李强 王斌生（通讯作者） 柴琛
（兰州大学第一医院 甘肃 兰州 730000）
【摘要】 目的：研究姜黄素诱导胃癌细胞凋亡中MicroRNA表达谱的变化和在致凋亡中的作用，为临床使用姜黄素治疗胃癌提供理论依据。方法：将BGC823和SGC7901两种胃癌细胞系分别培养于含10%胎牛血清、1000U/ml青链霉素的RIMP1640培养基，分别采用DMSO，10uM，50uM姜黄素进行感染处理48小时后采用流式细胞术对各组细胞凋亡情况进行检测，同时采用miRNA芯片技术检测miRNA的表达，筛选表达差异miRNA，进行层次聚类分析。结果随着姜黄素作用浓度的升高，BGC823和SGC7901两株胃癌细胞株的凋亡率逐渐上升，两种细胞株50uM姜黄素处理组凋亡率较10uM组升高约3倍左右，与对照组相比，姜黄素处理组凋亡率明显升高，P均小于0.01。MicroRNA芯片分析显示在初步筛选出的129条MicroRNA中，与10uM姜黄素处理组相比，50uM姜黄素处理组表达差异在2倍以上的MicroRNA共计6条，上调表达MicroRNA2条，分别为miR-150和miR-34a；下调表达MicroRNA共计4条，分别为miR-92b、miR-650、miR-9和miR-125b。结论：姜黄素诱导可使胃癌细胞系BGC823和SGC7901的MicroRNA表达谱发生变化，提示某些MicroRNA可能参与了姜黄素所致胃癌细胞凋亡。
【关键词】 姜黄素；胃癌；MicroRNA；表达谱
【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）17-0160-03
胃癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，我国胃癌的发病率高居所有癌症发病率之首，严重威胁着人们的健康和经济水平。目前对于胃癌的治疗仍以手术治疗为主，但仍有相当一部分胃癌患者不具有手术指症需要化疗，或手术患者术后长期的化疗对于患者的远期毒性损伤较大[1]。中国传统中药姜黄素(curcumin,Cur)是一种从姜黄、莪术等姜黄属植物的根茎中提取出来的脂溶性酚类色素，作为一种天然安全的添加剂和染色剂广泛应用于食品工业之中[2]。研究表明姜黄素是一种具有多种生物活性的中药单体，能够杀伤多种肿瘤细胞[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是细胞内高度保守的非编码RNA，参与了包括肿瘤在内的多个病理生理过程[4]。有研究表明姜黄素可能通过调控miRNA机制发挥抗癌作用[5]。因此本研究通过研究miRNA在姜黄素致胃癌细胞凋亡中的作用和相关机制研究，为临床中药治疗胃癌提供基础理论依据。
1.材料与方法
1.1 细胞株及试剂
胃癌细胞系采用BGC823和SGC7901两株。姜黄素购自陕西听泰生物科技发展有限公司，分子式：C21H20O6，分子量：368.37，纯度99%，用DMSO配成1mol/L的原液，-20℃冻存备用。
1.2 细胞培养
将BGC823和SGC7901细胞分别培养于含10%胎牛血清、1000U/ml青链霉素的RIMP1640培养基，放置于37℃，5% CO2的恒温细胞培养箱内，每2～3d更换培养液待细胞融合大于80%后使用胰蛋白酶消化细胞，种板培养或传代。待细胞稳定后分别将BGC823和SGC7901细胞以105/ml密度接种于96孔板中，加入200μＬRIMP1640完全培养液，加入不同浓度姜黄素（10μM、50μM）处理。
1.4 细胞凋亡检测
姜黄素作用48h后收取各组细胞，PBS洗2次，离心机800r/min，离心5min，弃上清。加入195μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10分钟。800r/min离心5min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入10μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光孵育。流式细胞仪检测。
1.5 MicroRNA芯片分析
两种细胞系对照组，10uM和50uM处理组各收集1×108细胞，分别加入1mLTrizol抽提RNA，经纯度检测后送康成生物工程有限公司进行MicroRNA芯片分析。原始数据获得后首先去除背景值后进行归一化分析。筛选与凋亡相关MicroRNA的表达谱。
1.6 统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，凋亡相关MicroRNA分析以与空白对照组相比，10uM姜黄素处理组表达差异在2倍以上；与10uM姜黄素处理组相比，50uM姜黄素处理组表达差异在2倍以上的MicroRNA，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 姜黄素对胃癌细胞凋亡的影响
