邓云[1]2004年在《知母有效成分对脑缺血的保护作用及其机制研究》文中指出随着人口老龄化的加剧,脑血管病,尤其是缺血性脑血管病越来越成为威胁人类健康的主要疾病之一,它不仅严重损害了患者的健康和生命质量,也给社会和家庭带来了沉重的负担。因此,明确脑缺血损伤的病理生理机制,研制和开发出新型、有效、副作用小的防治药物势在必行。 脑缺血的病理生理机制复杂,研究认为其与缺血再灌注后能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、自由基大量产生、细胞内钙超载、血小板激活、炎症损伤等诸多因素相关。现今血小板活化、炎症免疫损伤、核转录因子的调控下细胞因子的释放以及粘附分子的表达等机制越来越受到研究者的重视。 知母有效成分(化合物 9714)是军事医学科学院放射医学研究所提供的一种来源于中药知母的含有两个糖链的水溶性甾体皂苷化合物,结构类似糖皮质激素。本课题根据知母有效成分(化合物 9714)的结构特征,并结合脑缺血的研究现况,从整体、细胞、分子等不同水平,体内外研究相结合,利用生化测定、免疫组织化学、酶联免疫、分子生物学、细胞培养等多种方法系统分析探讨了化合物 9714 防治脑缺血损伤的药理作用及可能机制,为研究开发抗脑缺血新药提供一定的理论和实验依据。研究共分为以下五个部分:1 化合物 9714 对实验动物脑功能衰退的改善作用 学习记忆能力下降是脑缺血致脑功能障碍中的一种典型表现。本实验采用双侧颈总动脉结扎这一经典脑缺血模型,用 Morris 水迷宫测定各组动物空间学习记忆能力的差异,用 HE 染色及 SABC 免疫组织化学染色分析化合物 9714 对脑缺血模型大鼠病理形态学及神经生长因子、粘附分子表达的影响;同时鉴于胆碱系统的功能紊乱、胆碱受体密度降低与学习记忆、认知障碍、脑功能衰退之间的重要关系,实验中采用 M 受体阻断剂东莨菪碱 ip 0.5mg/kg 致获得性记忆障碍小鼠模型,观察化合物 9714 对模型小鼠学习记忆能力的影响,及对其海马中胆碱能受体的影响。结果表明,化合物 9714 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg 造模后连续给药 40 天,可以明显改善脑缺血大鼠的学习记忆障碍;改善神经细胞的变性坏死;增强脑皮质中脑源性神经生长因子(BDNF)的表达,降低细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达;化合物 9714 15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg 连续预防给药 30天,能明显改善获得性记忆障碍模型小鼠的学习记忆能力,并明显上调其海马中胆碱能M1 受体,同时具有明显上调 N 受体亚型 α7(Nα7)的作用趋势,与空白组相比有显着性差异,对 N受体亚型 α4无明显作用。2 化合物 9714 对局灶性脑缺血大鼠的保护作用 常用的脑缺血模型包括全脑缺血模型和局灶性脑缺血模型两大类。本实验采用 FeCl3化学敷贴法致大脑中动脉血栓形成(MCAT)模型及栓线法致大脑中动脉(MCA)缺血再灌注模型,观察化合物 9714 对脑缺血大鼠神经症状、脑梗塞范围、脑水含量、脑血流
邓云, 马百平, 徐秋萍[2]2007年在《知母有效成分对血管性痴呆的保护作用及其机制研究》文中提出目的研究观察知母有效成分(化合物9714)对拟血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆的保护作用,以及在抗炎免疫方面的药理作用,从而探讨该药抗局灶性脑缺血、防治血管性痴呆的作用机制。方法采用双侧颈总动脉永久性结扎拟 VD 模型大鼠,连续给药40d,以 Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆能力；以免疫组化法检测大鼠脑皮质脑源性神经生长因子(BDNF)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1) 的表达；同时以继代培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型,观察该药对 TNF-α诱导的内皮细胞与中性粒细胞及单个核细胞粘附作用的影响。结果化合物9714 10,20,40 mg·kg~(-1)组能明显缩短定位航行试验中第2,3天的逃避潜伏期,提高空间搜索试验中原平台象限游泳距离占总距离的百分比(P＜ 0．05或 P＜0．01)；能明显增加模型动物脑皮质 BDNF 的表达,降低脑皮质微血管 ICAM-1的表达(P＜ 0．05或 P＜0．01)；在体外培养 HUVEC 模型中,该药能明显抑制由 TNF-α诱导的内皮细胞与中性粒细胞及单个核细胞的粘附作用(P＜0．05或 P＜0．01)。结论知母有效成分(化合物9714)具有明显的保护 VD 大鼠学习记忆能力,保护脑缺血后的神经元损伤及炎性损伤,抑制炎症因子诱导下内皮细胞与白细胞粘附的作用。从而推测抗炎免疫、保护神经元损伤可能是该药对抗脑缺血、防治血管性痴呆的重要作用机制。
胡鹏翼[3]2016年在《以体外细胞模型研究川芎活性成分调控天麻素等苷类成分透过血脑屏障的作用及机制》文中研究说明目的：1.中药苷类成分具有广泛的药理活性,一些苷类成分对CNS疾病的治疗有重要作用,但因透膜性能差,生物利用度低,难以透过BBB等问题限制其临床应用。本文选择天麻素(GAS)、芍药苷(PAE)和松果菊苷(ECH)为模型药,通过研究模型药在体外BBB细胞模型上双侧表观渗透系数、蛋白抑制剂以及紧密连接调节剂对模型药双侧表观渗透系数的影响,从而阐明模型药的跨膜转运机制,找出模型药难以透过BBB的原因,为下一步采取有效措施解决苷类成分难透BBB的问题提供理论依据。2.经过文献调研,发现中药川芎可提高一些苷类成分在脑组织的浓度,且川芎常与含有苷类成分的中药配伍治疗脑部疾病,因此以川芎活性成分为研究对象,通过川芎活性成分对模型药在体外BBB细胞模型上跨膜转运性能的影响,阐明川芎促透作用的物质基础,从配伍的角度解决苷类成分难透BBB的问题,为将苷类成分更加有效的用于治疗CNS疾病提供新的解决途径。3.研究川芎中的活性成分对BBB上的外排蛋白、紧密连接蛋白表达的影响,从分子机理水平阐明川芎活性成分促进苷类成分透过BBB的作用机制,为开发潜在的透BBB促进剂,为解决药物难以透过BBB的瓶颈问题奠定基础。方法：1.将大鼠单次给药及连续灌胃给川芎提取物7天后,荧光分光光度计法测定川芎提取物作用下大鼠脑中的EB含量,研究川芎对BBB通透性的影响,从而确定川芎是否具有作为“佐使药”协助其他药物透过BBB的作用。2.建立GAS.PAE及ECH的LC-MS/MS含量测定方法；采用MDCK、MDCK-MDR1建立体外BBB细胞模型,并通过电镜显微观察、荧光素钠渗漏实验等对细胞模型进行验证；测定不同浓度GAS。PAE及ECH在MDCK.MDCK-MDR1细胞模型上双侧表观渗透系数Papp(A→B)及Papp(B→A)；并分别以外排蛋白P-gp抑制剂(维拉帕米)、MRP1抑制剂(丙磺舒)以及细胞间紧密连接调节剂(EDTA)为工具,通过它们对GAS、PAE及ECH双侧表观渗透系数Papp(A→B)及Papp(B→A)的影响,阐明GAS、PAE及ECH在BBB上跨膜转运机制。