断的潜在生物标志物。类似的甲基化改变也可在血清/血浆来源的循环游离DNA(cell-freeDNA,cfDNA)中检测到。cfDNA定义为血浆/血清中发现的细胞外DNA,其主要来自于原发肿瘤位点、循环肿瘤细胞及远处转移的凋亡和坏死的肿瘤细胞。作为一种非侵入性的"液体活检"检测手段,cfDNA甲基化检测可有效避免肿瘤组织活检,用于多种肿瘤的早期诊断。cfDNA的甲基化状态已成为HCC早期诊断最有前景的生物标志物之一。胰岛素样生长因子结合蛋白 7(insulin-like growth factor-binding protein 7,IGFBP7)在肿瘤中的作用备受关注。多个研究发现IGFBP7能抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤血管稳定性,是一种典型的肿瘤生长抑制因子。IGFBP7异常甲基化已在多种肿瘤中得到证实,参与了肿瘤的发生、发展过程。近期研究显示,IGFBP7在HCC中也发挥抑癌基因的作用,因此我们推测血清IGFBP7基因启动子甲基化状态或可作为HCC患者早期诊断的潜在非侵入性生物标志物。目的本研究的主要目的是探讨HCC患者血清IGFBP7基因甲基化状态,研究血清IGFBP7基因甲基化在HCC诊断中的潜在价值。方法本研究共入组2011年6月～2012年7月期间在山东大学齐鲁医院就诊的136例HCC患者、46例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和35例正常对照者。HCC诊断标准参照2010年更新的美国肝病研究协会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)发布的《肝细胞癌临床指南》,所有入组的HCC患者均伴有慢性HBV感染。CHB诊断标准参考2009年更新的AASLD发布的《慢性乙型肝炎实践指南》:血清乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性史超过6个月,现血清学检查证实HBsAg仍为阳性和(或)病毒学检查显示HBVDNA仍为阳性者。血清IGFBP7基因启动子甲基化状态采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)测定。统计分析采用SPSS 16.0(Chicago,IL,USA)软件。两组数值变量之间的比较采用独立样本的t检验或Mann-Whitney U检验。应用卡方检验比较各个分组之间血清IGFBP7基因启动子甲基化状态的差异,并评估HCC患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态与临床病理指标之间的关系。我们应用多元logistic回归分析筛选血清IGFBP7基因启动子甲基化的独立影响因素。应用受试者工作特征曲线下面积(the area under the receiver operating characteristic curve,AUC)来评估血清IGFBP7基因启动子甲基化状态与血清AFP水平的诊断效能。采用灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值来评估不同指标的诊断准确性。P值<0.05定为差异有统计学意义。结果1、136例HCC患者组中有89例(65%)发生IGFBP7基因启动子区异常甲基化,46例CHB患者组中有8例(17%)发生IGFBP7基因启动子区异常甲基化,35例正常对照者中有5例(14%)发生IGFBP7基因启动子区异常甲基化。HCC组IGFBP7基因启动子甲基化的比率明显高于CHB组(P<0.001)和正常对照组(P<0.001)。2、IGFBP7基因甲基化与患者的性别、年龄、HBeAg、吸烟史、饮酒史、肿瘤个数、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、CTP分级和血清AFP水平等之间无明显相关性(P>0.05),而与血管侵袭具有明显的相关性(P = 0.010)。同时,我们应用多元logistic回归来筛选血清IGFBP7基因启动子甲基化的独立影响因素,结果显示各临床病理指标均不是IGFBP7基因甲基化的独立影响因素。3、我们评估了血清IGFBP7基因启动子甲基化状态对肝癌的诊断价值。当我们从CHB患者中诊断HCC时,血清IGFBP7基因启动子甲基化的诊断灵敏性和特异性分别为65%和83%;当我们从正常人中诊断HCC时,血清IGFBP7基因启动子甲基化的诊断灵敏性和特异性分别为65%和86%。在区分HCC与CHB患者时,血清IGFBP7基因启动子甲基化的AUC明显高于血清AFP水平(0.740 vs 0.618;P<0.05)。4、我们比较了血清IGFBP7基因启动子甲基化状态联合AFP与单独应用AFP对HCC的诊断价值。当血清AFP水平低于20 ng/ml时,IGFBP7甲基化组的HCC诊断率明显高于IGFBP7非甲基化组(P<0.001)。当血清AFP水平高于20 ng/ml时,IGFBP7甲基化组的HCC诊断率同样明显高于IGFBP7非甲基化组(P<0.001)。在本研究中,共有143例患者可依据血清AFP水平高于20 ng/ml或IGFBP7基因启动子发生甲基化而考虑诊断为肝癌(阳性),其中有116例肝癌患者(真阳性)和27例CHB患者(假阳性)。共有39例患者可依据血清AFP水平低于20 ng/ml且IGFBP7基因启动子未发生甲基化而考虑排除肝癌(阴性),其中有19例CHB患者(真阴性)和20例肝癌患者(假阴性)。血清AFP水平单独诊断肝癌的灵敏性和特异性分别为57%和52%。联合血清IGFBP7基因启动子甲基化与AFP诊断肝癌的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为85%、41%、81%和49%。本研究证实AFP和IGFBP7甲基化的联合应用比单独应用AFP具有更高的灵敏性(P<0.001)和阴性预测值(P = 0.03),但在特异性(P= 0.296)和阳性预测值(P=0.525)方面没有明显差异。结论1、我们的研究结果首次证实HCC患者存在血清IGFBP7基因启动子区甲基化的异常,提示检测该指标可作为HCC诊断非侵入性的生物学标志物。2、血清IGFBP7基因甲基化在发生血管侵犯的HCC患者中更容易检测到,提示IGFBP7基因甲基化或可用于判断HCC的血管侵犯。第二部分血清IGFBP7基因甲基化与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌术后不良预后的关系研究研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤,是慢性肝脏疾病的严重并发症。HCC发病率逐年上升,是世界范围内癌症相关死亡的第叁大常见原因,每年有大约600,000患者死于HCC。HCC的发病机制主要包括几个方面:原癌基因的激活、氧化应激、肿瘤抑制功能减退等。目前氧化应激与肝癌发生、发展之间的关系已经引起了越来越多的关注。氧化应激是身体接受有害的内源性或外源性因素刺激而发生的反应,越来越多的证据表明,氧化应激在HCC的发生和发展过程中扮演重要的角色。氧化应激发生时,机体生成大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),超越了抗氧化剂系统的消除能力,体内氧化与抗氧化作用失衡,从而促进基因突变和表观遗传学改变而导致肿瘤的发生。异常的DNA甲基化是人类肿瘤发病机制中的一个常见事件,也是发挥致瘤作用的重要的表观遗传学机制。与致瘤作用相关的代表性的DNA甲基化改变包括:导致某些抑癌基因失活的CpG岛启动子区域高甲基化,导致基因组不稳定性、细胞转化和肿瘤进展的全基因组的低甲基化。目前已知有叁种活跃的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)参与基因甲基化过程的催化:DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。许多研究表明,与肿瘤相关的DNA甲基化改变或可作为肝癌早期诊断及预后判断的指标,并可用于评估对治疗的反应。恶性肿瘤可通过肿瘤细胞的凋亡和坏死释放大量的DNA进入血液中,称为肿瘤来源的循环游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)。不同的遗传和表观遗传分析已经证实了 cfDNA的临床意义。鉴于其样本获取简易,创伤较小,成本低廉,cfDNA作为肿瘤诊断的非侵入性生物标志物获得了越来越多的关注。在肿瘤细胞中的研究发现的DNA突变和甲基化改变等分子机制同样也出现在cfDNA中。大量的研究表明,cfDNA的甲基化是一种用于HCC早期诊断、风险评估、治疗反应及预后判断的非常有前景的生物标志物。胰岛素样生长因子结合蛋白 7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)的功能包括调节细胞增殖和分化,诱导细胞凋亡和细胞衰老等。前期研究显示,IGFBP7在包括HCC在内的多种肿瘤中发挥潜在的抑癌基因的作用,其水平与患者预后密切相关。我们的研究显示,血清IGFBP7基因启动子区域甲基化可以作为肝细胞癌诊断的非侵入性生物标志物。然而,血清IGFBP7基因甲基化与HCC患者预后的关系尚无研究。目的本研究的主要目的是探讨氧化应激、DNMTs mRNA表达与IGFBP7基因甲基化之间的关系,并评估血清IGFBP7基因启动子甲基化状态在HCC术后预后判断中的价值。方法本研究入组2010年I月～2013年1月期间在山东大学齐鲁医院就诊并接受手术切除的155例HCC患者。HCC诊断标准参照2010年更新的美国肝病研究协会(American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD)发布的《肝细胞癌临床指南》,所有入组的HCC患者均伴有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染。我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测HCC患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态,应用实时荧光定量多聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测DNMTs mRNA水平,应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定氧化应激状态,包括血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone,GSH)、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferases,GST)水平。