1．杭州市肿瘤医院；2。浙江省人民医院 杭州医学院附属人民医院
【摘 要】目的：探讨二甲双胍对鼻咽癌细胞的抑制增殖、放疗增敏和化疗增敏作用。材料与方法：采用MTS方法检测二甲双胍抑制鼻咽癌细胞HNE1增殖的作用。采用克隆形成实验，将HNE1细胞分为二甲双胍治疗组和对照组，评估二甲双胍的放疗增敏作用；将HNE1细胞分为二甲双胍治疗组和对照组，给予顺铂化疗，评估二甲双胍的化疗增敏作用。结果：二甲双胍抑制HNE1细胞增殖，药物浓度增加，抑制作用增强。3mM浓度的二甲双胍显著提高HNE1细胞放疗敏感性。1mM、3mM和9mM浓度的二甲双胍均不显著提高顺铂的化疗敏感性。结论：二甲双胍抑制HNE1细胞增殖，提高放疗增敏性，不提高顺铂化疗敏感性。
一、前言
我国是鼻咽癌的高发地区，全球80%的鼻咽癌发生于我国和东南亚地区[1]。鼻咽癌的发病高峰年龄为40-60岁，死亡率高，社会危害大。放射治疗是鼻咽癌的根治性治疗手段，同步放化疗的广泛应用提高了局部晚期患者的治愈率[2]，但局部晚期患者的局部复发率和远处转移率依然较高，经放化疗综合治疗后5年生存率仅50-70%[3]。探索进一步提高鼻咽癌放疗敏感性和化疗敏感性的方法具有重要意义。
二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线用药，荟萃分析显示，二甲双胍减少糖尿病患者恶性肿瘤的发病率和死亡率[4]。近年来的研究显示二甲双胍在肺癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中显示出抑制肿瘤生长作用，与放疗和化疗药物联合应用可以提高放疗和化疗敏感性[5，6]。已有一项体外研究报道了二甲双胍对于鼻咽癌细胞的抑制增殖作用[7]。二甲双胍能否提高鼻咽癌放疗和化疗敏感性值得进一步研究。本文选择HNE1鼻咽癌细胞，通过二甲双胍抑制增殖实验，发现二甲双胍能够抑制HNE1鼻咽癌细胞增殖；通过放疗增敏实验发现二甲双胍具有放疗增敏作用；通过联合顺铂的化疗增敏实验，发现二甲双胍与顺铂联合治疗对HNE1鼻咽癌细胞无化疗增敏作用。
二、材料与方法
1.材料与试剂。人鼻咽癌细胞HNE1购自上海慧颖生物科技有限公司。二甲双胍、MTS液和顺铂等试剂购自Sigma公司。RPMI-1640培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素等购自Gibco公司。
2.方法。
2.1 细胞培养。鼻咽癌细胞HNE1用含10%的胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素RPMI-1640培养基，在温度为37℃、含5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。
2.2 MTS法测定二甲双胍治疗鼻咽癌细胞的半数抑制浓度（IC50值）。
HNE1鼻咽癌细胞株培养到对数生长期，取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1～2×104细胞，每个浓度每个细胞株做6个复孔。同时做加药培养板和基底培养板。第二天加药培养板分别加0、1、2、5、10、20、30、50、80、100mM浓度二甲双胍，在37℃温度5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。基底培养板每孔加20μlMTS液，继续培养1小时显色，在490nm处测OD值获得基础值。加药培养3天后，每孔加20μl MTS液，继续培养1小时显色。在酶联检测仪上，在波长490nm处检测各孔的光吸收值（OD）。用药物对OD值绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算药物IC50值。
2.3 二甲双胍的放疗增敏作用。
取对数生长期HNE1细胞103/孔接种于6孔板，在含0、IC30（30%抑制浓度）、IC50浓度的二甲双胍的培养基培养24h，每个浓度设3个复孔。采用西门子直线加速器（Oncor impression plus）进行0，2，4，6，8Gy放射治疗后继续培养2周，计数克隆形成数，绘制生存曲线。
2.4 二甲双胍的化疗增敏作用。
取对数生长期HNE1细胞103/孔接种于6孔板，空白对照组中培养基分别含浓度为0.5、1、1.5、2 μg/mL顺铂，实验组培养基在含上述顺铂基础上分别加用浓度为IC30、IC50的二甲双胍，每种处理设3个复孔。继续培养1周，计数克隆形成数。
