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摘要：目的：探讨SELENBP1在结直肠癌中的表达，并分析其与肿瘤分化之间的关系，了解结直肠癌疾病的特征。方法：收集2010年1月至2015年1月期间，我院普外科收治的81例结直肠癌患者的手术标本，标本主要包括结直肠癌组织、转移淋巴结、正常大肠粘膜组织、大肠良性息肉。在对结直肠癌及正常粘膜组织、在对蛋白组织学分析过程中，主要采用基质辅助激光解析法及二维差异凝胶电泳，在对良性息肉、转移淋巴组织时，可采用该蛋白的表达。在检测结直肠癌细胞株在丁酸钠诱导中分化后的蛋白表达时，可采用Western blot 法检测。结果：二维差异凝胶电泳分析及基质辅助激光解析飞行时间质谱的鉴定结果显示，在结直肠癌组织中，硒结合蛋白 1（SELENBP1）表达的丰度低于其他正常粘膜组织，约低于2.50倍，组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot 显示结直肠癌组织中的硒结合蛋白 1表达水平低于其他正常粘膜组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在高、中低分挂的结直肠癌组织中，硒结合蛋白 1表达，差异较大，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论：在结直肠癌组织中，硒结合蛋白 1（SELENBP1）表达较低，同时，硒结合蛋白 1（SELENBP1）表达与结直肠癌低分化程度存在着密切的联系，硒结合蛋白 1（SELENBP1）表达均明显增高。
关键词：SELENBP1；结直肠癌；表达；肿瘤分化；关系
结直肠癌属于常见的消化系统恶性肿瘤之一，通过对我国近年来结直肠癌的发病情况进行调查和了解，其发病率较高，且呈现逐年升高的趋势，并位居全国恶性肿瘤的第三位，随着我国老龄化趋势的加快，其发病率尤其升高，同时随着人们生活水平和生活方式的改变，结直肠癌发病率的上升趋势更加严重。为了对结直肠癌肿瘤的标志物进行全新的筛选，本组试验对新鲜的结直肠癌与正常结直肠粘膜组织进行对比，探讨SELENBP1在结直肠癌中的表达，并分析其与肿瘤分化之间的关系，现进行如下报告。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组试验标下选自我院2010年1月至2015年1月期间，普外科收治的术前均未接受放化疗治疗的81例结直肠癌患者，患者的年龄在45—78岁之前，平均年龄为（60.28±1.62）岁，其中男性患者43例，女性患者38例，患者均经过病理证实为腺癌。其中高分化患者15例，中分化患者46例，低分化患者20例。在TNM分期方面，I期5例患者，II期36例患者，III期患者37例，IV期3例患者。有75个配对的正常粘膜来自与肿瘤10 cm以上的正常组织，25个转移淋巴结取自上述22个III期患者。25例患者为良性息肉，均来自上述18例结直肠癌同时切除的标本。对以上组织进行福尔马林溶液固定，并进行石蜡包埋，连续切片，并将其中的1片进行苏木精—伊红染色，对其行病理诊断，将其余切片进行免疫组织化学染色。
1.2 方法
1.2.1 主要的仪器与试剂
二维差异凝胶电泳主要采用蛋白提纯、定量试剂盒、荧光染料、MALDI-TOF 质谱仪，硒结合蛋白 1主要来自Abcam 公司，二氟化树脂、三步法免疫组化试剂盒。
1.2.2实验方法
在对蛋白质组学分析过程中，针对配对正常的粘膜，其可参与不同的荧光染料标记，与此同时，需要对其采用二维电泳进行扫描分析，选择不同的蛋白点进行挖点，并采用MALDI-TOF 质谱分析及相应数据库进行检索鉴定蛋白。
Western blot 检测：针对上述配对的结肠粘膜、体外培养的结直肠癌细胞超声裂解、腺癌组织，将其蛋白提取，选取80 ug蛋白于十二烷基硫酸钠，对其进行凝胶电泳，并转于 PVDF 膜上，将5 %的脱脂牛奶过夜封闭放置，采用Western blot 检测试剂对PVDF 膜进行检测。
免疫组化检测：石蜡切片主要有梯度乙醇水化、二甲苯脱蜡，清理源性过氧化酶，并对其进行高温高压修复，将其置于非免疫血清室温内，封闭放置约1 个小时。滴加生物素，并置于室温半个小时，在此基础上，滴加链霉菌抗生物素蛋白，同样置于室温半个小时，进行苏木素染色。在光学显微镜的观察下，对信号强弱进行了解，根据信号强弱的差异，将其分为（—）阴性，（+）弱阳性，（++）中度阳性，（+++）强阳性，将其评分为0—3分。
分化诱导和细胞培养：将上述细胞装于5 % 胎牛血清的细胞培养液中，进行孵育，每天需要换液，在72 小时后将细胞收取，采用Western blot 对硒结合蛋白 1（SELENBP1）进行检测。
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1.3 统计学处理
