刘晓明, 陈元仲, 黄美娟, 刘霞, 郭江睿[1]2005年在《粒细胞集落刺激因子的应用对急性白血病患者预后的影响》文中研究指明目的观察粒细胞集落刺激因子(GCSF)的应用对急性白血病(AL)患者预后的可能影响。方法回顾性研究171例可评价AL患者。分别采用χ2、Cox回归、KaplanMeier等方法分析1疗程完全缓解(CR)率、总CR率、治疗有效率、化疗后WBC减少时间、CR期、生存期及其影响因素;采用等级相关分析GCSF用量与CR期及生存期的关系。急性髓系白血病(AML)患者交替采用以柔红霉素+阿糖胞苷(DA)或高三尖杉酯碱+阿糖胞苷(HA)或米托蒽醌+阿糖胞苷(MA)为主的方案进行诱导缓解和缓解后治疗。急性淋巴细胞白血病(ALL)患者交替采用以长春新碱+柔红霉素+泼尼松(VDP)或长春新碱+阿霉素+泼尼松(VAP)或长春新碱+米托蒽醌+泼尼松(VMP)或环磷酰胺+长春新碱+柔红霉素+泼尼松(CODP)为主的方案进行诱导缓解和缓解后治疗。用药组均在患者WBC<1.0×109/L时予以重组人GCSF(rhGCSF)(1.5～6.0μg·kg-1·d-1),一般WBC达2.5×109/L时停用。结果(1)AL患者化疗后应用GCSF可使化疗后WBC减少时间明显缩短;但不影响患者的1疗程CR率、CR率和治疗有效率;(2)使用GCSF不影响ALL患者CR期,但明显缩短AML患者CR期;(3)使用GCSF不影响ALL患者的生存期,但缩短AML患者的生存期;(4)尚未发现使用GCSF的AML患者中因子用量多少与CR期及生存期存在相关关系。结论AML患者必须非常慎用GCSF。
徐钰, 孙钧铭, 张莲芬, 窦文芳, 李洁[2]2008年在《人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达》文中认为制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp)。重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽。插入表达载体pPIC9K中α交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF。电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性。结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础。
卢一凡, 田靫, 邓继先, 程萱, 黄培堂[3]1999年在《La-tPA/G-CSF双转基因鼠的建立及在乳腺的表达研究》文中研究说明分别以小鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′区 2 .6kb和羊β 乳球蛋白 (BLG)基因5′区 5kb为调控序列 ,构建了乳腺表达人集落剌激因子 (G CSF)及组织纤溶酶原激活剂突变体 (La tPA)载体 .利用显微注射法分别建立了G CSF和La tPA的转基因小鼠 ,在获得G CSF和La tPA表达基础上 ,采用 2种转基因小鼠交配的方式 ,对后代仔鼠进行了双引物同步PCR检测 ,筛选并建立了La tPA和G CSF的双转基因鼠 ,研究了不同转基因在小鼠体内共表达的情况 .Northernblot分析表明 ,在一些双转基因鼠中表达出La tPA和G CSF .后代鼠的一些基本特征为 ,产仔数明显低于正常鼠 ,双转基因占 46 .1 %,雌雄比例基本正常 .双转基因鼠的建立为未来利用转基因动物生产多种蛋白质提供依据 .
黄丽丽, 庄亚玲, 黄荷凤, 石一复[4]2003年在《粒细胞集落刺激因子在人卵泡颗粒细胞中的表达》文中进行了进一步梳理粒细胞集落刺激因子 (GCSF)属于糖蛋白生长因子家族 ,为造血细胞的生存、生长和分化所必需 ,而且能影响外周成熟血细胞的功能。人们发现 ,一些非造血组织 ,如胎盘、卵巢肿瘤和胎儿的器官组织等 ,也能表达GCSF和GCSF受体(GCSFR) [1 3 ]
王梁平[5]2000年在《自身免疫性中性粒细胞减少的临床表现》文中认为自身免疫性中性粒细胞减少并不多见,常见发生于年轻妇女,可能其他自身免疫性疾病或淋巴增殖性疾病有关。确诊需要在血清和中性粒细胞表面查到粒细胞特异性抗体。这种病人通常治疗困难。通行方法是用碳酸锂,大剂量静脉注射免疫球蛋白和免疫抑制剂,但结果令人失望。脾切除可作为三线治疗方法,但常有术后感染的风险。重组人GCSF治疗严重的慢性中性粒细胞减少Felty s综合证、慢性T细胞淋巴细胞伴中性粒细胞减少和大部分近期自身免疫中性粒细胞减少是有作用的。病人可以自己皮下用药,副作用小。根据1993-1999年之间,在Bath的一组病人的资料,引起人们注意的是长期治疗产生耐受,继发感染及疾病本身的病理机制。