统计学分析采用统计软件SPSS version 16.0(Chicago,IL,USA)完成。数值变量由均数±标准差表示。分类变量由数值(百分数)表示。采用独立样本t检验和Mann-whitney U检验比较不同甲基化状态的HCC患者间数值变量的差异。采用卡方检验比较两组间分类变量的差异。运用Kaplan-Meier法,Log-Rank检验进行单因素分析,研究HCC患者术后总体生存率和早期肿瘤复发的相关因素。运用Cox比例风险回归模型进行多因素分析,研究HCC患者术后总体生存率和早期肿瘤复发的独立危险因素。P值<0.05定为差异有统计学意义。结果1、本研究共入组155例肝癌术后患者,其中105例(67.7%)患者血清可检测到IGFBP7基因启动子甲基化。我们发现IGFBP7基因甲基化与血管侵袭、总体生存率、早期肿瘤复发密切相关,而与性别、年龄、血清甲胎蛋白水平、肿瘤数量、肿瘤大小、有无肝硬化、分化程度及TNM分期等并无显着的相关性(P>0.05)。2、我们比较了 IGFBP7甲基化组和IGFBP7非甲基化组之间各氧化损伤指标的差异。结果显示IGFBP7甲基化组的MDA水平(P<0.001)和XOD水平(P=0.014)均明显高于IGFBP7非甲基化组,IGFBP7甲基化组的GSH水平明显低于IGFBP7非甲基化组(P=0.009),而两组之间的GST水平并无明显差异(P=0.878)。3、我们比较了 IGFBP7甲基化组和IGFBP7非甲基化组之间DNMTs表达水平的差异。结果显示IGFBP7甲基化组的DNMT1 mRNA水平(P = 0.001)和DNMT3amRNA水平(P = 0.002)均明显高于IGFBP7非甲基化组,而IGFBP7甲基化组与IGFBP7非甲基化组之间的DNMT3b mRNA水平(P=0.386)并无明显差异。4、将肝癌切除手术日期作为随访的起始时间,死亡或最终的随访结束日期2016年1月为随访终点。我们评估了肝癌术后患者血清IGFBP7基因启动子甲基化状态对患者预后的判断价值。Kaplan-Meier曲线分析显示,IGFBP7基因甲基化与HCC患者术后的总体生存率明显相关(P<0.001),发生IGFBP7基因甲基化的HCC患者预后更差。5、我们应用单因素分析研究影响HCC患者术后总体生存率的相关因素,发现肿瘤大小、血管侵袭、TNM分期、早期肿瘤复发和IGFBP7基因甲基化均与HCC患者的术后总体生存率有关。将上述指标纳入多因素分析,结果显示TNM分期(P=0.000)、早期肿瘤复发(P=0.000)和IGFBP7基因甲基化(P = 0.000)是影响HCC患者术后总体生存率的独立危险因素。6、我们应用单因素分析研究影响HCC患者术后早期肿瘤复发的相关因素,结果表明肿瘤大小、血管侵袭、TNM分期和IGFBP7基因甲基化与HCC患者术后早期肿瘤复发相关。我们将上述指标纳入多因素分析,结果显示TNM分期(P= 0.015)和IGFBP7基因甲基化(P= 0.008)是影响HCC患者术后早期肿瘤复发的独立危险因素。结论1、我们的结果表明IGFBP7基因启动子甲基化与HCC患者氧化损伤水平及DNMTs表达水平明显相关,提示氧化应激或可通过影响DNMTs表达诱导IGFBP7基因甲基化。2、IGFBP7基因启动子甲基化与血管侵袭、总体生存率和早期肿瘤复发相关,提示检测血清IGFBP7基因甲基化可作为HCC患者术后预后判断的潜在非侵入性生物标志物。
郝燕[5]2017年在《巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）与冠心病严重程度和预后的相关性分析》文中研究指明研究背景冠心病是全世界范围内发病率第一的心血管疾病,在中国由于危险因素如吸烟、肥胖、高血压、高脂血症、糖尿病等的盛行,使得近几十·年来冠心病的发病率迅速上升。冠心病的发生机制非常复杂,其中各种因素导致的炎症及氧化应激反应越来越受到广大医学者的关注。急性冠脉综合征是冠心病中急性发病的临床类型,冠状动脉粥样硬化斑块破裂、糜烂、溃疡并发血栓形成、血管收缩、微血管栓塞至部分或全部血管腔阻塞被认为是急性冠脉综合征的主要原因,常可异致心肌梗死、心力衰裒竭、致死性心律失常甚至死亡等一系列严重后果。而急性冠脉综合征中,无明显血流受阻的轻度冠脉狭窄的斑块破裂所异致的急性冠脉综合征是重度狭窄所致急性冠脉综合征的10倍甚至10倍以上。心源性猝死患者的病理学研究表明,急性冠脉综全征的发生主要是由于冠状动脉易损斑块破裂导致的冠脉内不同时间和不同程度的血栓栓塞。在西方社会,心源性死亡是导致65岁以上人群死亡的首要原因,在所有的与心脏相关的死亡中,几乎一半是突发并不可预期的,因此,早期发现冠心病病人冠脉病变存在不稳定斑块显得十分重要,如何在斑块破裂之前即进行早识别、早治疗已成为我们面临的重大挑战。目前易损斑块的识别仍然是一个难题,尚无准确的方法,有报道说,可以通过冠脉造影观察病变的复杂程度来反映斑块的易损性,如斑块破裂,斑块出血,或血栓的形成,也就是说冠脉造影证实的复杂病变提示该病变处斑块易于破裂或已经破裂,不过由于冠状动脉造影是一种侵入性的过程,需要在导管室完成,科学家和医生希望能找到无创的方式来检测易损斑块,并且这种方式最好是即使在无症状的隐匿型冠心病患者也适用。大量研究已经证实了炎症反应与易损斑块之间有强烈的相关性,因此,炎性标志物有可能成为易损斑块的预测因子。巨噬细胞迁移抑制因子是巨噬细胞产生的一类促炎症因子,也是糖皮质激素诱导的免疫调节因子,具有类似趋化因子的功能,促进细胞定向迁移。自1966年被发现以来,巨噬细胞迁移抑制因子在人体内的功能,尤其是它在固有免疫、免疫细胞招募和炎症反应等方面的研究取得了很大的进展。已经有研究表明,血清巨噬细胞迁移抑制因子在脓毒血症、炎症、自身免疫疾病和动脉粥样硬化的发病机制中发挥了重要作用,研究证实,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平在急性冠脉综合征患者中会有明显升高,并且和颈动脉粥样硬化斑块不稳定性有关。然而,在冠心病病人中,血清巨噬细胞迁移抑制因子与冠状动脉粥样硬化斑块的不稳定性之间的关系尚无准确说法,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与冠脉造影的影像学表现之间的关系仍不清楚。研究目的本研究的目的是测定冠心病病人血淸巨噬细胞迁移抑制因子水平,研究它与血管造影证实的冠状动脉复杂病变的相关性,从而进一步探讨血清巨噬细胞迁移抑制因子与冠状动脉粥样硬化易损斑块之间的关系。研究方法1.研究对象在这项研究中,我们收集了2013年5月至2015年1月至山东大学附属省立医院就诊的已经明确或怀疑冠心病的病人,这些患者均接受常规冠状动脉造影。经筛选总共有232例的冠心痛患者纳入研究中。这些患者又进一步分为急性冠脉综合征(n =134)和稳定型心绞痛(n =98)两个亚组,同纳入了同时期76名冠状动脉造影证实冠状动脉未见明显狭窄的非冠心病患者作为对照组。有心力衰竭、心肌病、感染性疾病、活动性炎症性疾病、肾功能衰竭、严重肝病、癌症、外周动脉疾病或血液病的患者被排除在外。急性冠脉综合征组包括急性心肌梗死和不稳定型心绞痛。急性心肌梗死定义为胸痛持续了大于30分钟,从胸痛发作至到达医院时间在28天内,在12导联心电图上新的ST-T改变或新的左束支传导阻滞,有心肌损伤标志物(肌钙蛋白T或肌钙蛋白Ⅰ)的升高。不稳定型心绞痛定义为自发性心绞痛,恶化型心绞痛,或初发型心绞痛,无心肌损伤标志物的升高。稳定型心绞痛即稳定型劳力性心绞痛定义为在入院前1-3个月内,疼痛诱发因素、疼痛的频率、持续时间、疼痛程度、疼痛缓解的方式没有变化。2.造影结果分析冠脉造影是在导管室中通过右侧桡动脉或股动脉进行常规的多方位投影,造影图像由两位有经验的介入专家进行分析,分析造影结果的人并不知道患者是我们实验的研究对象,根据Ambrose形态学分类把冠状动脉狭窄归类为简单病变或复杂病变。复杂的病变被定义为至少存在一个如下的特点:偏心性斑块,形态不规则或扇形边界,或两者并存;偏心性狭窄,由一个或多个悬挂边缘,形成一个凸向腔内的窄颈阻塞;斑块溃疡;冠状动脉内血栓导致的充盈缺损。除此之外为简单病变。3.血样收集和生物学标志物的检测分析血标本的采集是在冠脉造影之前采患者的空腹静脉血,从肘静脉将静脉血抽到促凝采血管,室温放置30分钟后3000g离心15分钟,分离血淸后-80℃保存待用。空腹血糖、甘油叁酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇均使用标准的实验方案,在Hitachi7600全自动生化分析仪测定(Hitachi Co.,Tokyo,Japan)。血清中巨噬细胞迁移抑制因子水平定量测定使用商业酶联免疫吸附法测定(ELISA)试剂盒,批内和批间变异系数均小于10%,根据制造商的方案(R&D Systems,Minneapolis,MN)进行测定。4.数据分析数据分析采用SPSS 16.0(SPSS.Inc.,Chicago.IL),结果为正态分布的连续变量表示为均值±标准差,非正态分布的连续变量表示为中位数(四分位数间距)。巨噬细胞迁移抑制因子与冠状动脉病变程度的比较,两组间的比较采用t检验、Mann-Whitney秩和检验或卡方检验。叁组或多组比较采用单因素方差分析、H检验或卡方检验。单因素方差分析中当各组之间有显着差异时即原假设Ho被拒绝时采用Bonferronicorrected post hoc test进行分析,即事后校正法对原置信水平·进行修正。多元logistic 回归分析用以评估巨噬细胞迁移抑制因子与稳定型心绞痛患者复杂病变的关系,P值小于0.05被认为是有显着统计学差异。研究结果1.研究人群的基本情况本研究人群的年龄和男女性别比例构成反应了一个相对典型的冠心病人群的年龄和性别比例特征。与对照组相比,稳定型心绞痛组研究人群的血压(收缩压 135.44±19.78 VS.127.37±12.58 mmHg,P<0.05;舒张压 83.36±11.52 VS.79.13±9.95 mmHg,P<0.05)、总胆固醇(4.62±0.99 VS.4.20±0.83 mmol/L,P<0.05)、低密度脂蛋白胆固醇(2.68±1.00VS.2.49±0.92mmol/L,P<0.05)有明显升高的趋势,而高密度脂蛋白胆固醇的水平比对照组明显降低(1.03±0.30VS.1.12±0.28 mmol/L,P<0.05)。