3.采用MDCK-MDR1建立体外BBB细胞模型,分别给予不同浓度的FA、TMP、LIG、 SENA、SENI与同一浓度的GAS、PAE及ECH,研究GAS、PAE及ECH的表观渗透系数Papp(A→B),并与模型药单独给药相比,配伍对模型药Papp(A→B)的影响,找到川芎中具有促透作用的活性成分以及促透的剂量。4.采用分子对接法对叁个苷类成分,川芎中的5个活性成分,以及P-gp抑制剂维拉帕米、MRP1抑制剂丙磺舒、打开紧密连接的EDTA,分别与P-gp、MRP1、claudin、ZO-1蛋白进行分子对接,分析这些成分与蛋白的结合方式,LibDock Score评价结合能力的强弱,从是否竞争性结合蛋白的角度阐明川芎的促透机制；以P-gp底物罗丹明123为荧光探针,研究不同浓度的川芎活性成分TMP、FA、LIG、SENA和SENI以及P-gp抑制剂维拉帕米对其细胞蓄积的影响,从川芎活性成分调节P-gp蛋白的外排功能角度阐明川芎的促透机制；蛋白质印记法研究不同浓度的川芎活性成分对P-gp、MRP1. claudin-5、ZO-1蛋白表达的影响,从蛋白分子水平上阐明川芎的促透机制；RT-PCR研究川芎活性成分对MDR1 mRNA表达的影响,从分子水平上阐明川芎的促透机制。采用荧光法测定给药前后分子探针在水平方向和垂直方向的荧光强度,计算细胞膜的各向异性值,从川芎活性成分对细胞膜流动性的调节作用阐明川芎的促透机制。结果：1.川芎单次给药组与空白对照组相比,大鼠脑组织中的EB含量随着川芎给药剂量的增加而增加,但是无显着性差异(p>0.05),同时对EB的促透作用最多可增加到35%左右。川芎连续给药组均显着大于川芎单次给药组对EB的促透作用。川芎提取物连续给药组与空白对照组相比,大鼠脑组织中的EB含量随着给药剂量的增加而增加,其中,1.26,2.52, 3.78gkg-1给药剂量具有显着性差异(p<0.05),均能使EB含量增加80%左右。无论单次给药还是多次给药,当川芎的给药剂量大于1.26 g-kg-1时,对大鼠脑内的EB含量变化影响较小,因此表明川芎对BBB通透性的调节作用是有限的。另外,川芎提取物为水提取物,含有以阿魏酸为主的酚酸类成分,单次给药对BBB通透性调节能力较弱,但长期给药后能显着性能促进EB透过BBB,表明该类成分对BBB的调节能力较弱,且调节能力与作用时间有关。2.建立了MDCK、MDCK-MDR1体外BBB细胞模型,透射电镜下细胞呈“铺路石”状,规则,排列紧密,紧密连接清晰可见,细胞电阻大于500Ω·cm2,同时荧光素钠无渗漏,表明细胞模型建立成功。GAS、PAE以及ECH在MDCK, MDCK-MDR1上Papp(A→B)均小于1×10-6cm.s-1,属于难透膜的药物,叁者之中,ECH的透膜性能最差；另外这叁个成分的浓度与转运速率呈线性关系,说明它们在浓度100-800μg·mL-1范围内以被动扩散为主。GAS在MDCK、MDCK-MDR1上的ER差异较大,MDCK-MDR1上的ER值在1-1.5之间,P-gp抑制剂维拉帕米能显着性增加GAS跨膜转运,表明GAS是P-gp底物,它的跨膜转运受到了P-gp的外排作用。PAE在MDCK-MDR1上的ER>2.0,且P-gp抑制剂维拉帕米能显着性增加PAE跨膜转运,表明PAE是P-gp底物,另外MRP1抑制剂丙磺舒也能显着性增加PAE跨膜转运,表明PAE还受到了MRP1的外排作用。ECH在MDCK-MDR1上的ER>2.0,且P-gp抑制剂、MRP1抑制剂均能使ECH的ER值减小,表明ECH的转运受到P-gp和MRP1的外排作用。EDTA均能使GAS、PAE、ECH的表观渗透系数Papp (A→B)值极显着性增加(p<0.01),表明GAS、PAE、ECH也存在细胞旁路转运。3. LIG、SENA和SENI均可以显着性提高GAS、PAE和ECH的Papp (A→B)发挥促透作用,且与浓度呈正相关。LIG对GAS的促透作用最强,30μg·mL-1LIG(LIG:GAS=1:20,g/g)可显着性增加GAS的Papp(A→B)(p<0.01); SENA和SENI对PAE促透作用最强,20μg·mL-1SENA或20μg·gmL-1SENI (SENA:PAE= 1:20, SENI:PAE=1:20, g/g)均可显着性增加PAE的Papp(A→B); LIG和SENI对ECH促透作用最强,20μg·mL-1LIG或20μg·mL-1SENI (LIG:ECH= 1:20, SENI:ECH=1:20,g/g)可显着性增加ECH的Papp(A→B)p<0.05)；不同浓度的FA、TMP对GAS、PAE和ECH的Papp (A→B)均无显着性影响(p>0.05)。4.分子对接的结果表明GAS、PAE、ECH均可通过分子内氢键作用与P-gp结合,LibDock Socre值大于阳性药维拉帕米,因此为P-gp底物,其中ECH结构式中含有两个糖基,酚羟基较多,通过分子内氢键的作用与P-gp的结合能力最强。PAE、ECH也可以和MRP1形成分子内氢键,因此也是MRP1的底物。由于川芎中的FA、TMP、LIG、SENA和SENI的与蛋白的相互间作用力较小,LibDock Socre值均小于叁个苷类成分,故它们不是通过竞争性结合蛋白来发挥促透作用。LIG、SENA和SENI均可以显着性增加P-gp底物罗丹明123的细胞蓄积,能显着性降低P-gp蛋白的表达,表明这川芎中的这叁个成分通过抑制P-gp蛋白的表达来增加GAS、PAE和ECH细胞内蓄积；高浓度的SENI还可以同时抑制MRP1的表达来增加PAE、ECH的细胞内蓄积。LIG、SENA和SENI对MDR1 mRNA表达的抑制能力也较强,因此川芎中的这叁个活性成分通过抑制MDR1 mRNA的表达来增加GAS、PAE、ECH的细胞内蓄积。LIG、SENA和SENI还可抑制claudin-5以及ZO-1的表达,通过打开细胞间紧密连接从而促进GAS、PAE和ECH跨膜转运。FA和TMP虽为P-gp底物,也可抑制P-gp的表达,TMP还可以抑制MRP1的表达,但是与GAS、PAE和ECH两两配伍使用时,可能由于GAS、PAE和ECH对P-gp的抑制作用大于FA和TMP,故FA和TMP不能促进GAS、PAE和ECH的跨膜转运。FA和TMP虽然也可抑制claudin-5以及ZO-1的表达,但给药前后细胞电阻值无显着性变化,原因可能为western blot实验时药物与BBB细胞的作用时间为10 h,而跨膜转运实验时FA、TMP与BBB体外细胞作用时间为2.5h,尚未发挥打开细胞间紧密连接的作用,因此对GAS、PAE和ECH无显着性促透作用。川芎中的LIG、SENA和SENI与叁个苷类成分配伍后均能降低荧光探针的各向异性,表明LIG、SENA和SENI均能通过增加MDCK-MDR1细胞膜流动性来促进GAS、PAE和ECH细胞内蓄积,并呈一定的量效关系。结论：GAS、PAE和ECH均属于难透过BBB的药物,其中ECH的透膜性能最差。叁者均以被动扩散为主,也存在细胞旁路转运,GAS受到P-gp的外排作用,PAE和ECH则受到P-gp和MRP1的外排作用。川芎中的FA和TMP不能促进GAS、PAE和ECH透过BBB。川芎挥发油中的叁个活性成分LIG、SENA和SENI均可促进GAS、PAE和ECH透过BBB。LIG、SENA和SENI通过抑制紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达来促进GAS跨膜转运,同时还可抑制P-gp的表达减少GAS的外排从而增加GAS的细胞内蓄积；LIG、SENA和SENI通过抑制紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达,抑制P-gp的外排作用,SENI还协同抑制MRP1来促进PAE和ECH透过BBB增加细胞内蓄积。LIG、SENA和SENI均通过增加MDCK-MDR1细胞膜流动性来促进GAS、PAE和ECH细胞内蓄积。