李飞宇[6]1992年在《人G-CSF cDNA的克隆和鉴定及其在哺乳类细胞中的稳定表达》文中研究指明粒细胞集落刺激因子(简称G-CSF)是集落刺激因子(CSF_8)家族的重要因子。具有选择性刺激定向千细胞分化生成中性粒细胞集落的功能，并且对某些白血病细胞的分化和增殖有影响。现已被广泛用于基础和临床研究。我们应用多聚酶链反应(PCR)等技术快速扩增并克隆了G-CSF cDNA，进行了序列分析，构建了其逆转录病毒重组表达载体并在小鼠骨髓瘤细胞中成功地表达了具有生物活性的G-CSF。为进一步研究造血细胞分化机制、白血病发病机制及临床应用打下基础。 人膀胱癌细胞系(5837)经常规培养至所需数量后，用异硫氰酸胍／氯化铯法提取总RNA，应用CETUS的GeneAmp RNA PCR Kit系统进行逆转录反应合成cDNA第一条链，用DNA合成仪合成G-CSF cDNA的上游和下游特异性引物，以cDNA第一条链为模板进行PCR反应，特异性扩增G-CSF cDNA。凝胶电泳显示，放大的cDNA片段为640bp左右。从电泳胶回收后，用KpnⅠ和hindⅢ酶切，将酶切片段克隆入噬菌体M13mp18中，用USB DNA序列分析系统进行序列分析。将插入M13mp18的G-CSF cDNA片段用同法克隆到M13mp19中进行反方向的序列分析。结果显示：所克隆的G-CSF cDNA全编码区序列为612bp，它编码30个氨基酸的信号肽和174个氨基酸的成熟蛋白。除第43位codon出现一个碱基突变(CAC→TAC)导至一个氨基酸改变(组氨酸→酪氨酸)外其余部分与Souza等198(?)年的结果一致。用KpnⅠ和HindⅢ酶切并分离M13mp19中的G-CSF片段，经用T4polymerase处理产生G-CSF cDNA片段的(?)'平端，与XM-6逆转录病毒载体(经BglⅡ、Mung bean nuclease和HindⅢ处理)重组。将重组载体在E．coli中扩增，常规提取。Southern杂交及酶切图谱显示：G-CSF cDNA片段已插入载体中，其插入的位置及方向均与设计的一致。利用Lipofectin方法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞PA317中，在G418筛选下挑选产生高滴度amphotropic重组病毒的PA317克隆，以其上清在体外感染SP2／0细胞，经G418筛选，用有限稀释法单克隆化，体外软琼脂集落培养(CFU-GM)检测显示：转化的SP2／0细胞培养上清具有G-CSF生物活性，能有效地刺激小鼠骨髓造血干细胞增殖和分化形成中性粒细胞集落。 本研究应用PCR等方法快速有效地扩增和克隆了G-CSF cDNA，经用其重组逆转录
冯延叶[7]2013年在《变性蛋白复性装置研制及包涵体蛋白变性和复性技术研究》文中指出在后基因组时代,蛋白质结构和功能的研究常需要大量的活性蛋白。大肠杆菌仍然是目前最常用的外源蛋白表达系统。但外源蛋白在大肠杆菌中大多表达为不可溶的包涵体蛋白,从而限制了蛋白质科学研究。因此,从包涵体中获取有活性的目的蛋白是目前蛋白质制备中最为关键的技术瓶颈之一。为此,本研究主要开展了三个方面的工作：(1)尝试开发一台变性蛋白复性装置,用于执行当前最广泛使用的复性方法或过程,并满足常规的蛋白质纯化操作；(2)探究包涵体二步变性和复性技术可提高可溶蛋白得率的机制；(3)基于包涵体两步变性和复性技术,针对特定蛋白开发从包涵体中获取活性蛋白的技术方案。本研究首先尝试将当前最广泛使用的复性方法---稀释复性、透析复性和柱复性等,集成在一台自动化的装置中。该变性蛋白自动化复性装置包括四元梯度阀、数控泵、复性釜、超滤膜组件、电磁阀、色谱柱、检测器、控制系统等配件。原理上,该装置不仅能够独立执行上述三种复性方法,还可以组合两种或两种以上的复性技术以拓展复性过程,还能够完成蛋白复性后溶液的在线浓缩、纯化等工作。本论文选择了不同的变性蛋白复性方法用来评估该装置的效果：稀释与透析复性方法联合用于人干细胞趋化因子1(human stromal cell-derived factor1, SDF/CXCL12)和硫氧还蛋白-人artemin融合蛋白(thioredoxin-human artemin fusion protein, Trx-ARTN),稀释复性方法用于硫氧还蛋白-人类胰岛素生长因子Ⅰ融合蛋白(thioredoxin-human insulin-like growth factor1fusion protein, Trx-IGF1)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP),柱复性方法用于牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)。