与对照组相比,急性冠脉综合征组研究人群的血压(收缩压136.03±17.29 VS.127.37±12.58 mmHg,P<0.05;舒张压 84.11±10.64 VS.79.13±9.95 mmHg,P<0.05)、空腹血糖(5.63[4.92-6.67]VS.5.15[4.67-5.81]mmol/L,P<0.05)、总胆古醇(4.88± 1.05VS.4.20±0.83mmol/L,P<0.05)、低密度脂蛋白胆固醇(2.93±0.73VS.2.49±0.92mmol/L,P<0.05)有着明显升高的趋势,而高密度脂蛋白胆固醇的水平比对照组明显降低(1.03±0.20 VS.1.12±0.28 mmol/L,P<0.05)。在冠心病组研究人群中,急性冠脉综合征组的病人比稳定型心绞痛组病人的低密度脂蛋白胆固醇明显升高(2.93±0.73 VS.2.68±1.00 mmol/L,P<0.05)。2.血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平稳定型心绞痛组病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于对照组(1.35[0.88-3.05]VS.0.18[0.14-0.33]ng/mL,P<0.05)。在冠心病组研究人群中,急性冠脉综合征组的病人的血淸巨噬细胞迁移抑制因子水平明显高于稳定型心绞痛组(3.06[1.97-5.201 VS.1.35[0.88-3.05]ng/mL,P<0.05)。3.稳定型心绞痛组研究人群的血清巨噬细胞迁移抑制因子水平根据冠状动脉造影的影像结果,稳定型心绞痛组病人被分为简单病变(n =50)和复杂病变(n = 48)两个亚组,我们的研究显示,复杂病变组研究人群的血清巨噬细胞迁移抑制因子水平明显高于简单病变组(1.98[1.02-4.01]VS.0.98[0.67-2.23]ng/mL,P<0.05)。多元logistic 回归分析显示血清巨噬细胞迁移抑制因子水平的升高与复杂病变的存在成独立相关(OR:1.46,95%CI:1.13-1.88;P =0.004)。4.急性冠脉综合征组研究人群的血清巨噬细胞迁移抑制因子水平根据冠状动脉造影的影像结果,急性冠脉综合征组病人被分为3个亚组:没有复杂病变(n =12);一处复杂病变(n =71);多处复杂病变(n =51),我们的实验显示,在急性冠脉综合征组的病人中,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与复杂病变数量之间有明显的正相关关系(没有复杂病变1.89[0.66-2.30]ng/mL,一处复杂病变 2.68[1.97-4.76]ng/mL,多处复杂病变 3.94[2.35-5.36]ng/mL,P<0.05)。研究结论根据本实验的研究结果,冠心病患者血清巨噬细胞迁移抑制因子水平和冠脉造影所示的复杂病变存在相关性。在稳定型心绞痛组患者中,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平的升高与复杂病变的存在成独立相关,鉴于其在易损斑块形成的病理生理过程中发挥的作用以及冠脉造影所示复杂病变与斑块易损性的关系,我们推测血清巨噬细胞迁移抑制因子有可能成为预测此类病人存在复杂病变和不稳定斑块的生物学标志物;在急性冠脉综合征组的病人中,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与复杂病变数量之间有明显的正相关关系,因此血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平可能成为一种生物学标志物反应急性冠脉综合征病人冠脉病变的复杂程度,由于多发的复杂病变与急性冠脉综合征患者的不良临床转归相关,因此,我们推测,血清中的巨噬细胞迁移抑制因子也可能是急性冠脉综合征患者疾病进展的一个预后标志物。研究背景心绞痛是由于暂时性心肌缺血引起的以胸痛为主要特征的临床综合征,稳定型劳力性心绞痛指心绞痛发作的程度、频度、性质及诱发因素在1-3个月内无显着变化。典型的心绞痛症状对诊断有重要价值,但是大约40%的稳定型心绞痛患者存在无症状的心肌缺血,临床症状与稳定型心绞痛的病变程度和预后没有直接关系。在过去的几十年中,由于诊断技术的更新,有效药物治疗的完善和越来越成熟的血运重建技术,很多冠心病稳定型劳力性心绞痛的病人得到了及时有效的救治,但是稳定型心绞痛仍然有很高的非致死性心肌梗死发生率和心血管病相关的死亡率。冠状动脉粥样硬化是稳定型心绞痛的主要原因,随着人们对稳定型心绞痛发病机制和临床转归认识的不断深入,尤其是一·些导致冠状动脉粥样硬化斑块不稳定和破裂的机制、冠状动脉血流和心肌需氧关系的研究,目前人们认为稳定型劳力性心绞痛治疗的主要目标是防止急性冠脉综合征的发生和改善缺血的症状,提高患者生活质量,其中预防急性冠脉综合征的发生尤为重要。临床工作中我们要对稳定型心绞痛进行危险分层,主要包括临床表现、对负荷试验的反应、左心室功能及冠状动脉造影显示的病变情况等,冠状动脉造影无疑仍是目前诊断冠心病的"金指标"和决定治疗策略的最重要手段,但但但在实际工作中医生应首先进行无创性检查,包括运动心电图、负荷超声心动图或心肌灌注扫描等,这些检查可以评价有轻、中度症状的患者的病情,并有助于危险分层,从而指导今后的治疗。但是这些无创评估手段很多也存在敏感性低、费用高等缺点,因此人们期待有更经济、安全、精确的可以用于稳定型心绞痛危险分层和预测患者预后的新的方法。谨慎的选择高危人群进行侵入性的检查和治疗不仅可以避免医疗资源的浪费,而且可以避免检查和治疗过程中的风险以及疾病并发症等相关风险,从而使更多人受益。除了传统的危险因素,各种生物学标志物也被用于评估稳定型心绞痛的危险分层和预后,如超敏C反应蛋白、肿瘤坏死因了-α等。巨噬细胞迁移抑制因子是一种促炎性因子,在有关人类的研究中,人们发现在有些心血管疾病中血清巨噬细胞迁移抑制因子的表达会上调,如冠心病。大量的证据显示巨噬细胞迁移抑制因子与动脉粥样硬化有密切的关系,并且在动脉粥样硬化的不同阶段都有表达,在动脉粥样硬化处的血管内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞和巨噬细胞都会分泌巨噬细胞迁移抑制因子,一旦被释放,巨噬细胞迁移抑制因子便与其受体CD74/CD44或CXCR2/4结合,结合后的巨噬细胞迁移抑制因子不仅可以诱导巨噬细胞粘附、迁移和向泡沫细胞转化,还影响到粥样硬化斑块的不稳定性,巨噬细胞迁移抑制因子在粥样硬化斑块的细胞结构、易损性和破裂方面起了十分重要的作用,并最终对引发冠状动脉内血栓形成的发生和发展产生了重要影响。近期有研究发现巨噬细胞迁移抑制因子在高血压、糖尿病、肥胖等代谢综合征的人群中也有显着升高。通过诸多研究我们相信巨噬细胞迁移抑制因子是动脉粥样硬化发生发展的重要因素,但是巨噬细胞迁移抑制因子是否是冠心病的独立危险因素仍存在争议,巨噬细胞迁移抑制因子是否与冠心病的的预后相关,目前仍没有定论,国内外相关的研究也较少。高血压是冠心病的重要危险因素,这一点已是不争的事实,无论人种或地域,血压和心血管事件危险性之间的关系连续一致,持续存在并且独立于其他危险因素。相当一部分冠心病的患者同时合并有高血压,并且与不合并高血压的冠心病患者相比,患有高血压的患者的冠心病的发病时间更早、疾病进展的速度更快并且预后也更差,临床中早期发现和恰当的检查、治疗无疑对于此类患者会有更大的获益。研究目的本研究的目的是测定冠心病稳定型心绞痛合并高血压和不合并高血压患者血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平,研究血清巨·噬细胞迁移抑制因子与稳定型心绞痛合并高血压患者发生主要不良心血管事件的相关性。研究方法(1)研究对象和分组在这项研究中,我们收集了 2014年10月至2015年10月至山东大学附属省立医院就诊的冠心病稳定型劳力性心绞痛患者,所有病人均在本次或既往入院诊治过程中做过冠状动脉造影明确有冠心病,总共有196例患者纳入研究中。根据是否患有高血压病,这些患者又被分为稳定型劳力性心绞痛合并高血压病组(n=101)和稳定型劳力性心绞痛不合并高血压病组(n =95)两个亚组,同时纳入了同时期50名冠状动脉造影证实冠状动脉未见明显狭窄的非冠心病患者作为对照组,有心力衰竭、1型糖尿病、继发性高血压、心肌病、感染性疾病、活动性炎症性疾病、肾功能衰竭、严重肝病、癌症、外周动脉疾病或血液病的患者被排除在外。稳定型劳力性心绞痛定义为冠心病劳力性心绞痛患者在入院前3个月内,疼痛诱发因素、疼痛的频率、持续时间、疼痛程度、疼痛缓解的方式均没有变化。(2)造影结果分析冠脉造影是在导管室中通过右侧桡动脉或股动脉进行常规的多方位投影,造影图像由两位有经验的介入专家进行分析,分析造影结果的人并不知道患者是我们实验的研究对象。(3)血样收集和生物学标志物的检测分析血标本的采集是在患者入院后第二天采患者的空腹静脉血,从肘静脉将静脉血抽到促凝管中,样品静置凝固30分钟后3000g离心15分钟,分离血清后放于-80摄氏度冰箱保存用于检测巨噬细胞迁移抑制因子,血清中巨噬细胞迁移抑制因子水平定量测定是使用商业酶联免疫吸附法测定试剂盒,批内和批间变异系数均小于10%,根据制造商的方案(R&D Systems,Minneapolis.MN)进行测定。低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和血清C反应蛋白在患者抽血后送交医院检验科,均使用标准的实验方案,在Hitachi7600全自动生化分析仪测定(Hitachi Co.,Tokyo,Japan)。(4)患者的随访所有患者接受随访,随访的方式为电话随访、门诊复诊或者查阅住院记录,随访频率为每90天一次,随访结束时间直到365天或者时间不足365天但是患者发生主要不良心血管事件,主要不良心血管事件为心源性死亡、非致死性急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、手术进行冠状动脉血运重建、心衰和因冠心病出现其他并发症而再次入院。比较患者入院时血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与365天内主要不良心血管事件的发生之间的关系。(5)数据分析数据分析采用SPSS 16.0(SPSS.Inc..Chicago,IL),结果为正态分布的连续变量表示为均数±标准差,非正态分布的连续变量表示为中位数(四分位数间距)。正态分布资料两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。非正态分布资料采用秩和检验。计数资料采用百分率表示,组间比较采用χ2检验。相关分析采用Pearson相关性检验。多因素分析采用l ogi stic回归模型分析。