李烨[4]2010年在《知母皂苷（TSA）对实验性脑缺血再灌注损伤动物模型的保护作用研究》文中研究表明缺血性脑血管病是严重威胁人类健康与生存的疾病之一,具有高发病率高患病率、高致残率、高复发率、高死亡率的特点。它不仅严重损害了患者的生命质量和健康,也给家庭和社会带来了沉重的负担。因此,明确脑缺血损伤的生理病理机制,开发和研制出新型、有效以及副作用小的防治药物势在必行。脑缺血的生理病理机制十分复杂,研究认为其与缺血再灌注损伤后能量代谢障碍、自由基大量产生、扩血管物质与缩血管物质含量的变化、血小板激活等诸多因素相关。甾体皂苷(TSA)是知母的有效成分之一,研究表明知母皂苷对急性脑缺血再灌注损伤具有确定的保护作用,其机制涉及调控缺血脑组织血管内皮功能,抗血栓形成和改善血液流变学等方面,而对于脑缺血损伤恢复早期脑血流量和能量代谢的研究作者尚未见报道,本课题采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,观察TSA对脑梗死后脑血流量和能量代谢的影响,为其脑缺血疾病的临床应用提供实验依据,同时也为脑缺血最佳治疗时间窗之外的中药干预时间的合理性进行探索。本实验主要分为以下四个部分：第一部分TSA对实验性脑缺血损伤模型动物脑血流量的影响1、TSA对实验性脑缺血再灌注损伤大鼠恢复期脑血流量的影响方法：采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,用超声多普勒血流测定仪测脑血流量。结果显示：假手术组脑血流量基本无变化,模型组动物脑血流量变化率降低较明显。TSA各剂量组及银杏叶片组均可抑制脑缺血再灌注损伤大鼠脑血流量变化率的下降,与模型组比较差异显着(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01),并呈现明显的剂量依赖关系。2、TSA对实验性急性脑缺血损伤小鼠脑血流量的影响方法：采用小鼠结扎双侧颈总动脉急性脑缺血损伤模型,用激光多普勒血流测定仪测缺血后5、10、15min脑血流量。结果显示：假手术组脑血流量基本无变化,模型组动物脑血流量描记图线明显下降。TSA各剂量组均能降低模型小鼠造模后5min,10min及15min时脑血流的下降幅度,与模型组比较差异显着。结论：TSA可抑制脑缺血损伤模型大鼠及小鼠脑血流量变化率的下降。第二部分TSA对实验性脑缺血再灌注损伤大鼠恢复期脑组织的保护作用方法：采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注损伤模型,测定脑组织NO含量、NOS活性、LA含量、LDH活性、MDA含量、SOD活性。结果显示：TSA60、30和15mg/kg可明显降低大鼠手术侧大脑NO含量(P<0.01)和TNOS活力(P<0.01)。TSA60和30mg／kg可明显降低大鼠手术侧大脑iNOS活力(P<0.01)；TSA60、30和15 mg/kg可明显降低大鼠手术侧大脑LA含量(P<0.01)；升高LDH活力(P<0.01,P<0.01,P<0.05)；TSA 60和30 mg/kg可明显降低大鼠手术侧大脑MDA含量(P<0.01),升高总SOD活力(P<0.01);TSA 30、15 mg/kg可升高大鼠手术侧大脑Cu-Zn SOD活力(P<0.05,P<0.01)。结论：TSA对脑缺血再灌注损伤后NO的含量有很明显的降低作用,对NOS活力也有明显的降低作用。提示TSA防治脑缺血再灌注损伤的作用机制可能是通过抑制iNOS的活力,减少NO的生成,从而减少神经的损伤,减轻脑缺血再灌注的损伤。TSA能升高脑缺血再灌注造成LDH的活力的降低,减少乳酸的生成,从而间接地减轻了酸中毒对神经元所造成的损伤。TSA可显着降低模型大鼠脑组织MDA的含量,提高SOD活力,显示该药对于脑缺血后氧自由基所引起的脑组织细胞脂质过氧化损伤具有一定保护作用。第叁部分TSA对实验性脑缺血再灌注损伤大鼠恢复期脑组织能量代谢相关指标的影响1、TSA对实验性脑缺血再灌注损伤大鼠恢复期脑组织能量代谢相关指标的影响方法：采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型,测定脑组织Na+-K+ATP酶活性、Ca2+-Mg2+ATP酶活性及ATP含量。结果显示：TSA60 mg/kg可明显增强大鼠手术侧大脑Na+-K+ATP、Ca2+-Mg2+ATP的活力(P<0.01)。结论：TSA能改善脑缺血再灌注损伤时产生的能量代谢障碍,增加ATP的含量,改善细胞内外的离子交换,减少细胞内的Ca2+,增加细胞内的Mg2+,从而使细胞的代谢过程改善为良性循环。第四部分TSA对实验性脑缺血再灌注损伤大鼠恢复期脑血管收缩功能相关活性物质的影响方法：采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注损伤模型,测定脑组织血管活性肠肽、内皮素、血管紧张素。结果显示：TSA 60、30和15 mg/kg可升高大鼠右侧脑组织匀浆中VIP含量(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。结论：TSA对实验性脑缺血再灌注损伤大鼠恢复期脑组织有扩血管的作用,可增加脑血流量,减少脑组织损伤。第五部分TSA对ADP、胶原所诱导的血小板聚集的影响方法：采用TSA体外给药测定其对家兔血小板聚集的抑制作用,以比浊法测定血小板聚集功能。结果显示：随着TSA浓度的升高,其抑制血小板聚集作用明显增强,血小板解聚现象也逐渐增强,当TSA浓度达到1.4mg/ml时,几乎完全抑制血小板聚集。结论：TSA可以抑制由ADP、胶原诱导的家兔血小板的聚集,并呈剂量效应。结论知母皂苷(TSA)作为药物治疗后,MCAO大鼠脑血流量变化率有较明显的升高；双侧颈总动脉结扎致急性脑缺血模型小鼠脑血流量的变化率显着增加；NO含量及NOS活性显着降低；LA含量降低；LDH活力升高；MDA含量降低；SOD活性升高；能量代谢相关酶的活性提高；扩血管物质VIP含量增加；体外实验结果表明：TSA能剂量依赖性的抑制家兔血小板的聚集。上述实验结果说明TSA增加脑血流量,减轻能量代谢障碍,抗氧化损伤,均与其缺血后脑组织损伤保护作用相关