特别是,复性后SDF/CXCL12、Trx-ARTN、Trx-IGF1等蛋白溶液直接进行在线富集和分离纯化。本研究还利用缓慢降低变性剂浓度的策略对上述五种蛋白的复性过程进行了初步的优化。例如,反向稀释和透析方法能够从30mg蛋白纯度为～60%的变性蛋白中获得10.5mg蛋白纯度为～92%的SDF/CXCL12,其目的蛋白产率是稀释和透析复性方法的2倍；在BSA复性实验结果中,连续透析复性方法的正确折叠蛋白产率是～95%,而柱复性方法的是～50%。本研究结果说明,调节溶液流速、混合比例和流路选择就可以设定和维持整个变性蛋白复性过程。而且,在该变性蛋白复性装置上联合使用缓慢降低变性剂浓度的策略和蛋白后续操作是一种很好的进行大规模蛋白制备的方法。本课题组之前开发了一种简单、高效的包涵体处理工艺,即包涵体二步变性和复性技术(Two-step denaturing and refolding techniques,2DR)。包涵体蛋白首先溶解在7M盐酸胍溶液中,随后梯度稀释盐酸胍浓度至大量蛋白沉淀析出；蛋白沉淀再次溶解在8M尿素溶液中进行后续复性工艺。2DR的可溶蛋白得率和活性蛋白收率明显优于常规的一步变性和复性方法(One-step denaturing and refolding techniques,1DR)。鉴于此,本研究还进一步探索了2DR技术优势的缘由及相应的蛋白变性和复性技术方案。首先,与常规的包涵体洗涤过程相比,2DR的包涵体洗涤工艺在包涵体蛋白纯度、活菌存活数量、包涵体颗粒完整性等方面不存在明显的差异。然后,以EGFP包涵体蛋白为模型,蛋白质折叠／去折叠平衡实验揭示2DR和1DR之间的差异来自8M urea溶解的对象。激光共聚焦拉曼光谱实验说明2DR中的蛋白沉淀与包涵体蛋白在蛋白质二级结构组成、含芳香环氨基酸暴露程度、半胱氨酸暴露程度等方面具有相似性,但其他谱带如680～800cm-1、1020～1100cm-1、1120～1220cm-1、1380～1420cm-1等反映出C-C、 C-N、 C=O等化学键的结构和环境存在很大的差异性。于是,这些在物质和结构组成上的差异就有可能增强了后续的变性蛋白的复性效率。然后,本研究借鉴分子伴侣蛋白GroEL/GroES帮助蛋白质折叠的机制,探索各种物理化学溶液条件对折叠中间体的第二次变性或构象约束。EGFP折叠中间体先经过0.5M L-Arg和300mM NaCl等条件的构象约束作用,除去添加物分子后继续在自发状态下折叠,蛋白的再折叠效率达到80%。最后,以日本血吸虫MTH1蛋白复性为例,在二步变性和复性技术基础上,通过复性液的筛选及复性过程的优化,从0.5升LB培养基获得单体形式的MTH1蛋白15mg且纯度大于95%。至此,本研究提出以折叠中间体的第二次变性或构象约束为策略来设计包涵体蛋白变性和复性的技术方案。综上,本研究首次将当前最广泛的复性方法集成在一台装置以提高变性蛋白复性工作效率,并在包涵体二次变性复性技术基础上,探索和发展了包涵体蛋白变性和复性工艺,为提高蛋白质制备工作效率奠定了良好的技术基础。
参考文献：
[1]. 粒细胞集落刺激因子的应用对急性白血病患者预后的影响[J]. 刘晓明, 陈元仲, 黄美娟, 刘霞, 郭江睿. 中华内科杂志. 2005
[2]. 人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达[J]. 徐钰, 孙钧铭, 张莲芬, 窦文芳, 李洁. 药物生物技术. 2008
[3]. La-tPA/G-CSF双转基因鼠的建立及在乳腺的表达研究[J]. 卢一凡, 田靫, 邓继先, 程萱, 黄培堂. 中国科学C辑:生命科学. 1999
[4]. 粒细胞集落刺激因子在人卵泡颗粒细胞中的表达[J]. 黄丽丽, 庄亚玲, 黄荷凤, 石一复. 中华病理学杂志. 2003
[5]. 自身免疫性中性粒细胞减少的临床表现[J]. 王梁平. 国外医学.输血及血液学分册. 2000
[6]. 人G-CSF cDNA的克隆和鉴定及其在哺乳类细胞中的稳定表达[D]. 李飞宇. 中国协和医科大学. 1992
[7]. 变性蛋白复性装置研制及包涵体蛋白变性和复性技术研究[D]. 冯延叶. 华东理工大学. 2013