冼桂江
【摘 要】 近年来，随着分子生物学技术，免疫学技术及其他新的检测技术的应用，沙门菌的检测方法，打破了传统分离 培养的单一方法。本文对目前各种沙门菌的检测技术进行了系统的概述。
【关键词】 沙门菌； 检测技术； 进展
沙门菌在自然界中分布广泛，是一种重要的人畜共患病原菌。不但能引起家畜、家禽及其他动物发生感染,而且能通过污染食物导致人的食物中毒。在世界各国的各类细菌性食物中毒中，以沙门菌引起的在英国为首位，在美国为第二位。在欧洲，每年有超过16万人感染沙门菌【1】；在美国每年有140万人感染沙门菌【2】；在我国，由沙门菌引起的食源性食物中毒占首位或第二位【3】。生物学特性
沙门菌属肠杆菌科，革兰染色阴性杆菌，适宜温度为37℃.大多数沙门菌有菌体鞭毛能运动，菌体溶解时能产生内毒素【4】。有些沙门菌含有耐药因子，对某些抗生素产生耐药作用。
沙门菌菌型繁多，已确认的沙门菌有2500个以上的血清型【5】。在我国已发现200多个菌型。引起人类疾病的主要有猪霍乱沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡沙门菌和鸭沙门菌等10多个血清型。
检测方法
1．国标方法 GB/T4789.4-2010是我国目前规定的食品中沙门菌的标准检测方法。该检测方法主要是根据沙门菌的特性，分五个步骤进行，即前増菌、选择性増菌、选择性平板分离、生化试验和血清学分型鉴定。该方法检测技术成本低，但检验程序复杂，耗时长，一般要4-7d才能得出准确的结果。针对此方法的缺点，有研究者对其进行了改良，比较常用有以下三种：
1.1 添加物质法 由于沙门菌具有特异性地分解丙烯乙二醇产酸，使中性红指示剂变红的生化特性，在分离培养基中加入丙烯乙二醇，5-溴-4-氯-3-吲哚-D呋喃半乳糖，可对沙门菌的分离与鉴定同步进行，使沙门菌检测所需时间从常规方法的4-7d缩短至2d【6】。
1.2 疏水网格滤膜法（HGMF） 疏水网格滤膜法是利用滤膜的疏水性粘附细菌细胞，通过膜进行选择性地培养，达到检测鉴定目的菌的作用。疏水网格滤膜法对传统检测方法中的常规平板划线做了改进。样品通过滤膜的过滤，浓缩了样品中的细菌，除去了多余的生长抑制物质，使目的菌粘附在疏水网格滤膜的小格中，在疏水网格滤膜上倾入沙门菌选择性培养基，培养后即可计数。该方法比国标法操作简化，检测时间可缩短至3d左右【7】。
1.3 显色培养法 显色培养法是在培养基中加入沙门菌某些特异性酶的底物，该底物通常为无色，经特异性酶作用而显现一定的颜色，便于可疑沙门菌的识别【8】。显色培养法使用方便，操作简单，可大大缩短检测时间，能满足应急或基层单位检测的需要，但成本较高，很难普及使用。
2．免疫学检测法 利用抗原抗体的反应特性，对细菌进行鉴别和定型。沙门菌免疫学检测方法大致可分为：酶联免疫吸附（ELISA）法、斑点酶联免疫吸附（Dot-ELISA）法、荧光抗体染色（免疫荧光）法、自动酶标免疫检测仪、免疫磁性分离法等。
2.1酶联免疫吸附测定法（ELISA） Kryinski与Heimsch 1977年首次将酶联免疫吸附测定法用于食品沙门菌检测。随后有许多学者都利用ELISA法进行食品沙门菌的检测，但他们使用的多价血清不同程度地存在交叉反应，使ELISA产生假阳性，在实际工作中造成一定的困难。20世纪80年代，单克隆抗体技术问世并日趋成熟，建立了沙门菌各种o抗原、H抗原的单抗，取代了常规因子血清进行血清学鉴定、伤寒诊断、鸡白痢检疫，并显示出单抗卓越的性能。王志亮等应用淋巴细胞杂交瘤技术获得了4株具有沙门菌广谱结合特性的单克隆抗体，其中2株的反应互补，对已检菌株覆盖率达99%，而对其他受试肠杆菌均无交叉反应。文其乙等在前人的基础上应用沙门菌属特异性单克隆抗体CB8和de7建立了检测沙门菌的直接ELISA方法，并形成了快速检测试剂盒，它能检出肉类样品中至少5cfu/25g，并在48h内得出结果，最低检出量为106cfu/ml，特异性和灵敏性分别为100%和99%【9】。黄素珍等采用筛选强阳性杂交瘤细胞株制备了高效价的3-47-26单克隆抗体，建立了检测肠炎沙门菌的抗原竞争ELISA方法，利用样品中的Lps抑制酶标抗体与包被的Lps结合，以降低底物反应的颜色，从而达到检测的目的【10-12】。通过单克隆抗体大大降低了假阳性率，使ELISA法得以在基层逐渐推广。