应用Kaplan-Meier曲线和Log-Rank检验比较两组间非校正的发生主要不良心血管事件的生存率。应用多元Cox 回归分析发生主要不良心血管事件的独立危险因素。P小于0.05为差异有统计学意义。研究结果(1)研究人群的基本情况冠心病稳定型心绞痛组和对照组的基本临床资料:叁组之间年龄、性别、高密度脂蛋白胆固醇水平、左室射血分数无显着差异(P>0.05);与对照组相比,冠心病稳定型心绞痛合并高血压病组研究人群的收缩压(138.55± 19.46 VS.118.68±11.55mmHg,P<0.05)、C反应蛋白(5.10±2.40VS.4.32± 1.98mg/L,P<0.05)、低密度脂蛋白胆固醇(3.4±0.57 VS.2.44±0.58 mmol/L,P<0.05)均有明显升高的趋势,吸烟人数(52.9%VS.42.0%,P<0.05)和患有2型糖尿病的人数(46.1%VS.0,P<0.05)有显着差异;在冠心病稳定型心绞痛合并高血压病组的病人中,患有2型糖尿病的患者显着高于稳定型心绞痛不合并高血压组(46.1%VS.28.6%,P<0.05)。(2)血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平稳定型心绞痛合并高血压组病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于对照组(2.53[1.95-3.14]VS.0.16[0.14-0.23]ng/mL,P<0.05);稳定型心绞痛不合并高血压组病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于对照组(1.93[0.94-2.34]VS.0.16[0.14-0.23]ng/mL,P<0.05);在稳定型心绞痛组研究人群中,合并高血压的病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显高于不合并高血压组(2.53[1.95-3.14]VS.1.93[0.94-2.34]ng/mL,P<0.05)。(3)主要不良心血管事件的发生情况总共有196名冠心病稳定型心绞痛患者完成了随访,稳定型心绞痛合并高血压组病人发生主要不良心血管事件的人数为32人(31.7%),其中发生非致死性心肌梗死的人数为2人,发生不稳定型心绞痛者为25人,未发生急性冠脉综合征而进行冠状动脉血运重建者5人;稳定型心绞痛不合并高血压组病人发生主要不良心血管事件的人数为14人(14.7%),其中发生不稳定型心绞痛者12人,未发生急性冠脉综合征而进行冠状动脉血运重建者2人。稳定型心绞痛合并高血压组病人发生主要不良心血管事件患者血清巨噬细胞迁移抑制因子水平明显高于未发生者(3.22[3.06-3.34]VS.2.18[1.41-2.64]ng/mL,P<0.05);稳定型心绞痛不合并高血压组病人发生主要不良心血管事件患者巨噬细胞迁移抑制因子水平与未发生者相比无显着差异(2.37[0.98-2.85]VS.1.73[0.93-2.20]ng/mL,P>0.05)。Kaplan-Meier分析发现,在稳定型心绞痛合并高血压组,与血清巨噬细胞迁移抑制因子水平较低者相比,巨噬细胞迁移抑制因子水平较高者主要不良心血管事件的发生有显着升高的趋势(P=0.001),而在稳定型心绞痛不合并高血压组患者血清巨噬细胞迁移抑制因子水平的高低与主要不良心血管事件的发生无明显相关性(P=0.6072)。(4)血清巨噬细胞迁移抑制因子水平与预后的关系在稳定型心绞痛合并高血压组病人中,采用单因素COX回归分析发现,血清巨噬细胞迁移抑制因子水平(风险系数为1.62,95%的置信区间为1.23-2.13,P=0.001)、2型糖尿病(风险系数为1.86,95%的置信区间为1.25-2.76,P=0.002)、低密度脂蛋白水平(风险系数为1.43,95%的置信区间为0.98-2.10,P=0.043)与主要不良心血管事件的发生有显着的相关性,将単因素COX回归分析中P值小于0.3的危险因素,包括吸烟、2型糖尿病、C反应蛋白、低密度脂蛋白胆固醇、巨噬细胞迁移抑制因子水平,做多元COX回归分析发现,巨噬细胞迁移抑制因子水平与主要不良心血管事件的发生有显着相关性(风险系数为1.55,95%的置信区间为1.15-2.08,P=0.004),对主要不良心血管事件的发生有显着独立预测价值。研究结论我们的研究结果表明稳定型心绞痛合并高血压病人的血清巨噬细胞迁移抑制因子的水平明显升高,并且巨噬细胞迁移抑制因子水平升高越明显主要不良心血管事件的发生率越高,因此,我们的研究结果表明,血清中的巨噬细胞迁移抑制因子可能是提示冠心病稳定型心绞痛合并高血压患者发生主要不良心血管事件的一种显着、独立的预测因子。
王晨[6]2016年在《孕母及新生儿维生素D水平的临床研究》文中提出目的了解北京协和医院秋冬季出生新生儿的维生素D水平,并探讨其影响因素。方法选择2014年9月1日至2015年2月28日在我院出生后转入儿科的新生儿,除外重度窒息、贫血、先天遗传代谢性疾病患儿。调查母亲孕期日晒、膳食和维生素D补充情况,用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法检测新生儿生后48h内静脉血清25(OH)D水平。新生儿血清总25(OH) D≤15ng/ml为维生素D缺乏；>15且≤20ng/ml为维生素D不足；>20ng/ml为维生素D充足。生后1周内使超声骨声纳仪测左胫骨中1／3段内侧面骨密度。结果141例研究对象入选,其孕母均于北京协和医院规律产检。新生儿血清25(OH)D水平(14.5±6.5) ng/ml,维生素D缺乏77例(54.6%),不足31例(22.0%)。不同胎龄、性别、胎数、小于胎龄儿(SGA)与适于胎龄儿(AGA)新生儿维生素D水平差异无统计学意义(P>0.05)。孕母产前体质指数(BMI)>27的新生儿血清25(OH)D水平低于BMI≤27者[(12.9±6.6)比(15.7±6.4)ng/ml,P=0.015]；孕母年龄≥28岁的新生儿血清25(OH)D水平高于孕母年龄<28岁者[(14.84±6.5)比(8.8±5.7) ng/ml,P=0.008]；冬季出生新生儿血清25(OH)D水平低于秋季出生新生儿[(13.4+6.0)比(16.8±7.2) ng/ml, P=0.004];孕期日晒时间≥40min/d比<40min/d的新生儿血清25(OH)D水平高[(16.9±±7.4)比(13.9±6.3) ng/ml, P=0.033];孕中晚期补充维生素D剂量≥600 IUd母亲的新生儿血清25(OH)D水平高于<600 IU/d者[(16.9±5.5)比(12.2±5.8) ng/ml, P<0.001];不同孕母学历新生儿血清25(OH)D水平差异有显着性(t=5.854,P<0.001)。秋季与冬季出生新生儿维生素D充足、不足、缺乏比例分别为40.0%,17.8%,42.2%比15.6%,24.0%,60.4%,,=10.167,P=-0.006。孕中晚期补充维生素D剂量≥600 IU/d组比<600 IU/d组新生儿维生素D充足、不足、缺乏比例分别为35.9%,23.4%,40.6%比13.0%,20.8%,66.2%,χ2=12.175,P=0.002。孕母产前BMI>27组比≤27组新生儿维生素D充足、不足、缺乏比例分别为15.6%,18.8%,65.6%比29.8%,24.7%,45.5%,χ2=6.192,P=-0.045。新生儿总25(OH)D水平与孕母产前BMI呈负相关(r=-0.306,P<0.001),与孕中晚期补充维生素D剂量呈正相关(r=0.482,P<0.001)。多因素回归分析显示出生季节、母亲孕中晚期补充维生素D剂量、孕母产前BMI均为新生儿血清25(OH)D水平的独立影响因素。多因素Logistic回归分析显示孕中晚期补充维生素D剂量≥600IU/d与孕母学历相关(OR=7.576,95%CI:1.771～32.410, P=0.006),与分娩季节相关(OR=2.641,95%CI:1.194～5.842, P=0.017)。出生体重≥1500g新生儿骨密度高于出生体重<1500g新生儿骨密度(3041±162 m/s比2879±206 m/s,t=2.684,P=0.008)。未发现新生儿骨密度与孕中晚期维生素D补充量(IU/d)与新生儿总25(OH)D水平相关。早产儿骨密度与胎龄呈正相关。结论秋冬季出生新生儿维生素D缺乏发生率高。孕期补充维生素D600IU/d不足以有效预防新生儿维生素D缺乏。未发现新生儿维生素D水平对新生儿骨密度有影响。目的探讨孕母与新生儿维生素D水平的影响因素及二者的相关性。方法2015年6月1日至7月10日连续收集足月单胎新生儿脐静脉血及其孕母分娩前一周内的静脉血,采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法测定血清25(OH)D水平。分析其影响因素及相关性。孕母血清总25(OH)D≤20ng/mL为维生素D缺乏；>20 ng/mL且≤30 ng/mL为维生素D不足；>30 ng/mL为维生素D充足。新生儿血清总25(OH)D≤15ng/ml为维生素D缺乏；>15且≤20ng/ml为维生素D不足；>20ng/ml为维生素D充足。孕前BMI<24且孕期体重增≤15埏,或孕前BMI≥24且孕期体重增长≤12kg为体重增长正常。结果102对新生儿及其孕母入选。孕母血清总25(OH)D水平(26.9±9.8)ng/ml。其中维生素D充足者38例(37.3%),不足者39例(38.2%),缺乏者25例(24.5%)。新生儿脐血血清总25(OH)D水平(13.1±5.0)ng/ml。其中维生素D充足者9例(8.8%),不足者27例(26.5%),缺乏者66例(64.7%)。孕中晚期补充维生素D剂量-≥600IU/d、孕前BMI<24、孕期体重增长正常、产前BMI<27组孕母25(OH)D水平分别高于孕中晚期补充维生素D剂量<600IU/d、孕前BMI≥24、孕期体重增长超标、产前BMI≥-27组[(31.7士9.5)比(24.1±8.9)ng/ml,(28.1±9.2)比(23.2±11.1)ng/ml,(28.4±10.2)比24.5±8.7ng/ml,(29.1±10.1)比(25.1±9.2)ng/ml,P均<0.05]。孕中晚期补充维生素D剂量≥600IU/d、孕前BMI<24、孕期体重增长正常组孕母维生素D不足或缺乏构成比分别低于孕中晚期补充维生素D剂量<600IU/d、孕前BMI>24、孕期体重增长超标组(P均<0.05)。二变量相关分析显示,孕母25(OH)D水平与孕中晚期补充维生素D剂量呈正相关(r=0.467,P<0.001),与孕前BMI呈负相关(r=-0.198,P=0.046),与产前BMI呈负相关(r=-0.316,P=0.001)。