（1桂林医学院附属医院 广西桂林 541001)
(2桂林医学院 广西桂林 541004）
【摘要】目的：探究毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion,CIR)损伤的保护作用机制。方法：40只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、毛蕊异黄酮5mg/kg组(Calycosin 5mg/kg组)、毛蕊异黄酮10mg/kg组(Calycosin 10mg/kg组)、毛蕊异黄酮20mg/kg组(Calycosin 20mg/kg组)。采用线栓法建立SD大鼠脑缺血再灌注模型，毛蕊异黄酮治疗组造模前14天开始腹腔注射给药，缺血2h再灌注24h后取脑。按照动物神经行为学评分（NDS）方法评价大鼠造模后神经功能的缺损程度，利用干湿重法计算大鼠脑含水量，使用Western Blot法测定大鼠缺血再灌注损伤模型半暗带区脑组织NF-kB表达含量。结果：缺血再灌注损伤模型组（I/R组）大鼠与假手术组（Sham组）相比，神经学评分和大鼠脑含水量显著提高，脑组织内 NF- kB含量显著升高。Calycosin 20mg/kg组与I/R组相比神经学评分显著降低，Calycosin 20mg/kg组、Calycosin 10mg/kg组的含水量与I/R组相比显著减轻；Calycosin 20mg/kg组、Calycosin 10mg/kg组和Calycosin 5mg/kg组与I/R组相比NF-kB表达显著减少。结论：毛蕊异黄酮可以降低脑组织NF-kB蛋白水平，减轻炎性损伤，在脑缺血再灌注损伤中发挥保护作用。
【关键词】毛蕊异黄酮；缺血再灌注；NF-kB通路；脑水肿率
【中图分类号】R743 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）35-0032-03
缺血性脑卒中是临床上的一种常见病、多发病，其发病率远高于出血性脑卒中及急性心梗，危重程度不亚于急性心梗，同样具有高死亡率及致残率的特点，其死亡率近年来呈显著上升的趋势，严重危害人类身心健康[1-3]。而缺血性脑卒中最重要的损伤机制之一就是脑缺血再灌注损伤，因此，本研究采用线栓法建立大鼠中动脉脑缺血再灌注模型，探索毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血2h再灌注后24h后脑缺血半暗带区的NF-kB蛋白表达影响，进而进一步探索毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。
1.材料与方法
1.1 实验药物
毛蕊异黄酮（中国药品生物制品检定所提供），用0.1mol/L二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide,DMSO，太仓市沪试剂有限公司提供）将其溶解。戊巴比妥纳液（武汉岗月医药化工有限公司）
1.2 动物
280±20g的3月龄SD雄性大鼠40只，SPF级，桂林医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（桂）2013-0006。动物由桂林医学院病理生理学实验室分笼饲养，保持动物昼夜节律（12h），控制室温（22±1℃），自由活动饮水摄食。
1.3 试剂
BCA蛋白定量试剂盒、Westernblot检测试剂盒均购自美国Invitrogen公司，兔抗鼠IgGh和GAPD抗体购自美国 Abcam公司。
1.4 仪器造模装置
由固定支架、操作器械、栓线及计时器等部分组成，其中手术器械包括麻醉和暴露颈总动脉物品及器械。
1.5 方法
1.5.1 体内实验 40只SD大鼠随机分为5组，假手术组（Shan组，未行特殊处理，n=8）；缺血再灌注组（I/R组，仅行缺血再灌注处理，n=8）；毛蕊异黄酮处理组（calycosin组，分为毛蕊异黄酮5mg/kg组、毛蕊异黄酮10mg/kg组、毛蕊异黄酮20mg/kg组，各组均为8只。造模前14天开始腹腔注射给药（毛蕊异黄酮），每日1次，缺血再灌注造模24h后快速断头取脑，剔除每组SD大鼠中未达到规定时相点死亡的样本。
1.5.2 动物术前 禁食12h，自由饮水，采用线栓法建立大鼠中动脉脑缺血再灌注模型。用1%的戊巴比妥纳液按40mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠无翻正反射后置于恒温台（37～37.5℃）上，保持呼吸通畅，常规消毒，于大鼠颈正中切口，逐层切开皮肤及皮下组织，直至打开右侧颈动脉鞘小心分离出颈总动脉和迷走神经，充分暴露出右侧颈总动脉，栓线径颈总动脉、颈内动脉直至大脑中动脉，稍遇阻力后停止操作，栓线插入深度约为18～20mm，计时使缺血2h后，将栓线从血管内拔出使脑组织缺血区恢复其血供造成再灌注24h，最后逐层缝合各层组织及皮肤，络合碘严格消毒，以青霉素肌注抗炎。