2.2 斑点酶联免疫吸附（Dot-ELISA）方法 斑点酶联免疫吸附试验是以微孔滤膜为固相载体的一项免疫酶技术，具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性，比国标分离培养方法缩短3-4d，而且阳性反应色斑易于观察，阳性检出率也高于常规方法。应用该方法检测食品中沙门菌的报道很多。蔡家利等应用Dot-ELISA检测屠宰加工肉品中沙门菌，与常规检测法对200份样品对比检验，该法检出结果符合率为96.65%【13-14】；张红见等【15】应用该法与常规法对西宁某屠宰点85份猪酮体进行了沙门菌检测，结果Dot-ELISA检出沙门菌率为76.47%，常规法的检出率为78.82，两种方法的总符合率为86.57%。张红见等【16】利用上述两种方法对火腿肠进行沙门菌检测，结果在80份样品中，用Dot-ELISA检出沙门菌阳性率为27.30%，常规法检出阳性率为25.00%，两种方法的阳性总符合率为86.36%，两者差异不显著。由此可见，Dot-ELISA适用于大批样品的快速检测，节省人力、物力、财力，便于在基层单位推广使用。
2.3 免疫荧光标记 用荧光素标记已知抗原（或抗体），与特异性抗体（或抗原）结合后产生荧光。由Coons等1950年建立免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原（或抗体）标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。该方法结合了免疫学反应的特异性及在黑色背景中发光物质易被发现的敏感性这些优点，因而能确切地测出少量抗原（或抗体）在细胞内或组织内的定位分布【17、18】。Cloak等利用表面吸附将检测样品吸附于玻璃页面的一种薄膜上，然后用免疫荧光显微镜进行结果判定。Mumon应用自动荧光抗体检测系统检测食品中沙门菌，每小时能检测120个玻片样品，与常规法比较，准确率达96%【19】。此技术具有特异性强、敏感性高、速度快的特点。
2.4 自动酶标免疫检测仪 全自动荧光分析技术对沙门菌的检测和结果的鉴定已经比较成熟，是先后被美国FDA、AOA、USDA等部门认可的一项检测技术。黄玲等利用自动酶标免疫检测仪和国标方法比较检测食品中沙门菌，结果表明该法灵敏度高、特异性强、无传染危险、检测速度快等特点。陶军等利用法国生物-梅里埃公司提供的“自动酶标免疫检测仪”与国标法对冻肉中沙门菌进行检测，指出该仪器最大特点是对被检细菌不需要纯培养，只需在増菌培养基中即可检出。
2.5 免疫磁性分离技术 在含有大量杂菌的食品样品中，利用常规的培养方法很难把病原菌分离出来，采用免疫磁性分离技术，可以很快选择性地分离出所需检测的目的菌。Skjerve等报道了用免疫磁性分离技术从乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门菌，其检测限为100cfu/ml。免疫磁性分离技术直接检测细菌具有特异性好，但灵敏度低。
2.6 乳胶凝集法 此方法是将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。乳胶凝集法的灵敏度比较低，故只适合于已经分离纯化的致病菌或其他微生物进行种或血清型的鉴别，或对病原菌产生分泌的毒素进行分析。