多因素回归分析显示孕中晚期补充维生素D剂量、孕前BMI、孕期体重增长为孕母25(OH)D水平的独立影响因素。单因素分析显示,孕母维生素D不足或缺乏组比充足组孕中晚期补充维生素D剂量更低,孕前BMI更高,孕期体重增长超标人数比例更多,产前BMI更高(P均<0.05)。多因素Logistic回归分析显示孕母维生素D不足或缺乏与孕中晚期补充VitD剂量相关(OR=0.997,95%CI:0.995～0.999,P=0.008),与产前BMI相关(OR=1.212,95%CI:1.041～1.411,P=0.013)。孕中晚期补充维生素D剂量≥600IU/d组、母亲孕期体重增长正常组新生儿总25(OH)D水平分别高于孕中晚期补充维生素D剂量<600IU/d组孕期体重增长超标组[(15.4±5.0)比(11.7±4.5) ng/ml,(14.1±5.1)比(11.6±4.5) ng/ml, P<0.05]。脐血25(OH)D水平与与孕期体重增长呈负相关(r=-0.220,P)=0.026),与产前体质指数呈负相关(r=-0.283,P)=0.004),与孕中晚期补充维生素D剂量呈正相关(r=0.572,P<0.001)。多因素回归分析显示孕中晚期补充维生素D剂量、产前BMI为新生儿25(OH)D水平的独立影响因素。多因素Logistic回归分析显示新生儿维生素不足或缺乏与孕中晚期补充维生素D剂量相关(OR=0.998,95%CI:0.995～1.000,P=0.034),与孕期体重增长相关(OR=1.343,95%CI1.071～1.684,P=0.011)。不同孕母25(OH)D水平组新生儿25(OH)D水平存在差异(F=0.914,P<0.001)。孕母与新生儿维生素D水平呈正相关(r=0.914,P<0.001)。孕母25(OH)D ROC曲线预测新生儿维生素D缺乏(≤15ng/ml)的曲线下面积0.962,95%CI:0.930-0.994,P<0.001。孕母血清25(OH)D≤27.55 ng/ml为界值预测新生儿维生素D缺乏的灵敏度97.2%,特异度80.3%。结论孕中晚期补充维生素D剂量、孕前BMI、孕期体重增长是否正常、产前BMI对孕母25(OH)D水平有显着性影响。孕中晚期补充维生素D剂量高是孕母维生素D不足或缺乏的保护因素,孕前BMI高是孕母维生素D不足或缺乏的危险因素。孕中晚期补充维生素D剂量、孕期体重增长是否正常对新生儿25(OH)D水平有显着性影响。孕中晚期补充维生素D剂量高是新生儿维生素D不足或缺乏的保护因素,孕期体重增长过高是新生儿维生素D不足或缺乏的危险因素。孕母维生素D水平与新生儿维生素D水平正相关,孕母维生素D水平可预测新生儿维生素D缺乏。目的探讨维生素D严重缺乏新生儿补充维生素D 4周后的维生素D状况。方法选取2015年6月1日至2015年7月10日在北京协和医院出生、脐血25(OH)D≤10ng/ml的足月单胎新生儿,生后2周起每日口服补充维生素D500IU。补充4周后,用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法(ID-UPLC/MS/MS)检测婴儿静脉血血清25(OH)D水平。血清总25 (OH) D>20ng/ml为维生素D充足；>15且≤20ng/ml为维生素D不足；≤15ng/ml为维生素D缺乏；≤10ng/ml为维生素D严重缺乏。结果脐血25(OH)D≤10ng/ml者26例。补充维生素D4周后血清25(OH)D水平明显升高[(25.3±5.4) ng/ml vs. (6.7±2.1) ng/ml,t=21.715, P<0.001]。20例(76.9%)维生素D充足,6例(23.1%)维生素D不足。婴儿维生素D充足组较不足组新生儿脐血及孕母25(OH)D水平均更高[(7.5±1.7)ng/ml比(4.2±0.6) ng/ml, t=4.541, P<0.001] [(16.5±3.9) ng/ml比(9.8±2.8) ng/ml,t=3.877,P=0.001]。孕母25(OH)D水平>15ng/ml的婴儿补充维生素D4周后25(OH)D水平高于孕母25(OH)D水平15ng/ml的婴[(28.0±3.2) ng/ml vs. (23.0±5.9)ng/ml,t=2.623, P=0.015]。脐血25(OH)D水平>5ng/ml者补充维生素D4周后婴儿血25(OH)D水平高于脐血25(OH)D水平≤5 ng/ml者[(27.5±3.8) ng/ml vs. (17.8±2.0) ng/ml,t=6.434, P<0.001]。婴儿血25(OH)D水平与脐血25(OH)D水平相关(r=0.750,P<0.001),与孕母25(OH)D水平相关(r=0.557,P=0.003),未发现与喂养方式或生后体重增长相关。结论建议脐血25(OH)D水平≤5ng/ml的新生儿生后补充比500IU／d更高剂量的维生素D。
李严霜[7]2016年在《血清MIF、CKLF1及FKN水平与急性缺血性脑卒中的相关性及临床意义研究》文中研究表明研究目的脑卒中是我国排名第二位的致死疾病以及最主要的致残疾病,常常导致患者严重的运动能力缺失,生活质量严重下降。脑卒中导致的神经功能缺损不仅给患者身体和精神上带来了巨大的痛苦,也给家庭其他成员以及社会带来了沉重的经济负担。在我国,急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)约占全部脑卒中的80%。深入的了解AIS的发病机制、AIS后的病理生理过程,有助于找到AIS新的治疗靶点以及制定新的治疗策略。AIS的发病机制及AIS发生后的病理生理过程十分复杂。包括趋化因子在内的众多细胞因子在AIS发生、发展及恢复过程中都发挥了重要的作用。巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)是进化过程中的一个保守蛋白质,分子量约12kDa。MIF不仅是先天免疫的重要调节因子,还参与了多种炎性疾病的病理生理过程。近年来,MIF在AIS中扮演的角色逐渐引起了人们的关注。然而,MIF在AIS中到底是起保护作用还是损伤作用还有争论。MIF与AIS患者临床特征的相关性及临床意义并未完全明确。趋化素样因子1(chemokine-like factor 1,CKLF1)属于趋化素样超家族。一系列动物实验显示CKLF1在AIS中具有重要的作用。基础研究中CKLF1在AIS中表现为一个损伤因素。然而AIS患者血液中CKLF1水平是否升高?CKLF1水平的变化是否与AIS患者的临床特征具有一定的相关性?这些问题都需要进行大量的相关临床研究来回答。不规则趋化因子(Fractalkine,FKN)是CX3C类趋化因子中唯一成员。FKN在多种疾病中,包括动脉粥样硬化、脉管炎、类风湿关节炎等发挥重要作用。近年来,有研究对FKN在AIS中的作用进行探索。目前,FKN在中国患者与AIS的相关性未见报道。FKN与AIS患者临床特征之间的关系也不明确。已有的研究显示MIF、CKLF1及FKN在AIS中具有重要的作用。然而,相关的临床研究并不充分。本研究将重点探索MIF、CKLF1及FKN与AIS临床特征的相关性及这些细胞因子在AIS中的临床意义。研究方法1、病例资料收集2014年12月至2015年9月在山东大学附属济南市中心医院神经内科住院被诊断为AIS患者的病例资料329例,符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准,且排除入院时合并发热,感染,肿瘤,风湿类疾病的患者。本研究排除了102例症状发作24小时后的患者、72例AIS复发的患者及9例关键临床数据不完善的患者。最终共计146例AIS患者被纳入本研究。同时选取在健康查体中心查体的无脑血管病史的45例查体者作为对照组,匹配年龄和性别。记录AIS患者及健康对照人群与心脑血管疾病风险有关的基本信息,完善心脑血管疾病风险相关的其它实验室检查结果并记录。2、按照试剂的实验方案用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)的方法对AIS患者发病24小时内及3月后随访时的血清MIF、CKLF1、 FKN水平进行检测,同时检测对照组血清MIF、CKLF1、FKN水平。3、病灶的影像学评估、患者临床预后的评估及随访颅脑MRI检查在AIS患者入院内24小时完成。梗死灶体积V=0.5XaXbX C。a为病灶的最大纵径,b为病灶的垂直于a的最大横径,c为包含梗死灶的10mm扫描层面的数目。患者临床预后的评估采用mRS评分(modified Ranking Scale)标准。3个月时,患者mRS 0-2分定义为预后良好,而mRS 3-6分定义为预后不良。随访时间为AIS发病后3个月。随访的内容包括患者神经功能缺损恢复情况,进行mRS评分。随访方式为门诊随访。4、统计学分析本研究测定的连续变量数值用均数±标准差(x±s)表示,采用t检验分析；不同组间数值的比较采用Mann-Whitney U检验以及卡方检验；相关性分析采用斯皮尔曼等级相关分析;采用Logistic回归进行多因素分析；采用IBM SPSS 20统计软件进行数据分析,P<0.05表示差异有统计学意义。绘图采用GraphPad Prism 5软件。结果]、AIS患者的基本资料及实验室检查结果本研究共纳入了146例AIS患者及45例健康对照组。AIS患者组和对照组相比较,年龄、性别、吸烟史等没有显着差异。AIS患者组高血压、糖尿病和高血脂症的患病比例要显着高于对照组。2、MIF的相关结果1)AIS患者24小时内血清MIF水平为1.230ng/ml,而对照组平均血清MIF水平为0.876ng/ml,两组之间有显着差异(P<0.0001)：在各个亚型AIS患者中,MIF水平都高于对照组；AIS患者慢性期的血清MIF水平明显下降,低于急性期的血清MIF水平(P<0.001),且与对照组无明显差别(P=0.392)。2)斯皮尔曼等级相关分析结果显示24小时内血清MIF水平与梗死灶体积呈正相关(r=0.5515,P<0.0001)；24小时内血清MIF水平与NIHSS评分也呈正相关(r==0.5190,P<0.0001)。3)预后不良组患者的血清MIF水平显着高于预后良好组；多因素分析结果显示,血清M1F水平升高为AIS预后不良的一个独立预测因素,OR值为1.113(P=0.005,95%CI：I.05 ]-1.238)。4)血清MIF水平在AIS预测及诊断中的价值研究中,多因素分析结果显示血清MIF水平是AIS的一个独立预测因素,OR值为1.985(95%CI,1.672-2.252,P=0.011);我们采用受试者工作特征曲线来评估血清MIF水平诊断AIS的价值。