戴骏宇[5]2017年在《知母皂苷对心肌缺血损伤的保护作用及其机制研究》文中研究说明目的:研究灌胃给药的知母皂苷Officinalisinin Ⅰ及知母皂苷bⅡ对心肌缺血的保护作用及知母皂苷Officinalisinin Ⅰ的作用机制。研究腹腔注射给药知知母皂苷Officinalisinin Ⅰ对心肌缺血的保护作用及作用机制。方法:(1)实验大鼠随机分为空白组、模型组、Officinalisinin Ⅰ与知母皂苷bⅡ高低剂量组和阳性组,共7组。用异丙肾上腺素制备急性心肌缺血模型。分别用知母皂苷 Officinalisinin Ⅰ(300、600mg/kg)、知母皂苷 bⅡ(300、600mg/kg)和地奥心血康(阳性对照,120mg/kg)灌胃,5d后,处死动物,取心肌组织做病理切片,观察心肌组织病理学变化;检测大鼠血清中LDH、CK、AST指标变化。(2)实验大鼠随机分为空白组、模型组、知母皂苷Officinalisinin Ⅰ高低剂量组和阳性组,共5组。用异丙肾上腺素制备急性心肌缺血模型。分别用知母皂苷Officinalisinin Ⅰ(300、600mg/kg)和地奥心血康(阳性对照,120mg/kg)灌胃,5d后,取心肌组织匀浆,检测各组心肌组织匀浆中的Gsh-px、SOD、ROS、MDA;Bcl-2、BAX、p53以及HO-1水平变化。(3)实验大鼠随机分为空白组、模型组、知母皂苷Officinalisinin Ⅰ高中低剂量组和阳性组,共6组。用异丙肾上腺素制备急性心肌缺血模型。分别用知母皂苷Officinalisinin Ⅰ(100、50、25mg/kg)和地奥心血康(阳性对照,100mg/kg)腹腔注射,5d后,取心肌组织做病理切片,观察心肌组织病理学变化;检测大鼠血清中LDH、CK、AST指标变化。取心肌组织匀浆,检测各组心肌组织匀浆中的Gsh-px、SOD、ROS、MDA;Bcl-2、BAX、p53以及HO-1水平变化,Tunel法检测细胞凋亡。结果:(1)灌胃给药的知母皂苷Officinalisinin Ⅰ与知母皂苷bⅡ均可以改善心肌缺血模型病理学变化。两者均可以不同程度降低心肌缺血模型血清中LDH、CK、AST的水平,知母皂苷Officinalisinin Ⅰ各组相比知母皂苷bⅡ各组能够更大程度降低心肌缺血模型血清中LDH、CK、AST的水平。(2)灌胃给药的知母皂苷OfficinalisininⅠ可以降低心肌缺血模型心肌组织中MDA、ROS水平,并能提高心肌组织中Gsh-px与SOD活力;可以降低心肌缺血模型心肌组织中Bax、p53的水平,并能提高心肌组织中Bcl-2的水平,提高Bcl-2/Bax的比值;但其对心肌缺血模型心肌组织中HO-1蛋白水平无显着影响(3)腹腔注射给药的知母皂苷OfficinalisininⅠ能够改善心肌缺血模型病理学变化并可以降低心肌缺血模型血清中LDH、CK、AST的水平。同时,还能够降低心肌缺血模型心肌组织中MDA、ROS水平,并能提高心肌组织中Gsh-px与SOD活力;可以抑制细胞凋亡,并降低心肌缺血模型心肌组织中Bax、p53的水平,提高心肌组织中Bcl-2的水平,提高Bcl-2/Bax的比值。腹腔注射给药知母皂苷OfficinalisininⅠ相比灌胃给药知母皂苷OfficinalisininⅠ对大鼠急性心肌缺血模型治疗的有效剂量显着降低。结论:(1)知母皂苷OfficinalisininⅠ与知母皂苷bⅡ两者均具有保护急性心肌缺血损伤的作用,且知母皂苷OfficinalisininⅠ对急性心肌缺血损伤的保护作用比知母皂苷bⅡ更显着。(2)灌胃给药知母皂苷OfficinalisininⅠ可以降低心肌缺血模型心肌组织中MDA、ROS水平,并提高心肌组织中Gsh-px与SOD活力,提示其通过抗自由基及过氧化,保护心肌组织;知母皂苷OfficinalisininⅠ可以提高Bcl-2/Bax的比值,降低p53水平,对HO-1蛋白无明显作用。说明其减少心肌细胞凋亡的作用机制与改善心肌细胞凋亡蛋白有关,而HO-1蛋白无关。(3)腹腔注射给药知母皂苷OfficinalisininⅠ,对急性心肌缺血损伤同样具有保护作用。其作用机制与抗自由基及过氧化、抑制细胞凋亡,改善心肌细胞凋亡蛋白表达有关。使用腹腔注射给药方法给药,相比使用灌胃给药方法给药,药物的有效剂量明显降低。推测是由于腹腔注射给药的方式比起灌胃给药的方式,吸收更快更完全,生物利用度更高。
原源[6]2005年在《知母防治缺血性脑中风的物质基础及品质评价》文中研究说明本课题应用大鼠局灶性脑缺血试验模型跟踪筛选,获得中药知母中防治脑中风有效部位并从中分离得到5个单体化合物,该有效组份群为知母总皂苷。优化了知母总皂苷的制备工艺。采用多种动物模型进行药效学验证,确证知母总皂苷为知母防治缺血性脑中风的活性物质基础。采用基因芯片技术初步探讨了其保护作用机制,表明知母皂苷B-Ⅱ有多个靶点的保护作用。以知母防治脑中风活性成分知母皂苷为指标,采用高效液相色谱-蒸发光散射法考察得出商品药材品质有差异,产地、采收期、贮存期对药材品质影响较大。建立了优良品系药材对照指纹图谱。初步应用指纹图谱相似度进行药材识别研究。对品种的鉴定可靠、正确。以指纹图谱评价药材优劣时应结合含量测定结果,可确保知母药材的品质。
王枫[7]2018年在《回医蜜煎菖蒲方对脑缺血再灌注大鼠神经功能及海马神经元突触重塑的影响》文中研究说明背景缺血性脑血管疾病(Ischemic cerebrovascular disease,ICVD)发病率高、死亡率高、致残率高,脑血管病意外造成的致残率在我国众多疾病中居于首位。脑缺血是脑血管病发病的主要诱因,缺血性脑血管病发病后难于恢复,往往造成患者神经功能的缺损和肢体活动的障碍,给患者和其家庭的生活带来严重的痛苦,给社会造成负担。目前对脑缺血的研究表明:脑缺血后脑缺血区的神经元细胞多数随脑缺血发生而发生结构破坏、功能失常、坏死丢失。脑缺血缺血区周围往往散在分布少部分未完全损伤的神经元细胞,神经元具有可塑性,脑损伤后大脑功能状态的恢复与神经元的可塑性息息相关。突触是神经细胞之间的信息交流的关键部位,也具有可塑性,完整的突触结构和功能是神经元细胞修复再生的生理学基础。突触素(Synaptophysin,SYN)、微管相关蛋白(Microtubule-associated protein,MAP)-2和突触后致密物质(Postsynaptic density,PSD)-95参与突触的形成发生及突触之间的信息传递能过程,在损伤神经元突触重塑的过程中也起到重要的作用,促进提高突触重塑性对于修复神经元结构及神经元功能的恢复,改善脑缺血后患者神经功能障碍具有重要的意义。蜜煎菖蒲方是《回回药方》中记载的治疗中风后半身不遂、记忆减退等肢体神经功能障碍的方剂,已证实蜜煎菖蒲方具有促进改善脑缺血后神经功能障碍恢复的作用,但对于其作用机制尚不明确。目的1.检测脑缺血再灌注后大鼠神经功能评分、脑组织病理形态变化,观察蜜煎菖蒲方对大脑神经元的保护及促进神经功能恢复作用。2.检测脑缺血再灌注后大鼠海马神经元突触重塑标志物SYN、MAP-2、PSD-95表达变化,研究蜜煎菖蒲方促进海马神经元突触重塑及神经功能恢复的作用。方法1.SD(Sprague Dawley)大鼠,雄性,3月龄左右,体重约(300±50)g,250只。