2.7 免疫扩散法 将分离培养或培养富集后的食源性致病菌用可溶性抗原与抗体在含有电解质的半固体琼脂内进行单向或双向扩散，然后根据是否出现沉淀或沉淀带的形式判断致病菌的种类或血清型。
3．分子生物学
随着分子生物学技术的飞速发展，各种以分子生物学为基础的检测方法层出不穷，近年来，分子生物学技术已逐步应用到食品微生物检测中，分子生物学检测沙门菌的原理是：直接对沙门菌的核酸分子特征进行鉴定，具有较大的优越性。
3.1聚合酶链反应技术（PCR） PCR是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。1985年由美国科学家Mullis发明，1992年Rahn首先针对沙门菌属特异性invA基因设计出一对引物，对630株沙门菌进行检测，检测出626株阳性，检出率为99.4%，但许多肠道杆菌能同时扩增出来，特异性较差。此后，各国学者利用PCR技术对沙门菌的检测进行了研究。2000年黄金林、焦新安等根据沙门菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物序列，成功扩增出495bp的沙门菌特异条带，而阴性对照则无此条带，从而建立了应用PCR进行沙门菌快速检测的方法，并研制成临床应用的检测试剂盒[20]。卢强等将自己建立的PCR扩增invA基因特异性检测沙门菌的方法用于食品样品中沙门菌的检测，并结合辣根过氧化物酶直接标记基因探针技术和增强化学发光反应（ECL）技术对扩增产物进行Slot-biot杂交，新建立了PCR-ECL沙门菌检测方法，检测限可达10cfu/g[21]。Nguyen等根据肠炎沙门菌C7克隆株具有的属特异性序列设计出一对引物，能快速地检出肉食品标本中的沙门菌，检测的敏感性和特异性均为100%，保证了检测的准确性[22]。
3.2 核酸探针 目前，检测沙门菌属特异性沙门菌探针已从鼠伤寒沙门菌菌株染色体DNA克隆成功，并用于检测食品中的沙门菌。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆Fitts等在食品沙门菌检测中引入DNA-RNA杂交技术，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门菌DNA片段，其敏感性高，经大约48h増菌后，检测极限可达108cfu/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室中操作，因而妨碍了该方法的推广应用[23]。为此，以核酸杂交为基础的比色计技术目前已发展起来，这种方法依赖于沙门菌核糖RNA（rRNA）及核糖体发育过程中储存的核酸成分进行检测。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得无辐射监测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。
3.3 基因芯片技术 基因芯片技术是近年发展起来的用于多种食源性致病菌快速检测的手段。Chizhikov等采用寡核苷酸芯片研究沙门菌抗原和毒力因子与其致病性的关系，发现细菌毒力因子可用于肠道致病菌的分析检测【24】。靳连群等利用基因芯片技术检测肠道中沙门菌等致病菌。结果显示制备的基因芯片能够检测出致病菌，对于未知菌落利用基因芯片能够在3h完成对未知菌属的鉴定【25】。
3.4 荧光定量PCR 荧光定量PCR是近年发展起来并广泛应用于快速检测的技术方法，它克服了传统PCR容易污染、假阳性率高的缺点，具有灵敏度、特异性、重复性高、可定量等优点。荧光定量PCR能够同时完成多样品的扩增及定量，适宜大批样品的检测。钟伟军等【26】研究发现根据编码鼠伤寒沙门菌肠毒素stn基因的核酸序列设计1对引物和荧光探针，通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索，建立了检测沙门菌的核酸荧光定量PCR方法。该方法检测沙门菌结果均为阳性，而非沙门菌均为阴性。因而，它在食源性病原菌检测和传染病监测中具有巨大的优势。