血清MIF水平的最佳截断值为0.821ng/ml,相对应的敏感性为74.7%,特异性为66.7%,曲线下面积为0.717(95% CI,0.638-0.796)。血清MIF水平在AIS诊断中展现出中等的辨别能力。3、CKLF1的相关结果1)AIS患者组平均血清CKLF1水平为37.730pg/ml,而正常对照组平均血清CKLF1水平为31.884pg/ml。AIS患者组的血清CKLF1水平显着高于对照组(P<0.0001)。每个亚型患者的血清CKLF1水平都要高于对照组；AIS患者发病3个月时血清CKLF1水平明显下降,低于急性期的血清CKLF1水平(P<0.001)。而与对照组无明显差别。2)斯皮尔曼等级相关分析结果显示24小时内血清CKLF1水平与梗死灶体积无明显相关(r==0.1417,P=0.0879)；24小时内血清CKLF1水平与NIHSS评分也无明显相关性(r=0.1230,P=0.1391)。3)预后不良组患者的血清CKLF1水平显着高于预后良好组(P=0.005)。4、FKN的相关结果1)AIS患者组平均血清FKN水平为106.043pg/ml,而对照组平均血清FKN水平为80.621pg/ml,AIS患者组的血清FKN水平显着高于对照组(Z=8.821,P<0.0001)。每个亚型患者的血清FKN水平都要高于对照组。AIS患者慢性期的血清FKN水平明显下降,低于急性期的FKN血清水平(P<0.001)。仍然明显高于正常对照组的血清FKN水平(P<0.001)。2)斯皮尔曼等级相关分析结果显示24小时内血清FKN水平与梗死灶体积无明显相关(r=0.05947,P=0.4758)；24小时内血清FKN水平与NIHSS评分也无明显相关性(r--0.06708,P=0.4211)。3)预后不良组患者的24小时内血清FKN水平与预后良好组患者的FKN水平无显着差别(P=0.868)。而3个月时,预后不良组患者的血清FKN水平显着低于预后良好组患者(P<0.001)结论及意义1、首次发现24小时内血清MIF水平与AIS患者梗死灶体积、NIHSS评分呈正相关：24小时内血清MIF水平可以作为AIS患者的一个预后指标。2、首次发现AIS患者24小时内血清CKLF1水平上升。3、首次在中国人中证实AIS患者24小时内血清FKN水平显着上升；首次发现AIS患者3个月时血清FKN水平仍高于正常水平,且预后不良组患者的血清FKN水平显着低于预后良好组患者。提示外源性FKN可能是AIS的潜在的治疗手段。
张霞[8]2007年在《几种药物小分子与牛血清白蛋白相互作用的光谱法研究》文中研究指明木论文共分为五个部分，主要对近年来小分子与血清白蛋白相互作用的研究现状进行了综述，并分别研究了几种药物小分子与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的相互作用。光谱法在小分子与生物大分子相互作用的研究领域的应用日益广泛，但是光谱法结合化学计量学来探讨小分子与血清白蛋白的结合作用的文章还比较少。本论文尝试将化学计量学方法多元曲线分辨-交替最小二乘法用于解析实验得到的光谱数据，讨论了方法的原理和实际应用，并探讨了化学计量学在复杂的生物化学体系中实现同时解析多组分平衡浓度和纯光谱的可行性。第一部分：本节首先简要介绍了蛋白质的结构、功能和性质，然后依次对小分子与蛋白质相互作用的研究方法、研究内容以及不同小分子与蛋白质相互作用的研究等方面展开了评述，最后探讨了化学计量学在蛋白质研究中的应用。第二部分：用荧光光谱法研究了抗抑郁药-盐酸曲唑酮(trazodone hydrochloride，TZH)与BSA的相互作用，初步探讨了TZH对BSA荧光的猝灭机理，并用荧光猝灭法测定了TZH与BSA相互作用的位点数n和结合常数K。然后根据不同温度下的热力学常数确定了TZH与BSA之间的作用力类型。本节还探讨了siteⅠ标记药物保泰松与siteⅡ标记药物布洛芬与TZH的竞争结合作用，并根据蛋白质结合位上药物的置换作用确定了TZH在BSA上的作用位点为siteⅠ。第叁部分：用光谱法研究了抗结核药吡嗪酰胺与BSA的相互作用，初步探讨了吡嗪酰胺对BSA荧光的猝灭机理为静态猝灭，并用荧光猝灭法测定了作用的位点数n和结合常数K。根据不同温度下的热力学常数确定了吡嗪酰胺与BSA之间的作用力主要是氢键和范德华力作用。根据F(o|¨)rster非辐射能量转移原理，测定了实验条件下吡嗪酰胺与BSA相互结合时，能量授体-受体的结合距离。并用同步荧光和紫外光谱法研究了吡嗪酰胺对BSA构象的影响。第四部分：用荧光光谱法，紫外光谱法和电化学方法研究了生理条件下黄酮类中药小分子槲皮素(quercetin)与BSA的相互作用。荧光法主要分为两部分：荧光猝灭和荧光敏化。为了确定槲皮素在BSA上的作用位点，引入siteⅠ标记药物华法林(Warfarin)。紫外和荧光竞争结合实验表明，槲皮素与华法林之间存在协同作用，它们之间形成了quercetin-BSA-warfarin叁元络合物，槲皮素与华法林作用在BSA上的相同位点，都在BSA的siteⅠ。叁种物质(quercetin-BSA，warfarin，quercetin-BSA-warfarin)紫外光谱重迭比较严重，化学计量学方法多元曲线分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)用于解析叁者相互作用的二维紫外数据，得到了叁者相互作用的络合比和平衡常数。第五部分：本文用荧光光谱法研究了抗生素类药物四环素(tetracycline，TC)与BSA的相互作用。为了突破传统的标记药物的局限性，尝试了开发新的染料荧光探针曙红Y(eosin Y，EY)。荧光竞争实验主要分为两个部分：第一部分是用经典的siteⅠ标记药物华法林(Warfarin，WF)来确定尝试开发的染料探针EY在BSA上的作用位点，采集了二维荧光数据，并用化学计量学方法多元曲线分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)对采集的二维数据进行了解析，确定了EY在BSA上的作用位点。第二部分是将开发的染料探针EY用于确定目标药物TC在BSA上的作用位点，同样采集了二维荧光数据，并用化学计量学方法MCR-ALS对数据进行了解析。同时，荧光偏振实验的结果也辅助说明了TC在BSA上的作用位点为siteⅠ。另外，我们还用同步荧光法研究TC对BSA构象的影响，实验发现，TC的加入不会影响BSA的构象。与传统的蛋白质标记药物相比，新开发的蛋白质标记药物EY显示了更大的优越性。
方中[9]2016年在《sST2和cystatin C对射血分数保留心衰患者诊断及预后预测的研究》文中进行了进一步梳理第一部分射血分数保留心衰与射血分数减低心衰患者临床特征的比较目的：对比分析射血分数保留心衰与射血分数减低心衰患者临床特征的差异。方法：选取于2014年5月至2015年1月在安徽省池州市人民医院心内科住院的心力衰竭患者288例,男性182例,女性106例；其中射血分数保留心衰(HF-PEF)患者120例,射血分数减低心衰(HF-REF)患者168例。收集患者的性别、年龄、高血压、冠心病、心房颤动、心功能情况、血红蛋白、血肌酐、血尿酸、甘油叁酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、NT-proBNP及估测肾小球滤过率(eGFR)值。心功能分级采用NYHA分级。eGFR用适合中国人的改良简化MDRD方程计算。eGFR (ml/min/1.73m2)：186x血肌酐(mg/dL)-1154×年龄(岁)-0.203×1.33×0.742(2(女性)。记录患者的超声心动图指标：左房内径、左室舒张末期内径、室间隔厚度、左室后壁厚度、射血分数、E峰、A峰及E/A峰。比较HF-PEF与HF-REF患者的生化指标及超声指标,比较HF-PEF与HF-REF患者的心功能分级情况。结果： (1)本组资料中住院的288例心力衰竭患者,其中HF-PEF组患者120例,占41.67%。HF-PEF组患者的年龄为65.61±9.74岁,而HF-REF组患者的年龄为62.53±11.51岁,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。HF-PEF组患者中女性55例(45.83%),HF-REF组患者中女性5l例(30.36%),两组比较,HF-PEF组中相对女性居多,差异具有统计学意义(P<0.05)。HF-PEF组患者合并有高血压的比例高于HF-REF组患者(P<0.05)；HF-PEF组患者合并有冠心病的比例高于HF-REF组患者(P<0.05)；HF-PEF组患者合并有心房颤动的比例高于HF-REF组患者(P<0.05)。(2)与HF-REF组患者对比,HF-PEF组患者的血红蛋白、血肌酐、血尿酸及LgNT-proBNP值较低,差异有统计学意义(P<0.05)。HF-PEF组患者的eGFR值高于HF-REF组患者(P<0.05)。(3)HF-REF组患者的左房内径、左室舒张末期内径、E峰值及E/A峰值较HF-PEF组患者大(尸<0.01)；而HF-PEF组患者室间隔厚度、左室后壁厚度、EF值及A峰值较HF-REF组患者大,差异均有统计学意义(P<0.01)。(4)HF-PEF组按NYHA心功能分级,心功能Ⅱ级28例(23.33%)、心功能Ⅲ级74例(61.67%)、心功能Ⅳ级18例(15.00%)。HF-REF组按NYHA心功能分级,心功能Ⅱ级33例(19.64%)、心功能Ⅲ级105例(62.50%)、心功能Ⅳ级30例(17.86%)。两组比较,在NYHA心功能分级上差异无显着性(P>0.05)。结论： (1)在心力衰竭患者中,HF-PEF患者的发生率高。(2)与HF-REF组患者比较,HF-PEF组患者的女性多,年龄偏大；且多合并高血压、冠心病及心房颤动。(3)HF-PEF组患者的NT-proBNP值较HF-REF组患者低,NT-proBNP对于HF-REF患者的评估价值可能更大。(4)超声心动图广泛应用于HF-PEF及HF-REF患者的评价,目前仍是HF-PEF患者最重要的诊断手段。第二部分sST2和cystatin C对射血分数保留心衰患者的诊断价值研究目的：评估血清sST2和cystatin C在射血分数保留心衰患者中的诊断价值。方法：选取于2014年5月至2015年1月在安徽省池州市人民医院心内科住院的射血分数保留的心力衰竭(HF-PEF)患者120例,其中男性65例(占54.17%),女性55例(占45.83%),年龄为65.61±9.74岁。健康对照组82例,为同期在安徽省池州市人民医院体检中心进行体检的健康人群,其中男性45例(占54.88%),女性37例(占45.12%),年龄为64.79±9.68岁。两组间性别、年龄等基线资料经检验差异无统计学意义,具有可比性。