随机分为空白对照组、假手术组、模型组、尼莫地平组、天智颗粒组、蜜煎菖蒲低剂量组、蜜煎菖蒲中剂量组、蜜煎菖蒲高剂量组,其中空白对照组10只大鼠,其余各组按3个取材时间分7、14、28d组,各组10只大鼠;2.大脑中动脉闭塞(Middle cerebral arteryocclusion,MCAO)模型大鼠通过线栓法制备,术后2小时拔出线栓进行缺血再灌注;3.非用药组采用蒸馏水灌胃,药物干预组分别用相应药物灌胃。根据生药材含量按等效剂量换算关系计算大鼠灌胃药量,灌胃体积为l0m1/kg,给药刻量按大鼠与人的体表面积等效剂量折算,尼莫地平、天智颗粒为20mg/kg/d,蜜煎菖蒲低剂量为4.3g/kg/d,中剂量为8.6g/kg/d,高剂量为17.2g/kg/d,大鼠造模前30min灌胃1次,造模后每日灌胃2次;4.采用改进Longa8分制评分标准在术后2h和48h对大鼠进行神经功能评分;采用Garcia18分制评分法在取材前2h对大鼠进行神经功能评分;采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色法观察脑组织神经元细胞病理形态;采用免疫组织化学法检测大鼠脑缺血再灌注损伤后SYN、MAP-2、PSD-95的表达变化。结果1.神经元细胞结构改变和神经功能评分变化:1.1脑组织病理形态改变:假手术组海马神经元细胞大小均匀一致,形态完整,胞体、细胞膜清晰,细胞核及核仁明显。模型组海马和皮质组织缺血区域间隙变宽,内皮细胞肿胀,病变中心细胞结构松散,海马神经元突起出现断裂,可见数量不等变性坏死的神经元,部分神经细胞核浓缩变小,呈深染,核仁消失,大部分细胞有退行性改变。给药组神经细胞结构有不同程度改善,蜜煎菖蒲方在14、28d两个时间点相比尼莫地平和天智颗粒组对脑缺血再灌注损伤后海马神经元细胞病理变化改善明显。1.2大鼠神经功能评分变化(2h、48h):术后2h和48h,模型组大鼠相比正常组、假手术组神经功能评分显着增高(P<0.01);与模型组比较,给药组大鼠术后48h神经功能评分明显降低(P<0.05);与术后2h比较,给药组术后48h神经功能评分明显降低(P<0.05)。1.3大鼠神经功能评分变化(7、14、28d):与正常组和假手术组比较,模型组大鼠术后7、14、28d的神经功能评分明显降低(P<0.01),尤其以7d组大鼠降低最为明显;给药组大鼠神经功能评分相比模型组增高(P<0.05);与尼莫地平组比较,天智颗粒、蜜煎菖蒲低、中剂量组神经功能评分降低(P<0.05);与天智颗粒组相比,蜜煎菖蒲高剂量组神经功能评分增高(P<0.05);与蜜煎菖蒲中剂量组相比,蜜煎菖蒲高剂量组神经功能评分明显增高(P<0.05);与7、14d组相比,随用药时间延长,给药组14、28d时神经功能评分明显增高(P<0.05,P<0.01)。2.大鼠海马神经元突触重塑标志物表达变化及蜜煎菖蒲方对其的影响2.1 SYN表达变化:与正常组和假手术组比较,模型组大鼠SYN阳性细胞数在各时间点明显降低(P<0.01),阳性细胞平均光密度(Optical density,OD)值7、14d时降低(P<0.01,P<0.05),28d时显着增高(P<0.01);与模型组比较,给药组(除蜜低组)SYN阳性细胞数增高(P<0.05),给药组SYN阳性OD值表达增高(P<0.01,P<0.05);与尼莫地平、天智颗粒组比较,蜜中、高组在14、28d时SYN阳性细胞数增高(P<0.05),阳性OD值明显增高(P<0.01,P<0.05);与蜜中组比较,蜜低组表达明显降低(P<0.01,P<0.05);与7、14d组相比,随用药时间延长,给药组14、28d时SYN表达明显增高(P<0.05,P<0.01)。2.2 MAP-2表达变化:与正常组和假手术组比较,模型组大鼠MAP-2阳性细胞数在各时间点明显降低(P<0.01),阳性OD值7d时明显降低(P<0.01);与模型组比较,给药组MAP-2阳性细胞数增高(P<0.01,P<0.05),尼莫地平、蜜中、高组阳性OD值表达显着增高(P<0.01,P<0.05);与天智颗粒、尼莫地平组比较,蜜中、高组MAP-2阳性细胞数明显增高(P<0.01,P<0.05),阳性OD值表达增高(P<0.05);与蜜中组比较,蜜低组表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与7、14d组相比,随用药时间延长,给药组14、28d时MAP-2表达明显增高(P<0.05,P<0.01)。2.3 PSD-95表达变化:与正常组和假手术组比较,模型组大鼠PSD-95阳性细胞数在各时间点明显降低(P<0.01),阳性OD值7d时降低(P<0.01),28d时增高(P<0.01);与模型组比较,尼莫地平、蜜中、高组PSD-95阳性细胞数在14、28d时明显增高(P<0.01),阳性OD值在各时间点表达增高(P<0.01,P<0.05),天智颗粒、蜜低组阳性细胞数表达增高(P<0.05);与尼莫地平组比较,天智颗粒、蜜低组在14、28d阳性细胞数及阳性OD值表达降低(P<0.01,P<0.05),蜜中、高组在14、28d是阳性细胞数表达明显增高(P<0.01);与天智颗粒组比较,蜜中、高组PSD-95阳性细胞数在14、28d增高(P<0.05),阳性OD值明显增高(P<0.05,P<0.01);与蜜中组比较,蜜低组阳性细胞数在14、28d时表达明显降低(P<0.01),阳性OD值在各时间点表达降低(P<0.01,P<0.05),蜜高组阳性细胞数在各时间点表达增高(P<0.05),阳性OD值在28d时表达增高(P<0.05);与7、14d组相比,随用药时间延长,给药组14、28d时PSD-95表达明显增高(P<0.01)。结论:1.蜜煎菖蒲方对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞有明显的保护作用,促进神经功能恢复,且其脑保护作用随着用药时间的延长呈增强趋势,以再灌注后第14天和第28天时作用较明显。2.大鼠脑缺血再灌注损伤后海马神经元突触重塑标志物表达减少,神经功能的恢复与SYN、MAP-2、PSD-95表达升高相关,蜜煎菖蒲方能够增加海马神经元SYN、MAP-2、PSD-95表达,其改善恢复大鼠神经功能的机制可能与促进海马神经元突触重塑有关。
