（新疆阿克苏地区第二人民医院检验科 新疆 阿克苏 843000）
【摘要】目的：对82例结核杆菌痰培养阳性耐药菌株进行5种抗结核药物的耐药基因检测。方法：采用PCR－反向斑点杂交技术来检测耐药结核患者的痰标本临床分离株和耐药结核患者痰标本直接进行基因的突变检测。结果：对20例结核患者耐药菌株进行了5种药物的敏感实验，耐药高发种类以SM、RFP、INH为主，耐多药结核病（MDR-TB）的发生率也很高。结论：应用PCR-反向斑点杂交技术可快速检测结核分支杆菌对异烟肼(INH)、吡嗪酰胺(PZA)、链霉素(SM)、乙胺丁醇（EMB）、利福平（RFP）的耐药性，及时检测出结核突变菌株能为临床快速的治疗提供有效的治疗依据，是患者进一步治疗以及控制耐药结核病的重要手段。
【关键词】结核杆菌；耐药基因；反向斑点杂交
【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）34-0336-02
结核病是一种缓发的慢性传染病，由结核杆菌感染引起，可能侵入人体全身各器官，其中80%发生在肺部，其他部位也可继发感染，人与人之间呼吸道传播是此病传染的主要方式。近年来，结核发病率呈现增高趋势，主要是因为耐药和耐多药结核病出现分布广泛和传播速度加快的特点。异烟肼(INH)、吡嗪酰胺(PZA) 、链霉素(SM)、乙胺丁醇（EMB）、利福平（RFP）等是主要治疗结核病的抗结核药物，对其耐药性的研究在医学检验领域已经提升到重要地位，快速、准确地检测出结核杆菌对防治结核病具有举足轻重的意义。结核菌耐药性的出现从本质上讲是其基因发生了突变，传统测定结核杆菌耐药性需要时间较长，30～90天才能出来结果，不能在临床上及时辅助指导医师用药。本次所做研究采用PCR－反向斑点杂交技术来检测耐药结核患者的痰标本临床分离株和结核患者痰标本直接进行耐药基因的突变检测，灵敏度高，准确性强，耗时短，1～2d即能出来结果，达到初筛的目的。
1.资料与方法
1.1 临床资料
本次研究收集了82例痰培养阳性耐药菌株，是选自2014年6月—2015年12月在我院接受治疗的临床确诊为肺结核患者的痰标本。其中21例耐RFP，18例耐INH，13例耐SM，11例耐PZA，11例耐EMB，8例耐多药患者。
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1.2 临床分离株DNA的制备，采用罗氏培养基的实验菌落悬于1XTE液上面，再用细菌基因组DNA提取试剂盒（亚能生物技术有限公司）提取DNA，保存备用，温度要在-20℃。
1.3 PCR扩增方法选用25ul的反应体系，4×dNTPs终浓度为0.2mmol／L，Bio-标记引物终浓度为0.2umol／L，扩增程序为：94℃变性I min，58℃退火1min，72℃延伸I min，循环30次，最后72℃延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测出现267bp条带。
1.4 进行杂交检测，将点有探针的硝酸纤维素膜装入杂交袋中，加入杂交液放置水浴锅中进行预杂交：45℃×30min。将Bio-标记引物的PCR扩增阳性产物变性：95℃×l0min，取出迅速放入冰盒中，每ml杂交液一般加l0ul变性的扩增产物，放置水浴锅中进行杂交：45℃×30min。洗膜：洗液1、45℃×3min，洗液2、45℃×3min。SA-AP：用l：1000的稀释液(洗液I)与膜在37℃作用30min。洗膜：洗液I、45℃×3min，洗液II、45℃×3min。显色：每毫升洗液I加入NBT6.6ul、BICP3.3ul混匀，将配好的显色液加入杂交袋中，闭光37℃显色5min，然后观察其结果。
2.结果
对82例结核患者耐药菌株进行了5种药物的敏感实验，其耐药率结果依次为链霉素（SM）（89/162）54.9%，RFP（85/162）52.5%，INH（59/162）36.4%，吡嗪酰胺（PZA）（38/162）23.5%，乙胺丁醇（EMB）（18/162）11.1%。其中初始耐药率分别SM（24/162）14.8%，RFP（22/162）13.6%，INH（17/162）10.5%，PZA（12/162）7.4%，EMB（7/162）4.3%，继发耐药率分别为SM（65/162）40.1%，RFP（63/162）38.9%，INU（42/162）25.9，PZA（26/162）16.0%，EMB（14/162）8.6%，由此可见，耐药高发种类以SM、RFP、INH为主，耐多药结核病（MDR-TB）的发生率也很高。
3.讨论
结核病是一种严重威胁人类健康 的传染病，是我国重点防控的疾病之一，也是全世界重点关注的公共卫生和社会问题[1]。二十一世纪是结核病和耐药结核的高发期，各地的相关研究显示，不同地区在耐药率和耐多药率上都存有差异性，所以结核分支杆菌耐药性测定则成为防治结核病的关键。绝对浓度法和比例法是经典检测方法，但是结核分枝杆菌生长慢，耐药结核分枝杆菌的生长则更加迟缓，不能在临床上及时指导医师用药，而反向点杂交技术用于检测细菌耐药的基因突变，与传统与传统方法比较具有较高的灵敏度和特异度[2]。本次研究发现复治患者出现耐药率和耐多药率要比初治患者高出2～6倍，且对链霉素（SM），利福平（RFP），异烟肼（INH），吡嗪酰胺（PZA），乙胺丁醇（EMB）的耐药性依次降低[3]。故不同区域的一线抗结核药物要因地制宜，抗结核药物的治疗方案要根据个人情况，制定出适宜的个体化治疗方案。
结核病治疗因为结核病耐药菌株的出现为抗结核领域增加了难题，耐药机制是治疗的关键。结核病耐药菌株是因为基因突变引发，若能及时检测出突变菌株则能为临床快速的治疗提供有效的治疗依据，是患者进一步治疗以及控制耐药结核病的重要手段。
【参考文献】
[1]金福姝.结核分枝杆菌环介导等温扩增实时荧光与反向斑点杂交检测方法的研究[D].大连医科大学，2014.
[2]何进才，周丹，劳诗欣，李惠贞，黄涛，单万水.PCR-反向点杂交法在结核杆菌耐药突变基因检测中的应用[J].广东医学，2013，03:395-397.
[3]钟建平，金法祥，王华钧，等.PCR-反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌及其耐药基因的突变[J].国际流行病学传染病学杂志，2015，42(4).
论文作者:闫东
论文发表刊物:《医药前沿》2016年12月第34期
论文发表时间:2016/12/8
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