测定HF-PEF组患者与健康对照组人群的血清sST2、cystatin C及NT-proBNP。收集HF-PEF组患者与健康对照组人群的性别、年龄、射血分数、心功能情况、血清sST2、NT-proBNP及血清cystatinC值。心功能分级采用NYHA分级。比较HF-PEF组患者与健康对照组人群的sST2、cystatin C及LgNT-proBNP值；同时比较不同心功能分级的HF-PEF组患者的血清sST2及cystatin C水平。sST2、cystatin C与LVEF、LgNT-proBNP之间的关系用双变量相关分析,采用Pearson直线相关分析。应用ROC曲线下面积评价sST2、cystatin C及与NT-proBNP联合检测在诊断HF-PEF中的价值。结果： (1)HF-PEF组患者的sST2、cystatin C、LgNT-proBNP水平较健康对照组人群明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)在HF-PEF 组患者中,心功能Ⅳ级患者血清sST2水平明显高于心功能Ⅲ级和心功能Ⅱ级患者,心功能Ⅲ级患者sST2水平高于心功能Ⅱ级患者,叁组间均有统计学差异(P<0.05)。血清cystatin C水平随心功能级别递增而逐渐升高,叁组间均有统计学差异(P均<0.01)。(3)Pearson直线相关分析显示,血清sST2与LVEF无相关性。血清cystatin C与LVEF呈负相关(r=-0.162,P<0.05)。血清sST2值与NT-proBNP对数值呈正相关(r=0.771,P<0.05)。血清cystatin C值与NT-proBNP对数值呈正相关(r=0.220,P<0.05)。(4)作血清sST2、cystatin C及NT-proBNP诊断HF-PEF的ROC曲线。血清sST2诊断HF-PEF的曲线下面积为0.635(95%CI：0.534-0.735),最佳界值为49.63pg/ml,敏感度为53.75%,特异度为83.33%；血清cystatin C诊断HF-PEF的曲线下面积为0.841(95%CI：0.761-0.922),最佳界值为0.99mg/L,敏感度为80.00%,特异度为77.78%；血清NT-proBNP诊断HF-PEF的曲线下面积为0.849(95%CI：0.774-0.924),最佳界值为512.95pg/ml,敏感度为71.25%,特异度为75.00%。(5)作血清sST2+NT-proBNP、 cystatin C+NT-proBNP及NT-proBNP诊断HF-PEF的ROC曲线。血清sST2+NT-proBNP诊断HF-PEF的曲线下面积为0.868(95% CI：0.801-0.934)；血清cystatin C+NT-proBNP诊断HF-PEF的曲线下面积为0.911(95% CI：0.857-0.966)。结论： (1)HF-PEF患者的血清sST2及cystatin C水平通常高于健康人群。(2)HF-PEF患者的血清sST2及cystatin C水平与心力衰竭的心功能严重程度明显相关,可作为心功能不全程度的预测因子。(3)血清sST2和cystatin C是诊断HF-PEF的新生物标志物；血清sST2、cystatin C与NT-proBNP的联合应用比单独使用NT-proBNP可提高对HF-PEF诊断的价值。血清sST2及cystatin C可成为NT-proBNP诊断HF-PEF的补充手段,提高对HF-PEF的诊断价值。第叁部分sST2和cystatin C对射血分数保留心衰患者预后的预测研究目的：评估血清sST2和cystatin C在射血分数保留心衰患者预后中的预测价值。方法：选取于2014年6月至2015年8月在安徽省池州市人民医院心内科住院的射血分数保留的心力衰竭(HF-PEF)患者220例,其中男性132例,女性88例,年龄为68.35-10.82岁。测定患者的血清sST2、cystatin C及NT-proBNP。收集患者的性别、年龄、射血分数、血清sST2、NT-proBNP及血清cystatin C值。根据血清sST2水平将HF-PEF患者分为两组,即sST2低水平组：血清sST2≤50 pg/ml, sST2高水平组：血清sST2>50pg/ml。根据血清cystatin C水平将HF-PEF患者分为两组,即cystatin C正常组：血清cystatin C≤1.15 mg/L, cystatin C升高组：血清cystatin C>1.15 mg/L。入选患者在住院期间及出院后均给予规范化治疗。随访患者出院后的全因死亡情况和心源性再住院情况。联合终点事件是指患者发生全因死亡/心源性再住院(全因死亡或心源性再住院)。预后随访的时间为至少6个月(180天),对于随访期间已知发生联合终点事件的则终止随访。随访方式采用电话和门诊相结合的随访方式。采用ROC曲线分析血清sST2. cystatin C及与NT-proBNP联合应用在HF-PEF患者预后中的价值。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,生存分析采用Log-rank检验。结果：(1)入选的HF-PEF患者共随访180-420天,中位随访时间270天。随访期间共有17例患者死亡,发生率为7.73%,心源性再住院的共有78例,发生率为35.45%。(2)作血清sST2、cystatin C及NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡的ROC曲线。血清sST2预测HF-PEF患者发生全因死亡的曲线下面积为0.704(95%CI：0.563-0.846),最佳界值为63.02pg/ml,敏感度为58.82%,特异度为81.77%；血清cystatin C预测HF-PEF患者发生全因死亡的曲线下面积为0.774(95%CI:0.667-0.882),最佳界值为1.20mg/L,敏感度为70.59%,特异度为78.33%；而血NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡的曲线下面积为0.428(95%CI：0.259～0.596)。(3)作血清sST2、cystatin C及NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡／心源性再住院的ROC曲线。血清sST2预测HF-PEF患者发生全因死亡/心源性再住院的曲线下面积为0.596(95%CI: 0.514-0.678),最佳界值为75.85pg/ml,敏感度为26.92%,特异度为95.77%；血清cystatinC预测HF-PEF患者发生全因死亡／心源性再住院的曲线下面积为0.605(95% CI：0.524-0.686),最佳界值为1.34mg/L,敏感度为33.33%,特异度为90.14%；而血NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡／心源性再住院的曲线下面积为0.517(95%CI：0.438～0.595)。(4)分别作血清sST2+NT-proBNP、cystatin C +NT-proBNP及NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡和全因死亡/心源性再住院的ROC曲线。血清 sST2+NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡的曲线下面积为0.708(95%CI：0.567～0.850)；血清cystatin C+NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡的曲线下面积为0.791(95%CI：0.683～0.900)。血清sST2+NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡/心源性再住院的曲线下面积为0.616(95%CI：0.534～0.698)；血清cystatin C+NT-proBNP预测HF-PEF患者发生全因死亡/心源性再住院的曲线下面积为0.611(95%CI：0.530～0.691)。(5)sST2高水平组HF-PEF患者随访期间全因死亡和心源性再住院的发生率均高于sST2低水平组(P<0.05)。cystatin C升高组HF-PEF患者随访期间全因死亡和心源性再住院的发生率均高于cystatin C正常组(P<0.05)。(6)采用Kaplan-Meier法对sST2低水平组和sST2高水平组两组患者随访期间的全因死亡率和全因死亡/心源性再住院率进行曲线分析。结果显示,sST2高水平组患者随访期间全因死亡率明显大于sST2低水平组,Log-rank的检验统计值为5.49,P<0.05。sST2高水平组患者随访期间全因死亡/心源性再住院率明显大于sST2低水平组,Log-rank的检验统计值为6.76,P<0.01。(7)采用Kaplan-Meier法对cystatin C正常组和cystatin C升高组两组患者随访期间的全因死亡率和全因死亡/心源性再住院率进行曲线分析。结果显示,cystatin C升高组患者随访期间全因死亡率明显大于cystatin C正常组,Log-rank的检验统计值为14.54,P<0.01。cystatin C升高组患者随访期间全因死亡/心源性再住院率明显大于cystatin C正常组,Log-rank的检验统计值为8.30,P<0.01。结论：(1)血清sST2水平的高低对HF-PEF患者的不良预后有预测价值；检测血清中sST2水平对于评估HF-PEF患者的预后具有重要意义。(2)血清cystatinC水平对HF-PEF患者预后的判断具有重要的指导意义；临床上可通过检测患者血清cystatin C水平来评估HF-PEF患者的预后。(3)血清sST2和cystatin C是HF-PEF患者的很有潜在研究价值的生物标志物,对HF-PEF患者发生全因死亡及心源性再入院的风险有很强的预测指导意义；在评估HF-PEF患者预后方面的作用甚至已超过传统公认的标志物NT-proBNP。(4) sST2、cystatin C与NT-proBNP联合应用可以大大提高对HF-PEF患者的预后评估能力。血清sST2和cystatin C可作为NT-proBNP评估HF-PEF患者预后的有力补充。
