1齐齐哈尔医学院病理学院161006 2齐齐哈尔医学院第一附属医院161006
【摘要】目的 探讨 Snail 参与调控卵巢癌细胞上皮间质过程及卵巢癌侵袭能力的影响。方法 选取齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心2010-2014年期间病理诊断为卵巢癌的病例，外科手术切除的癌组织和癌旁组织64例，用RT-PCR法检测卵巢癌组织和癌旁组织中 Snail和E-cadherin基因的表达。用Transwell实验来观察Snail对卵巢细胞侵袭能力的影响。结果 Snail基因在III期和IV期 卵巢癌中的表达水平，明显高于I期和II期（P<0.05）。而E-cadherin的表达水平随着临床分期的进展而下降（P<0.05）。Snail的表达与E-cadherin的表达呈负相关。Transwell实验显示Snail能够明显促进卵巢癌细胞的侵袭。结论Snail可能通过靶向控制E-cadherin表达，促进卵巢癌细胞的上皮间质转化进程，促进卵巢癌细胞的侵袭。
【关键词】Snail；上皮间质转化；卵巢癌
卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤中死亡率最高的一种，预后很差，因多数患者确诊时已为晚期，且多伴有远处转移[1]。有研究显示，卵巢癌中上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的进程与病情进展密切相关[2]。Snail具有促进EMT的重要作用，而E-cadherin是EMT 发展十分重要的分子标志和关键分子，可作为探索肿瘤细胞EMT调控机制的分子靶向标志物[3]。为探索Snail和卵巢癌E-cadherin表达异常之间的相关性，用RT-PCR法检测卵巢癌组织和癌旁组织中 Snail和E-cadherin基因的表达,并探讨其对E-cadherin的调控作用和对卵巢癌细胞侵袭能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
选取齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心2010-2014年期间病理诊断为卵巢癌的病例，外科手术切除的癌组织和癌旁组织64例。RPMI-1640培养液购于北京碧橙蓝生物科技有限公司；Trizol试剂购于上海生工生物工程有限公司，Tag酶为美国Promega公司产品。
1.2 细胞培养和转染
HO-8910人卵巢癌细胞株购于中科院上海细胞库。Snail基因被扩增(F: 5’-CGGGATCCTT-CTTCTGCGCTACTGCTGCG-3’; R: 5’-CGGAATTC-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA-3’)。六孔板中转染之前每孔接种4×105，培养12h后使用invitrogen lipo3000转染试剂，转染Snail 48 h之后进行实验。
1.3 Snail 和E-cadherin表达检测
用RT-PCR法检测卵巢癌组织和癌旁组织中 Snail和E-cadherin基因的表达，以GAPDH作为内参照，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应条件：95℃预变性15min，95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min。
1.4 细胞侵袭试验
将100ulMatrigel与500ul与无血清RPMI-1640培养液混合,每孔100ul加入Transwell上室，放置37℃温箱2h。在24孔板中每孔加入900μl的10%胎牛血清的1640培养液，置入Transwell上室，每个细胞培养小室加400μl无血清1640培养液，含有5×104个细胞。孵育24h后上室，加入现配的4%多聚甲醛固定20min，结晶紫染色10min，PBS充分冲洗，高倍镜下挑选8个视野进行细胞计数。
1.5 统计学分析
计量资料以均数±标准差（ ）表示，进行t检验，选用SPSS17.0统计软件进行处理，以α=0.05为校验水准。
2 结果
2.1 Snail 和E-cadherin等EMT相关分子标记物的表达
Snail 和E-cadherin等EMT相关分子标记物在乳腺癌组织的不同临床阶段的基因表达如表1所示，Snail基因的表达水平在III期和IV期卵巢癌中的表达水平明显高于I期和II期（P<0.05）；而E-cadherin基因的表达水平随着临床分期的发展而下降（P<0.05）。Snail 基因和E-cadherin基因的表达成明显负相关（表1，表2）。
Table 1 The primer used in the real -time PCR
图1 Snail 表达上调对卵巢癌细胞侵袭的影响
3讨论
研究显示，卵巢癌等多种肿瘤组织，尤其是转移病灶中均存在E-cadherin的异常表达，说明E-cadherin的表达与恶性肿瘤的侵袭、转移、治疗和预后都有一定的相关性[4]。E-cadherin为EMT的关键分子，其异常表达受基因突变、启动子甲基化等多方面调控。Snail属于转录抑制因子超家族，参与EMT的调控，和多种信号通路共同调控细胞的表型，在胚胎发育、细胞分化、创伤愈合和肿瘤转移等过程中起重要作用，Snail通过诱导EMT 过程促进肿瘤细胞侵袭和转移[5]。E-cadherin 是负责调控细胞极性、细胞和基质的黏附能力等细胞上皮表型，Snail通过下调E-cadherin而触发上皮细胞向间充质细胞的转变。Snail是通过与E-cadherin 基因启动子区域结合，达到抑制E-cadherin 蛋白的表达的作用，从而诱导EMT 发生。使肿瘤细胞主要表现出细胞排列极性的丧失或减少、细胞形态变梭、能够伸出伪足，增强了侵袭运动能力等特点。同时E-cadherin等上皮标志物表达减少，而Vimentin等间质标志物表达增加[6]，目前认为E-cadherin 表达丢失是EMT 最显著特征[7]。
本研究检测了Snail和E-cadherind等EMT 过程密切相关的标志物在卵巢癌组织的表达水平，结果表明，Snail的表达水平在卵巢癌中的表达，III期和IV期的表达水平明显高于I期和II期，而E-cadherind的表达水平随着临床进展而下降。在研究中我们也发现Snail和E-cadherind的表达呈显著负相关，Snail通过抑制E-cadherin 表达，从而诱导EMT 发生。
本研究还显示转染Snail表达载体后，HO8910细胞的数量通过Transwell基质胶进入下室的细胞数显著高于对照组，这意味着Snail诱导的EMT的发生，能够使细胞间连接发生变化和加强细胞的侵袭能力。
总之,目前的研究揭示了Snail与卵巢癌侵袭转移之间的相关性和上皮间质转化中的作用，并在某种程度上探讨了由Snail介导的EMT过程的分子机制，这将是未来肿瘤研究的重点。
参考文献
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基金支持：黑龙江省教育厅面上项目，项目编号：12541935
论文作者:温秋婷1,王玉楼2,赵学敏2,帅智峰1,李春燕1,
论文发表刊物:《医师在线》2016年3月第6期
论文发表时间:2016/6/15
标签：细胞论文; 卵巢癌论文; 基因论文; 组织论文; 转染论文; 卵巢论文; 癌细胞论文; 《医师在线》2016年3月第6期论文;