3.5 环介导等温扩增方法 环介导等温扩增方法（LAMP）是一种新的核酸扩增方法，是利用Bst聚合酶进行自动的成环链置换及DNA合成。它与普通PCR不同在于一段不大于300bp的目的片段上设计6-8条特异性引物，因此具有很高的特异性和控制效率，而扩增过程只需在60-65℃反应60min。此反应产生的副产物焦磷酸镁是一种白色沉淀，因此反应结果可通过浊度来判断。Okamura等【27】用环介导等温扩增法（LAMP）检测O9沙门菌特异的插入成分片段。LAMP的检测限是103cfu/ml，比PCR106cfu/ml更敏感。
4．其他检测方法
4.1 噬菌体裂解试验 噬菌体对细菌有特殊的裂解作用，沙门菌噬菌体裂解试验，是作用于沙门菌属的特异性O-I噬菌体，在高浓度时可裂解绝大多数沙门菌，具有属的特异性。Thal-Kaling对1181株沙门菌和323株其它菌株进行沙门菌噬菌体O-I裂解试验，结果表明沙门菌裂解率为99.5%，而非沙门菌裂解率为0.3%。2.4.2 4-甲基伞形酮辛酯（MUCAP）试剂检测方法 该方法是中华人民共和国进出口检验行业标准（SN0332-94），其原理是利用沙门菌具有而其他各属细菌都不具备产生辛酯酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将其配制在相关的培养基中，根据沙门菌反应后出现的明显颜色变化，而确定待检可疑菌株。
小 结
沙门菌是污染食品，引起食源性疾病的重要病原菌。近年来，随着新的微生物检验方法和技术的不断涌现与创新，沙门菌的检测由传统的繁琐、费时、费力、敏感性和特异性低的缺陷，发展到目前的简单、快速、敏感、特异性强等的免疫学和生物学的检测方法。
1．国标法检测门氏菌，其程序复杂、耗时长，虽然经过许多学者的不断探索，改良为添加丙乙烯已二醇的方法或采用显色培养法等简化沙门菌的分离和鉴定的程序和时间，仍然很难适应当今突发公共卫生事件的应急处理，但国标沙门菌检测技术毕竞是沙门菌检验的基准方法。
2．免疫学检测方法具有简单、经济实用、重现性好、灵敏度高、特异性强等优点。但仅用于对大量样品进行筛选，对筛选出来的阳性样品需要用常规的培养方法进行确认。此法较适合于基层检测单位的应用，特别是ELISA应用较为普遍。随着国内外学者研究及探索的不断深入，SLISA技术在食品沙门菌检测中将发挥更为重要的作用。
3．分子生物学检测，特别是PCR技术的检测，具有操作简单、结果可靠、特异性强、灵敏度高等优点。但PCR法容易在操作过程中受到污染，产生假阳性的结果。因此，需要实验者要有较高的操作技能。同时，样品中的沙门菌含量一般会较低，以及样品中存在大量的PCR抑制物质，这都会影响PCR扩增的效果，导致出现假阴性的结果。
综上所述，无论是那一种检测方法，都存在着各自的优点和缺点。笔者认为，只有通过各种技术间的相互结合，相互补充，才能使各自的优点得到最大限度的发挥，才能使单一检测技术的不足得到弥补，也只有这样才能真正提高病原微生物的检测和研究能力。
为此，沙门菌快速、准确、灵敏度高、特异性强、简易、经济实用的检测技术是今后研究的主要方向。
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论文作者:冼桂江
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期
论文发表时间:2016/7/15
标签：沙门论文; 特异性论文; 方法论文; 免疫论文; 抗原论文; 滤膜论文; 荧光论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期论文;