高海宁[10]2016年在《六味地黄丸对H_2O_2诱导PC12细胞凋亡影响的研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究从磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路入手,采用细胞培养、生化检测试剂盒、RT-PCR和Western Blot等技术手段,探讨并观察经典名方六味地黄丸对H2O2损伤PC12细胞凋亡的保护作用,从分子生物学角度揭示六味地黄丸对神经细胞凋亡抑制的作用机制,为六味地黄丸治疗阿尔茨海默病提供实验依据及理论基础。材料与方法:按照体重将大鼠随机分为空白对照组和六味地黄丸组。其中六味地黄丸组采用生药质量浓度为0.75 kg/L六味地黄丸(浓缩丸)水溶液按照10m L/kg灌胃,每天上午、下午各灌胃一次,空白对照组同体积双蒸水灌胃,连续灌胃7天,第7天首次给药2小时后腹主动脉取血,静置2h,2000 r/min离心10 min后分离血清。经56℃,30min灭活,0.22μm滤膜过滤灭菌,-20℃保存备用。取对数生长期的PC12细胞按照1×105/ml密度,接种于96孔板中培养,200μl体系,待培养24小时细胞贴壁生长后,更换无胎牛血清的培养基,继续培养24h后将终浓度分别为100、150、200、250、300、350μmol/L的H2O2加入到细胞培养基中,作用时间分别为12、24、36、48小时,确定H2O2诱导PC12细胞损伤的最佳作用时间及作用剂量。选取空白对照组大鼠的血清以及六味地黄丸灌胃组大鼠血清分别制备5%、10%、20%血清浓度的细胞培养基。在96孔板内,按照上述浓度接种细胞,饥饿24h使细胞同步化后,加入含相应浓度大鼠血清的细胞培养基在细胞造模前进行保护,MTT检测细胞存活率,选取适宜的含药血清浓度及适宜的保护时间。同样方法选择阳性对照药Vit E的作用浓度备用。将PC12细胞分成四组,分别为(1)对照组、(2)模型组、(3)六味地黄丸含药血清组、(4)Vit E组。待各组细胞接种24h,更换无胎牛血清的DMEM培养基培养24h后,(1)、(2)组加入含有10%正常大鼠血清的DMEM培养基培养24h,(3)组加入含有六味地黄丸含药血清的DMEM培养基培养24h,(4)组加入含有10%正常大鼠血清和Vit E的DMEM培养基培养24h,之后(2)、(3)、(4)组均加入终浓度为200μmol/L的H2O2作用24h,显微镜下观察细胞形态,同时收集细胞或上清液,检测LDH、SOD、MDA等生化指标。明确六味地黄丸含药血清是否对过氧化氢损伤的PC12细胞具有保护作用。收集上述四组细胞进行细胞凋亡率和细胞凋亡相关基因(caspase-8、caspase-9、caspase-3、Bax、Bad、Bcl-2)m RNA和蛋白测定。明确六味地黄丸含药血清是否对PC12细胞的凋亡具有抑制作用。将PC12细胞分成五组,分别为(1)对照组、(2)模型组、(3)六味地黄丸含药血清组、(4)Vit E组、(5)PI3K抑制剂组。其中(1)、(2)、(3)、(4)组处理同前,(5)组在H2O2诱导PC12细胞凋亡前30分钟,加入PI3K抑制剂。收集细胞,提取各组细胞总蛋白,western blot法检测PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达。提取各组细胞内总RNA,使用RT-PCR法检测PI3K、Akt的m RNA表达,明确六味地黄丸对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用是通过PI3K/Akt信号转导通路介导的。结果:1六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用1.1六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞增殖率的影响经筛选确定200μmol/l的H2O2作用24h作为PC12细胞损伤的刺激条件。用不同浓度的六味地黄丸含药血清对细胞进行干预保护,与各模型组相比,5%浓度六味地黄丸含药血清保护24h、36h,细胞OD值及增殖率有增加趋势,但差异不显着(P>0.05);10%六味地黄丸含药血清保护24h,细胞OD值及增殖率显着性增高(P<0.01);20%浓度六味地黄丸含药血清保护12h、24h和36h后,细胞OD值及增殖率有增加趋势,但差异不显着(P>0.05)。最终选用10%浓度六味地黄丸含药血清保护24h作为最佳治疗条件。1.2六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞一般形态的影响在倒置显微镜下,空白对照组细胞为梭形,细胞的胞体大,胞体主干和分支延长并增粗,细胞间接触紧密,有伪足伸出,细胞数目多,增殖旺盛,折光度强,少见脱壁漂浮的细胞;模型组细胞突触变短或伪足消失,部分细胞皱缩、变圆、脱落、漂浮于培养基,细胞间隙增宽,细胞数量少,折光减弱,生长状态差。六味地黄丸组细胞重新伸出伪足,间隙减小,细胞贴壁数量增多,漂浮细胞减少,折光度增强,细胞生长状态好转。1.3六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞培养基中LDH的影响正常对照组细胞培养基中LDH含量较低;与之相比,H2O2损伤后细胞培养基中LDH含量显着性增加(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,LDH含量显着性下降(P<0.01)。1.4六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞MDA含量的影响正常对照组细胞内MDA含量较低;与之相比,H2O2损伤后细胞内MDA含量显着性增加(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,MDA含量显着性下降(P<0.01)。1.5六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞SOD活力的影响正常对照组细胞内SOD活力较高;与之相比,H2O2损伤后细胞SOD活力显着性下降(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,SOD活力显着性升高(P<0.01)。2六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞凋亡的影响2.1 Annexin V-EGFP/PI双染色法观察六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞凋亡的影响各组细胞Annexin V-PE/PI染色后,在倒置荧光显微镜下观察,正常对照组荧光较少弱,凋亡细胞数量少;模型组视野范围内,荧光强度较强,染色细胞很多,凋亡细胞数量很多;与模型组相比,六味地黄丸组和Vit E组染色细胞减少,凋亡细胞数量减少。与正常对照组相比,模型组凋亡率显着性升高(P<0.01)。而六味地黄丸含药血清组与模型组相比,凋亡率显着降低(P<0.01),下降到29.18%±3.71%。2.2六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞Bcl-2、Bad、Bax m RNA和蛋白表达的影响与正常对照组相比,模型组Bcl-2的m RNA和蛋白表达显着减少(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,Bcl-2的m RNA和蛋白表达显着增加(P<0.01);与正常对照组相比,模型组Bax、Bad m RNA和蛋白表达显着升高(P<0.05,P<0.01);而六味地黄丸组与模型组相比,Bax、Bad m RNA和蛋白表达显着下降(P<0.05);2.3六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8 m RNA和蛋白表达的影响与正常对照组相比,模型组Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3 m RNA和蛋白表达显着升高(P<0.01);而六味地黄丸组与模型组相比,Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3m RNA和蛋白表达显着下降(P<0.01,P<0.05,P<0.01);3六味地黄丸含药血清对H2O2损伤的PC12细胞PI3K/Akt信号通路的影响与正常对照组相比,模型组PI3K、Akt m RNA和PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达显着下降(P<0.01);六味地黄丸组与模型组相比,PI3K、Akt m RNA和PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达显着升高(P<0.01);与六味地黄丸组相比,PI3K抑制剂组的PI3K、Akt m RNA和PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达显着下降(P<0.01)。结论:1使用H2O2外源性氧化剂,成功模拟建立稳定的PC12细胞氧化损伤模型。2六味地黄丸含药血清能够促进H202损伤的PC12细胞增殖,其中10%浓度六味地黄丸含药血清保护24h对于H202损伤的PC12细胞增殖率提高最有效。3六味地黄丸含药血清对H202损伤的PC12细胞具有保护作用。其可以保护细胞膜结构完整,减少细胞形态的改变,降低细胞LDH漏出量及MDA含量,增加细胞SOD活性,增强细胞抗氧化能力,抑制细胞氧化损伤。4六味地黄丸含药血清可以降低H202损伤的PC12细胞的凋亡率,具有抑制细胞凋亡作用。5六味地黄丸含药血清能够显着性下调Bax、Bad m RNA和蛋白的表达,上调Bcl-2 m RNA和蛋白的表达,发挥其抑制细胞凋亡的保护作用。6六味地黄丸含药血清能够显着性下调Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9 m RNA和蛋白的表达,发挥其抑制细胞凋亡的保护作用。7六味地黄丸含药血清能显着促进PC12细胞PI3K m RNA、Akt m RNA及PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达。PI3K抑制剂LY294002可以显着阻断六味地黄丸含药血清对PC12细胞PI3K m RNA、Akt m RNA及PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达,提示六味地黄丸含药血清通过PI3K/Akt信号通路发挥其抑制H202损伤的PC12细胞凋亡作用,防治AD的发生发展。
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