蔡飞[8]2011年在《滋肾丸药代动力学及其配伍机制研究》文中指出滋肾丸是中医临床上用来治疗良性前列腺增生的经典方剂,由知母、黄柏和肉桂(10:10:1)叁味中药材组成。中药的体内过程和生物转化是中药现代化的重要内容,研究中药的药代动力学过程对药效物质基础的发现、揭示方剂配伍机制、创新药物研制和指导临床合理用药都有重要意义。方剂是中医临床用药的主要形式,而配伍是方剂的核心,因此方剂配伍机制和规律成为方剂研究的关键科学问题。阐明滋肾丸的药代动力学特征对解释其配伍机制具有重要的研究价值。本课题以准确、灵敏和高通量的HPLC-MS/MS技术为检测手段,以有效组分群双苯吡酮苷(新芒果苷和芒果苷)、知母皂苷(知母皂苷E1、知母皂苷B-II和知母皂苷B)和生物碱(巴马汀和小檗碱)为研究对象,对滋肾丸的药代动力学特征进行研究,从药代动力学的角度揭示本方剂的配伍机制。具体内容包括:一、滋肾丸主要活性成分体内测定方法学的建立建立灵敏、可靠的HPLC-MS/MS方法,同时测定滋肾丸中7种主要活性成分的血药浓度。本方法选择简便、快捷的蛋白沉淀法处理血浆样品,将人参皂苷Re与四氢小檗碱分别作为苷类与生物碱类成分的内标,并通过离子极性转换技术分别选择灵敏度最高的监测模式(负离子模式监测双苯吡酮苷与知母皂苷,正离子模式监测生物碱)测定理化性质差异较大的各类成分。通过条件优化,芒果苷的LLOQ达到5 ng/mL,新芒果苷、知母皂苷E1、知母皂苷B-II与知母皂苷B的LLOQ达到0.5 ng/mL,巴马汀与小檗碱的LLOQ达到0.05 ng/mL,在9 min内同时完成滋肾丸中7种成分的血药浓度测定。上述方法应用于大鼠口服滋肾丸提取物后的药代动力学研究。新芒果苷与芒果苷的药代动力学参数表现出显着的不同;知母皂苷E1、知母皂苷B-II与知母皂苷B有相似的体内药代动力学参数和药时曲线图,且存在明显的双峰现象;巴马汀和小檗碱的血药浓度非常低,且药时曲线图出现了多峰现象。上述HPLC-MS/MS方法的建立为后续药代动力学研究提供了良好的检测手段。二、滋肾丸在大鼠血浆中的比较药代动力学通过对建立的HPLC-MS/MS方法进行适当改变,分别测定不同剂量组口服给药后的大鼠血浆样品,并将单味药、知母黄柏药对及滋肾丸对大鼠灌胃后所得主要药代动力学参数进行比较。结果表明,在药对配伍后,新芒果苷和芒果苷的血药浓度(C_(max)、AUC_(0-t))显着减小,表明黄柏起到了降低这两种活性成分血药浓度的作用;而黄柏和肉桂对知母皂苷E1、知母皂苷B-II和知母皂苷B的体内血药浓度整体影响较小;知母对巴马汀和小檗碱的血药浓度(C_(max)、AUC_(0-t))起到了提升作用,证明了药对配伍的合理性,肉桂反而抑制了知母的这种作用,从一定程度上体现了肉桂在整个方剂中的反佐地位。叁、滋肾丸在大鼠前列腺组织中的比较药代动力学为避免强烈的基质效应干扰,建立脉冲梯度洗脱的HPLC-MS/MS方法对5种苷类成分的组织药物浓度进行测定,对生物碱类成分的测定则采用等度洗脱的方法,以缩短分析周期。通过对滋肾丸主要活性成分在大鼠体内的组织分布研究得出,7种成分在组织中的分布速度较快,在滋肾丸的效应靶器官——前列腺中存在相对较高的药物浓度,且生物碱类成分在大多数组织中的分布浓度远高于血药浓度,这些特点有利于滋肾丸在治疗前列腺增生症的过程中发挥药理作用。通过对正常与模型大鼠前列腺组织中7种成分的分布比较,发现除双苯吡酮苷类成分表现出一定的差异外,其它成分在组织中的分布行为十分接近,表明在后续滋肾丸的前列腺组织分布实验中以正常大鼠为实验对象即可。将单味药、药对及滋肾丸提取物对大鼠灌胃后,分别测定7种成分的血浆和前列腺组织浓度。结果表明,双苯吡酮苷类和皂苷类成分在前列腺组织中的分布浓度均低于对应时间点的血药浓度,而生物碱类成分在前列腺组织中的分布浓度远高于血药浓度,从而有利于生物碱类成分在靶器官——前列腺中达到足够的药物浓度而发挥药效作用。总体而言,在单味药组、药对组和滋肾丸组之间,双苯吡酮苷类和皂苷类成分在前列腺组织中的分布差异小,表明药对及滋肾丸的配伍对它们在靶器官的分布动力学影响甚微。与血浆药代动力学的变化规律相似,知母对黄柏中巴马汀和小檗碱的前列腺组织分布(C_(max)、AUC_(0-t))起到了显着的增强作用,从而有利于提高生物碱类成分在靶器官的药理作用,但肉桂对知母的这种作用稍显抑制。本结论从组织分布的角度揭示了知母黄柏药对配伍应用的科学性,阐述了滋肾丸叁味药材配伍应用的中医理论——知母黄柏二药相须而行,肉桂寒因热用,假之反佐。四、滋肾丸化学成分的体外转运与代谢研究本实验通过药材提取物在Caco-2细胞单层的转运研究,测定7种成分的表观渗透系数(P_(app)值),除知母皂苷B外均小于1×10~(-6) cm/s,表明它们口服给药时为吸收不良的药物。发现小檗碱和巴马汀是P糖蛋白(P-gp)的底物,在肠道转运过程中受到P-gp强烈的外排作用,因而推测这是其口服生物利用度低的重要因素。实验表明芒果苷在肠道菌群的作用下,代谢为其苷元降阿赛里奥,芒果苷及降阿赛里奥均对肠道P-gp有抑制作用,因而降低P-gp对其底物巴马汀与小檗碱的外排作用,促进黄柏中这两种生物碱类成分的肠道转运,从而导致黄柏在与知母配伍后,巴马汀与小檗碱在血浆及各组织中的分布相应增加。考察滋肾丸中的21种单体化合物对6种主要P450酶活性的抑制作用,结果表明,新芒果苷和芒果苷对CYP2E1有强烈的抑制作用,IC_(50)值分别为0.47μM和0.15μM,黄柏碱对CYP2D6有强烈的抑制作用,IC_(50)值为0.56μM。叁种化合物在不同浓度(0.5×IC_(50),1×IC_(50))时,均表现为单一型抑制类型的特点,新芒果苷与芒果苷为竞争性抑制,而黄柏碱为非竞争性抑制。考察药材提取物在HepG2细胞模型上对6种主要P450酶的诱导作用,结果表明,黄柏提取物在10μg/mL和30μg/mL时对CYP1A2的诱导作用均非常显着。进一步对黄柏中的化学成分予以筛选,基因表达分析结果表明小檗碱在0.5~4.5μg/mL时诱导作用为对照组的1.5~16.1倍,巴马汀在1~30μg/mL时诱导作用为对照组的2.7~7.2倍。小檗碱在0.5~4.5μg/mL时对CYP1A2的诱导作用提高至阴性对照的1.6~4.9倍,诱导能力强于阳性对照β-萘黄酮(1.9倍),巴马汀在1~30μg/mL时对酶的诱导作用提高至阴性对照的1.1~1.7倍。临床上滋肾丸与其它药物联合应用时,在吸收与代谢环节可能存在的药物相互作用值得注意。五、滋肾丸中芒果苷和知母皂苷B-II的药代动力学研究对大鼠分5、15、45和90 mg/kg四个剂量组灌胃芒果苷后,C_(max)分别为37.2±17.8、86.7±41.5、93.7±53.2、151.5±76.8 ng/mL,AUC_(0-t)分别为120.7±46.4、414.8±252.5、521.1±296.0、715.2±355.5 ng.h/mL,给药剂量与C_(max)和AUC_(0-t)不呈线性关系,表明芒果苷口服后在大鼠体内为非线性药代动力学特征。对大鼠分0.9、1.8和5.4 mg/kg叁个剂量组静注知母皂苷B-II后,C_(max)分别为3976.9±188.2、11295.3±806.6、49996.5±9572.3 ng/mL,AUC_(0-t)分别为833.7±33.2、2263.6±180.4、12550.6±2204.2 ng.h/mL,给药剂量与C_(max)和AUC_(0-t)呈正相关,表明知母皂苷B-II静注后在大鼠体内为线性药代动力学特征。对大鼠分30、90和180 mg/kg叁个剂量组灌胃知母皂苷B-II后,C_(max)分别为55.6±38.4、432.6±353.3、1644.5±1242.8 ng/mL,AUC_(0-t)分别为122.6±114.9、330.0±218.2、2191.3±1194.5 ng.h/mL,给药剂量与C_(max)和AUC_(0-t)不呈线性关系,AUC_(0-t)随剂量增加而升高较快,可能为非线性消除所致。生物利用度研究表明,知母皂苷B-II在SD大鼠和Beagle犬体内的口服生物利用度很低,分别为1.1%与0.71%。