3. 统计学分析
采用SPSS17.0统计学软件分析，两组间差异采用t检验，p<0.05表示差异有统计学意义。
三、结果：
1．二甲双胍抑制HNE1鼻咽癌细胞增殖。二甲双胍治疗鼻咽癌细胞的IC50值为3mM。不同浓度的二甲双胍对HNE1有不同程度的抑制增殖作用，药物浓度越高，二甲双胍抑制增殖作用越明显。增殖曲线见图1。
图3 二甲双胍无显著化疗增敏作用（p>0.05）。
四、讨论
我国是鼻咽癌的高发地区，放化疗是鼻咽癌的主要治疗方法，探讨提高鼻咽癌放疗敏感性和化疗敏感性的方法具有重要意义。本研究显示二甲双胍抑制鼻咽癌细胞HNE1增殖，并具有放疗增敏作用，但联合顺铂化疗无化疗增敏作用。
二甲双胍是治疗2型糖尿病应用最广的一线用药。荟萃分析显示，二甲双胍可以减少糖尿病患者恶性肿瘤的发病率和死亡率[4]。大量基础研究显示二甲双胍在肺癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中显示出较为有效的抑制肿瘤生长作用[5]。Zhao等[7]的研究显示，二甲双胍抑制鼻咽癌细胞C666-1增殖和克隆形成，二甲双胍浓度越高，抑制作用越强。Li等[8]亦报道，二甲双胍抑制CNE-2，HONE-1和SUNE-1鼻咽癌细胞增殖，药物浓度越高，抑制作用越强。本文同样发现，二甲双胍抑制HNE1鼻咽癌细胞增殖，药物浓度越高，抑制作用越强。尽管采用的鼻咽癌细胞株不同，本文与上述文献报道高度一致。可见，二甲双胍可以抑制鼻咽癌增殖。
多项临床研究显示，二甲双胍可以改善恶性肿瘤的放疗疗效。Skinner等[9]报道，二甲双胍可以降低接受手术和术后放疗头颈部癌患者的局部复发率。在合并糖尿病并接受术前放化疗的食管癌患者中，服用二甲双胍的患者与未服用二甲双胍的患者相比，病理完全缓解率显著提高，局部区域复发率显著降低[10]。在接受术前放化疗的直肠癌患者中，服用二甲双胍的糖尿病患者的病理完全缓解率显著高于未服用二甲双胍的糖尿病患者，也显著高于非糖尿病患者；而且二甲双胍还改善了合并糖尿病的直肠癌患者的总生存时间[11]。多项基础研究显示，二甲双胍可以提高肺癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞的放疗敏感性[12-14]。Li等报道，二甲双胍可以提高CNE-2，HONE-1和SUNE-1等鼻咽癌细胞株的放疗敏感性。与文献报道类似，本文显示二甲双胍也可以提高HNE1鼻咽癌细胞株的放疗敏感性。可见，二甲双胍对于常见鼻咽癌细胞株均有放疗增敏作用。二甲双胍安全性好，开展探索二甲双胍联合放疗治疗鼻咽癌的临床研究具有潜在价值。
文献报道，二甲双胍还可以提高多种恶性肿瘤的化疗敏感性。Jiralerspong等[15]报道，二甲双胍可以提高伴糖尿病乳腺癌患者新辅助化疗的病理完全缓解率。Iliopoulos等[16]报道，二甲双胍与阿霉素联合治疗对于乳腺癌、前列腺癌和肺癌细胞均有化疗增敏作用。而且，二甲双胍与阿霉素、紫杉醇和卡铂化疗药物联合均有化疗增敏作用。迄今尚无二甲双胍提高鼻咽癌细胞化疗敏感性的临床研究和基础研究报道。然而，本研究发现二甲双胍不能提高顺铂对HNE1鼻咽癌细胞的化疗敏感性。但不能据此认为二甲双胍不能提高鼻咽癌细胞的化疗敏感性，因为二甲双胍是否可提高氟尿嘧啶、多烯紫杉醇等鼻咽癌常用的化疗药物的化疗敏感性尚未明确，二甲双胍是否可提高HNE1以外的鼻咽癌细胞株的化疗敏感性也未明确。所以，二甲双胍是否可以提高鼻咽癌化疗敏感性仍然值得进一步研究。
本研究存在明显的缺点。首先，只探讨了二甲双胍抑制增殖和放化疗增敏作用，对于具体的作用机制未进行进一步探讨。其次，所有试验仅限于HNE1鼻咽癌细胞株，未对其他鼻咽癌细胞株进行实验。
综上所述，二甲双胍抑制鼻咽癌细胞HNE1增殖，并提高鼻咽癌细胞HNE1的放疗敏感性。二甲双胍这一价格低廉、安全性好的老药，有望在鼻咽癌治疗中发挥新的作用。二甲双胍在鼻咽癌治疗中的价值和作用机理值得进一步研究。
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论文作者:梁晓东1,黄海琇1,杨佳2,张海菠2
论文发表刊物:《航空军医》2017年第7期
论文发表时间:2017/6/16
标签：鼻咽论文; 鼻咽癌论文; 癌细胞论文; 敏感性论文; 抑制论文; 作用论文; 浓度论文; 《航空军医》2017年第7期论文;