本次研究中，选择统计学软件SPSS15.0进行统计数据分析，其中计数资料以n/%形式表示，采用卡方（X2）检验，计量资料以（±s)形式表式，采用（t）检验，如P＜0.05，则表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 二维差异凝胶电泳分析
在结直肠癌组织中，存在25个以上的蛋白点，结果显示其平均丰度与正常粘膜相比，比较差异明显，具有统计学意义（P＜0.05）。基质辅助激光解析飞行时间质谱分析显示，其评分高于65分。二维差异凝胶电泳显示结直肠癌中1个蛋白点丰度低于正常粘膜，差异明显，具有统计学意义（P＜0.05）。硒结合蛋白 1（SELENBP1）已经引起的业界的广泛关注，在结直肠癌组织和体外培养细胞中的表达，免疫组化法与 Western blot 做进一步的分析和验证。
2.2 Western blot对硒结合蛋白 1表达的验证
结果显示正常黏膜硒结合蛋白 1灰度比为1.43±0.34，结直肠癌组织为0.75±0.03，两组比较差异明显，具有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 硒结合蛋白 1的免疫组化评分
在胞浆和胞核内，免疫组化信号均有着色，在结直肠癌中，硒结合蛋白 1表达评分为1.27±0.74，在正常粘膜组织中，硒结合蛋白 1表达评分为2.13±0.75，组间差异明显，具有统计学意义（P＜0.05）。
2.4 在高、中低分化的结直肠癌中硒结合蛋白 1的表达
在高分化的结直肠癌中，硒结合蛋白 1的表达为1.82±0.55，在中分化的结直肠癌中硒结合蛋白 1的表达为1.34±0.32，在低分化的结直肠癌中硒结合蛋白 1的表达为0.87±0.41，组间差异明显，具有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论
通过对近年来流行病学资料进行调查，全世界的结直肠癌新发病例数占有全部恶性肿瘤新发病例数的10 %左右，在全球范围内，每年有100多万的结直肠癌新发病例，患者的生命健康和生活质量受到严重的威胁[1]。在结直肠癌的临床治疗过程中，以手术治疗为主，以放疗、化疗为辅。大量研究显示肿瘤细胞对化疗药物具有一定的耐药性，这一问题已经成为化疗失败的主要原因之一，进而导致患者治疗无效而死亡，当前标准化疗后肿瘤细胞的耐药性成为临床研究的主要课题之一[2-3]。
尽管结直肠癌患者得到及时的诊断，同时对患者进行有效的治疗，但很多结直肠癌患者死于疾病的发展及转移阶段。对其原因进行全面的研究，显示不能忽视肿瘤的标志物，通过对肿瘤标志物的开发，开发个体化化疗的靶点，其有利于对结直肠癌患者进行个性化的诊断。近年来蛋白质组学新肿瘤标志物筛选进行广泛的研究，尤其是二维差异凝胶电泳，将其引入内标，使胶间差异及工作量显著降低，从而提高了检测差异蛋白的准确率、灵敏度[4-5]。
本组试验显示在胞浆和胞核内，通过免疫组化显示，硒结合蛋白 1（SELENBP1）均有表达，在有淋巴结转移和无淋巴结转移的结直肠癌患者中，硒结合蛋白 1的表达无显著性差异，在多种癌组织中，SELENBP1的表达降低，硒结合蛋白 1（SELENBP1）可能参与了结直肠癌的发生，并可与结直肠癌低分化程度存在着一定的联系，但其与淋巴结转移、发展无关[6]。
参考文献：
[1]沙慧芳，孙强玲，杨晓华.应用差异凝胶电泳及质谱技术筛选肺癌患者血浆差异蛋白[J].上海交通大学学报（医学版），2010，25（04)：399-403.
[2] 张雪梅，沈影，鲜于志群.肺癌骨转移血清蛋白质组学研究[J].中华肿瘤防治杂志，2010，16（09)：673-676.
[3]王宁，陈洋，姜奕.运用2D-DIGE技术的结直肠癌差异蛋白质组学研究[J].中国普通外科杂志，2012，27（10)：1212-1216.
[4]王宁，杨兴华，陈洋等.SELENBP1在结直肠癌中的表达及其与肿瘤分化的关系[J].中国普通外科杂志，2013，22（10)：1291-1296.
[5]王宁，陈洋，姜奕.碳酸酐酶Ⅱ存结直肠癌中的表达及其意义[J].中国普通外科杂志，2011，23（04)：387-390.
[6]Wang N，Chen Y，Han Y.Proteomic analysis shows down-regulations of cytoplasmic carbonic anhydrases，CAⅠ and CAⅡ，are early events of colorectal carcinogenesis but are not correlated with lymph node metastasis[J].Tumori，2012，11（06)：783-791.
论文作者:刘志孟
论文发表刊物:《健康世界》2015年19期供稿
论文发表时间:2016/2/15
标签：蛋白论文; 结直肠癌论文; 患者论文; 差异论文; 组织论文; 粘膜论文; 统计学论文; 《健康世界》2015年19期供稿论文;