李红艳[9]2009年在《甾体皂苷TSA对脑缺血大鼠恢复期神经功能的影响及其机制研究》文中认为缺血性卒中因其高发病率、高死亡率、高致残率而极具危害性,缺血性卒中的最佳治疗时间窗是发病6小时以内,目前公认的有效方法是溶栓治疗,但受溶栓时间窗和治疗条件所限,仅2%-5%的患者能进行该项治疗;同时溶栓治疗虽可建立缺血区血流再灌注,但不能解决缺血引起的脑组织再灌注损伤。对于不能及时进行溶栓的大多数脑缺血患者来说,如何促进缺血损伤后的神经功能恢复,是脑缺血恢复早期治疗的重要内容。脑缺血可激活成年哺乳动物脑内的神经发生,诱导内源性神经前体细胞分裂、增殖并向损伤区域迁移,进而分化为成熟神经细胞,部分替代损伤后丢失的区域特异性神经元。神经发生与血液供应密切相关,尽快恢复缺血区的血供,挽救濒死的神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞,是治疗缺血性脑血管病的关键。除抗凝,溶栓等传统治疗手段外,刺激脑内的神经发生和血管新生可能成为新的临床治疗手段。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素(angiopoietin,Ang)是重要的促血管生成因子,同时也有神经保护,促神经发生的作用,Ang1和Ang2依赖于VEGF而起作用。神经发生与血管新生的关系紧密,而VEGF很可能是连接二者的关键调控因子之一。Wnt/β-catenin是调控神经系统发育中,神经干细胞增殖和分化的经典通路,β-catenin能够促进神经干细胞的增殖,并影响着干细胞的分化方向,在缺血肢体的血管新生研究中也有重要作用。在脑缺血后VEGF,Ang1、Ang2与Wnt/β-catenin通路几个关键因子:β-catenin,GSK3β,c-myc水平的变化与神经发生和血管新生的关系是本课题探索的一个主要问题。甾体皂苷TSA是知母的有效成分之一,研究表明知母皂苷对急性脑缺血再灌注损伤具有确定的保护作用,其机制涉及调控缺血脑组织血管内皮功能,抗血栓形成和改善血液流变学等方面,而对于脑缺血损伤恢复早期神经发生和血管新生的研究作者尚未见报道,本课题采用大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注以及永久性大脑中动脉缺血模型,观察TSA对脑梗死后恢复期神经功能的影响,着重探讨脑组织损伤及修复过程中TSA对缺血脑组织病理变化、神经发生以及血管新生的干预作用。为其脑缺血疾病的临床应用提供实验依据,同时也为脑梗死最佳治疗时间窗之外的中药干预时机的合理性进行探索。本课题主要分为叁个部分:第一章甾体皂苷TSA对脑缺血再灌注大鼠神经功能的影响及其机制的研究第一节:TSA对脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复及其血管新生的影响目的探讨TSA对脑缺血再灌注大鼠恢复早期神经功能及其血管新生的影响方法线栓法建立SD大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型,随机分为模型组;TSA15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg给药组;安宫牛黄丸400mg/kg阳性对照组,以及假手术组。于恢复早期3—14天灌胃给药,1次/天,缺血后3,7,10,14天进行横木行走实验,触觉刺激实验,抓握力量实验,观察缺血后神经功能的动态变化;缺血后14天,用HE染色及尼氏染色观察运动感觉皮层区神经元的病理改变,免疫组化方法检测脑梗死周围区VEGF/VEGFR2的表达以及CD34标记微血管的密度。结果与假手术组比较,脑缺血后模型组大鼠的神经功能评分均明显降低,(P＜0.01)与模型组比较,缺血14天,TAS 30mg/kg、60mg/kg给药组大鼠横木行走的能力明显增强,执行评分显着提高,(P＜0.05);触觉刺激敏感度恢复明显,揭除胶布的潜伏期明显缩短(P＜0.05,P＜0.01);大鼠抓握力量表现出增加的趋势,但是没有统计学意义。缺血14天,与假手术组比较,模型组大鼠皮层运动感觉区的神经细胞明显损伤,与模型组比较,TAS 30mg/kg、60mg/kg给药组皮层运动感觉区的完整神经细胞的数量增加(P＜0.01),皮层运动感觉区神经元尼氏体的表达增加(P＜0.05,P＜0.01);与假手术组比较,模型组梗死周围区VEGF的表达和微血管的密度明显增高,VEGFR2的表达降低;与模型组比较,TAS30mg/kg、60mg/kg给药组梗死周围区VEGF(P＜0.05,P＜0.01)和VEGFR2的表达(P＜0.05,P＜0.01)以及梗死周围区微血管的密度明显增加,(P＜0.05,P＜0.01)。结论TSA可加快大鼠脑缺血后神经功能的恢复,其可能的机制是通过上调VEGF和VEGFR2的表达促进了内源性的血管新生。第二节TSA对脑缺血再灌注大鼠内源性神经前体细胞增殖的影响目的探讨TSA脑缺血再灌注大鼠内源性神经前体细胞增殖的影响。方法线栓法建立SD大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型,随机分为模型组;TSA15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg给药组;安宫牛黄丸400mg/kg阳性对照组,以及假手术组。缺血后1至7天腹腔注射5'-溴脱氧尿核苷(BrdU),50mg/kg,1次/天,用于标记增殖的细胞。于恢复早期3—14天灌胃给药,1次/天,缺血后7天,14天,免疫荧光染色法检测BrdU标记的新生细胞,免疫组化法检测梗死周围区巢蛋白(Nestin)的表达,结果缺血7天、14天,与假手术组比较,模型组大鼠的SVZ区的Brdu阳性细胞数和梗死周围区Nestin的表达明显增加(P＜0.05,P＜0.01);与模型组比较,缺血7天、14天TSA 30mg/kg、60mg/kg给药组显着增加侧脑室下区的Brdu阳性细胞数(P＜0.05,P＜0.01)和梗死周围区Nestin蛋白的表达(P＜0.05,P＜0.01)。结论TSA可以促进脑缺血再灌注大鼠内源性的神经发生。TSA可能以此作用机制促进了大鼠脑缺血后神经功能的恢复。第二章TSA对永久性脑缺血大鼠恢复期神经功能的影响及其机制研究目的探讨TSA对永久性脑缺血大鼠恢复期神经功能的影响以及对脑内神经发生和血管新生的作用。方法线栓法建立SD大鼠永久性大脑中动脉缺血(pMCAO)模型,随机分为模型组;TSA 15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg给药组;安宫牛黄丸400mg/kg对照组,必存7mg/kg对照组以及假手术组。术后1-7天腹腔注射BrdU,50mg/kg,1次/天,用于标记增殖的细胞。