采用流式细胞术对不同浓度姜黄素作用48h后的BGC823和SGC7901细胞凋亡情况进行检测发现：随着姜黄素作用浓度的升高，BGC823和SGC7901两株胃癌细胞株的凋亡率逐渐上升，两种细胞株50uM姜黄素处理组凋亡率较10uM组升高约3倍左右，与对照组相比，姜黄素处理组凋亡率明显升高，P均小于0.01。说明姜黄素对BGC823和SGC7901细胞株具有明显的诱导凋亡作用，且在一定时间内与作用剂量呈正相关性，即随着药物剂量的增加，其诱导凋亡作用明显增强，如图1所示。
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图：不同浓度姜黄素对胃癌细胞BGC823和SGC7901凋亡的影响
2.2 MicroRNA芯片结果分析：
对于两种细胞系来说，与DMSO处理组比较，姜黄素处理组表达差异均在2倍及以上，且差异具有统计学意义（P<0.05）的MicroRNA共计129条，其中上调表达miRNA86条，下调表达MicroRNA43条。在初步筛选出的129条MicroRNA中，与10uM姜黄素处理组相比，50uM姜黄素处理组表达差异在2倍以上的MicroRNA共计6条，其中上调表达MicroRNA2条，分别为miR-150和miR-34a；下调表达MicroRNA共计4条，分别为miR-92b、miR-650、miR-9和miR-125b。如下表所示。
表 姜黄素诱导凋亡相关AA MicroRNA列表分析
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3.讨论
在我国各类肿瘤的发病率和患病率中，胃癌均居首位。而在我国西北部地区，由于饮食习惯及不良生活习惯导致胃癌的发病率居各类癌症之首，且较国内其他各省市相对较高，由胃癌所致的高病死率也对公共健康产生巨大的挑战。通过多年来对祖国传统医药的开发，人们发现从姜黄、莪术等姜黄属植物的根茎中提取出来的姜黄素可有效发挥抗肿瘤的作用，且已在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌等的临床治疗过程中得到证实[6-8]。有研究表明姜黄素可通过抑制信号转导和相关酶的活性，阻遏细胞周期，影响凋亡相关基因表达等多种分子水平机制发挥其抗肿瘤作用。但胃癌的发生过程复杂，除涉及一系列信号通路之外，表观遗传学的变化也越来越受到重视。MicroRNA是一类高度保守的非编码小分子调节RNA，其在癌症发生发展的表观遗传机制已得到广泛研究。在本研究中，我们通过MicroRNA芯片技术发现姜黄素作用之后可使MicroRNAs表达谱发生变化，其中与DMSO处理组及低剂量姜黄素处理组表达差异在两倍以上的上调MicroRNA有2条，下调有4条，这一变化说明在姜黄素诱导的细胞凋亡过程中可能与MicroRNAs的表达改变有关。
其中上调表达MicroRNA2条，分别为miR-150和miR-34a。 miRNA-34 则受著名的p53 直接调控，在多项研究中均发现可抑制肿瘤。本研究发现在姜黄素处理的胃癌细胞凋亡中，miR-150和miR-34a表达上调，在对肝癌细胞的研究中发现上调的miR-150可降低靶基因c-Myb的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡[9]。而邓晓晶等人的研究则发现miR-34a可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞周期停滞及细胞凋亡[10]。此外下调的有miR-92b、miR-650、miR-9和miR-125b。其中miR-92在可推动胃癌细胞通过细胞周期限制点，加速细胞生长，抑制miR-92可使Bcl-2和P53表达下调，引起细胞凋亡[11]。胃癌细胞中miR650高表达可通过抑制靶蛋白RGS7的表达来抑制细胞凋亡[12]。miR-9参与调控生物体的生长发育及细胞的自我更新和多向分化等多种生理活动，其表达紊乱与多种肿瘤密切相关[13]。研究发现miR-9可能通过抑制Bcl-2蛋白表达诱导胃癌细胞凋亡[14]。miR-125b与胃癌细胞凋亡的研究并不多见，有研究表明miR-125b高表达可促进细胞增殖[15]。以上说明姜黄素可导致胃癌细胞发生凋亡，MicroRNAs表达谱的变化也提示姜黄素引起细胞凋亡可能与细胞周期途径有关，也可能与某些关键蛋白的表达发生变化有关，具体机制仍有待于进一步研究。
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论文作者:李强,王斌生（通讯作者）,柴琛
论文发表刊物:《医药前沿》2016年6月第17期
论文发表时间:2016/6/24
标签：姜黄论文; 胃癌论文; 细胞论文; 凋亡论文; 作用论文; 诱导论文; 细胞株论文; 《医药前沿》2016年6月第17期论文;