于恢复早期3—14天灌胃给药,1次/天,缺血后3,7,14,天进行横木行走实验,触觉刺激实验,抓握力量实验,观察神经功能的动态变化;缺血后14d,BrdU/Dcx免疫荧光双标记观察皮层和纹状体梗死周围区神经前体细胞的迁移情况;BrdU/FactorⅧRelatedAntigen免疫荧光双标记新生的微血管;缺血后28d,BrdU/NeuN以及BrdU/GFAP免疫荧光双标记鉴定新生细胞的存活和分化类型;结果与假手术组比较,缺血后3-14天,模型组各项神经功能检测指标均明显降低,(P＜0.05,P＜0.01),观察期内有自发恢复特点,但仍低于假手术水平;与模型组比较,缺血后14天,TAS30mg/kg、60mg/kg给药组能够促进脑缺血大鼠横木行走的能力,(P＜0.05,P＜0.01);缩短揭除胶布的潜伏期,(P＜0.05,P＜0.01);增加大鼠的抓握力,(P＜0.05,P＜0.01)。缺血后14天,与假手术组比较,模型组皮层和纹状体梗死周围区Brdu~+/Dcx~+细胞数,新生微血管的密度明显增加(P＜0.01);与模型组比较,TAS30mg/kg、60mg/kg给药组皮层梗死周围区Brdu~+/Dcx~+细胞数以及新生微血管的密度明显增加(P＜0.05,P＜0.01);对纹状体梗死周围区Brdu~+/Dcx~+细胞数以及新生微血管的密度没有影响。缺血后28天,与假手术组比较,模型组大脑梗死周围区Brdu~+/Neun~+细胞数,Brdu~+/GFAP~+细胞数目明显增加(P＜0.05);与模型组比较,TAS 30mg/kg、60mg/kg给药组皮层Brdu~+/Neun~+细胞数明显增加(P＜0.05),对纹状体和皮层Brdu~+/GFAP~+细胞数目没有影响。结论TSA可改善大鼠永久性脑缺血后神经功能的恢复,可能与其促进内源性的神经发生和血管新生从而实现神经血管网络结构和功能的修复有关。第叁章TSA对永久性脑缺血大鼠恢复期神经发生及血管新生相关调节通路的影响第一节TSA对永久性脑缺血大鼠恢复期大脑皮层血管生成调节通路Ang1/Ang2,VEGF/VEGFR2水平的影响目的探讨TSA对大鼠永久性脑缺血损伤修复过程血管新生相关调节因子蛋白和基因水平的影响方法建立SD大鼠大脑中动脉(MCAO)永久性缺血模型,随机分为模型组;TSA 15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg给药组;安宫牛黄丸400mg/kg照组,必存7mg/kg对照组以及假手术组。于恢复早期3—14天给药,缺血后3d,7d,14d酶联免疫吸附法(ELISA)检测缺血侧大脑皮层Ang1,Ang2,的水平;缺血后7d,14d Western-blot法检测缺血侧皮层VEGF的蛋白表达,Real-Time PCR法检测皮层VEGFmRNA,VEGFR2mRNA的水平。结果与假手术组比较,脑缺血后3-14天,模型组大鼠缺血侧皮层Ang1含量降低,其中缺血第7天降低明显且有统计学意义;缺血第7天,与模型组比较,TSA中,大剂量组以及安宫牛黄和必存组Ang1水平明显增高,(P＜0.05,P＜0.01);缺血第14天,各给药组与模型组Ang1水平无明显差异。脑缺血后3-14天,假手术组和各缺血组比较Ang2的表达均无明显差异。缺血后7d,TSA 60mg/kg明显增加大鼠大脑皮层VEGFR2 mRNA的水平,但对VEGF及VEGFmRNA水平无明显影响。结论TSA可改善大鼠脑缺血后神经功能的恢复,可能与其诱导脑缺血后皮层Ang1,VEGFR2 mRNA水平的上调,促进了梗死周围区血管新生的效应有关。第二节TSA对永久性脑缺血大鼠恢复期Wnt/β-catenin信号通路的影响目的探讨TSA对大鼠永久性脑缺血损伤恢复期Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、c-myc,GSK3β水平的影响方法建立SD大鼠大脑中动脉(MCAO)永久性缺血模型,随机分为模型组;TSA 15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg给药组;安宫牛黄丸400mg/kg照组,必存7mg/kg对照组以及假手术组。于恢复早期3—14天给药,缺血后3d,7d,14d酶联免疫吸附法(ELISA)检测缺血侧大脑皮层糖原合成酶3(GSK3β)的含量;缺血后7d,14d,Western-blot法检测缺血侧皮层:β连环素(β-catenin)以及c-myc的表达;Real-Time PCR法检测β-catenin mRNA、c-myc mRNA、的水平。结果与假手术组比较,模型组皮层GSK3β的含量在3-7d升高,14d下降,与模型组比较,缺血后3-14d,TSA对GSK3β的表达无统计学差异。缺血后7d,与假手术组比较,模型组c-myc、c-mycmRNA以及β-catenin、β-catenin mRNA含量明显增加。与模型组比较,TSA 60mg/kg大鼠大脑皮层c-myc蛋白含量明显增加(P＜0.01);TSA中剂量组c-mycmRNA表达量明显增加(P＜0.05);TSA中,大剂量组,β-catenin mRNA表达量显着增加(P＜0.05)。缺血后14d,与假手术组比较,模型组c-myc、c-mycmRNA以及β-catenin、β-catenin mRNA表达均降低。与模型组比较,TSA各剂量组β-cateninmRNA和c-myc mRNA表达量均明显增高,(P＜0.05);并且TSA促进β-cateninmRNA与c-myc mRNA表达的增加趋势一致;TSA大剂量组β-catenin蛋白和c-myc蛋白含量均明显增高(P＜0.05,P＜0.05),并且TSA促进β-catenin和c-myc蛋白表达的增加趋势一致。结论TSA通过上调β-catenin基因及蛋白的表达而激活了Wnt/β-catenin信号转导通路,TSA有可能通过这一途径促进了脑缺血后大鼠的内源性神经发生和血管新生的病理生理反应事件,增强了大鼠神经血管网络的重建和组织的自体修复,改善脑缺血后大鼠的神经功能障碍。课题创新点:1.本课题结合临床中多数脑缺血病人错过急性期治疗时间窗导致后遗症的现状,针对脑缺血神经功能的恢复早期进行药物TSA在动物模型中的干预,探讨TSA对这一阶段脑组织功能重建的影响,切入时间点具有新颖性,是对脑缺血急性期与恢复期之间中药干预时间窗可能性研究的一个积极补充。2.围绕脑缺血后神经功能缺损的行为学表现,结合促血管生成相关因子(VEGF/VEGFR2,Ang)和神经发生的Wnt/β-catenin经典信号调控通路中关键因子β-catenin、GSK3β,c-myc,水平的变化展开TSA对脑组织缺血后神经发生和血管新生作用的机理探讨。
张治强, 李霞, 孙连娜[10]2009年在《知母皂苷及其苷元在中枢神经系统的药理作用》文中研究说明知母为百合科植物知母的干燥根茎,知母皂苷及其苷元在治疗中枢神经系统疾病中发挥重要作用。知母皂苷及其苷元通过促进脑M受体生成,对神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)的影响,对脑内自由基代谢的影响,对学习记忆的影响等发挥抗衰老作用;同时,知母皂苷及其苷元具有明显抗抑郁作用和抗脑缺血-再灌注损伤的作用。
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[10]. 知母皂苷及其苷元在中枢神经系统的药理作用[J]. 张治强, 李霞, 孙连娜. 医药导报. 2009