1.5.3 动物神经行为学评分（neurological dysfunction scores,NDS） 将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。采用改良的Bederson[4]评分方法进行神经功能评分，无神经功能缺失体征记0分；提尾时损伤左侧前肢屈曲记1分；前肢屈曲及左侧抵抗力下降记2分；向左侧转圈记3分；向左侧转圈伴意识障碍记4分；死亡则记5分（死亡的大鼠需要剔除），得分越高，表示动物神经功能损伤程度越大。
1.5.4 大鼠脑含水量计算 将苏醒后的实验动物放回生理学实验室分笼饲养，使其自由饮食，待大鼠脑缺血再灌注造模24h后，使用快速断头法取脑。并将右侧缺血大脑半球用滤纸吸去表面残血，在电子天平上称湿重，然后置于105℃烘箱烤至恒重，再秤大脑干重。脑组织含水量公式为：脑组织含水量（%）=（脑组织湿重-脑组织干重）／脑组织湿重×100%。
1.5.5 脑缺血半暗带区NF-kB含量的测定 大鼠脑缺血再灌注造模24h后，快速断头取脑缺血半暗带区组织，将各组实验的脑组织置于裂解液中在冰上裂解30分钟，12000r/min，4℃离心15分钟，取上清液，测定蛋白浓度后行 SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h，加入单克隆抗体，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1h，洗膜，加入ECL发光液，显色，UVP凝胶成像系统成像记录，利用Image J进行图像灰度值处理。
2.结果
2.1 大鼠CIR损伤后生理反应
CIR损伤后大鼠全部存活，麻药过后大鼠恢复意识，可有不同程度的行为障碍，而Sham组大鼠未见明显意识障碍，活动无异常，说明本实验复制的大鼠脑缺血再灌注模型基本成功。
2.2 毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经评分的影响见
Sham组大鼠苏醒后神经功能评分均为0分，无明显神经功能缺陷表现。各组大鼠的神经功能评分比较后发现，与sham组相比，I/R组神经功能缺陷程度较重（P＜0.01），calycosin组与I/R组相比神经功能缺陷程度较轻（P＜0.01或P＜0.05），详情见表1。
表1 神经生理功能评价计分结果 （x-±s，n=8）
2.4 毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注NF-kB表达水平的影响
与Sham组相比，I/R组的NF-kB的表达上调（P＜0.01），与I/R组相比，Calycosin组能显著下调NF-kB的表达（P＜0.01）详情见表3及图1。
表3 各组大鼠脑组织NF-kB表达水平
图1胶片
3.讨论
脑缺血再灌注损伤机制十分复杂，至今为止，仍是研究的热点，是由机体内多种损伤机制同时参与的一种病理生理过程[5]，其中炎性反应在脑缺血再灌注损伤过程中起着不可或缺的作用[6-8]。因此可以从抑制炎性反应方面来探究脑缺血再灌注的损伤机制。黄芪是一种具有悠久历史及广泛临床应用的中草药，黄芪总黄酮是从黄芪分离出来的一种主要活性成分，而毛蕊异黄酮就是黄芪总黄酮的其中一种，具有多种生物学效应，同时研究表明毛蕊异黄酮可以通过减轻脑缺血半暗带区氧自由基的破坏作用，改善脑缺血再灌注损伤[9]。 但目前关于毛蕊异黄酮在脑缺血再灌注损伤研究中，关于减轻炎症损伤机制的基础研究仍十分有限。
NF-kB蛋白是广泛存在所有细胞的转录因子，在生理状态下，发挥着重要的生理作用，同时参与炎性反应等病理生理过程，一些抗炎药物就是通过抑制NF-kB蛋白的活化达到减轻炎性反应作用[10-11]。
本研究通过Western Blot法检测大鼠脑缺血半暗带区中NF-kB的表达水平，探讨毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。结果显示，I/R组大鼠再灌注24h后脑缺血半暗带区 NF-kB表达水平显著增加，NF-kB参与调节炎性反应，炎性反应加重脑缺血再灌注的损伤，可直接损伤神经细胞，导致神经细胞的死亡[6]，同时高表达的NF-kB还可以通过凋亡途径中的重要途径之一的死亡受体途径导致神经细胞的凋亡，这是脑缺血再灌注损伤的重要途径之一[5]。造模前14天予毛蕊异黄酮组腹腔注射给药，缺血再灌注24h后大鼠脑缺血半暗带区NF-kB表达显著下调，说明毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的脑组织NF-kB的表达有抑制作用，毛蕊异黄酮可能通过抑制大鼠脑组织NF-kB表达，下调脑组织的炎性反应，进而在神经保护中发挥作用。脑水肿是中枢神经系统应对各种脑缺血损伤的重要病理过程，包括脑内小胶质细胞的激活、炎症细胞的浸润、粘附分子的表达等病理过程，进而形成水肿、缺血、炎症反应[12]，是导致中枢神经系统损害的重要病理过程，其中炎性反应在脑水肿的形成中扮演着重要的角色。因此在本研究中，毛蕊异黄酮组脑含水量较I/R组相比显著减少，可能是由于毛蕊异黄酮通过下调脑组织NF-kB的表达，减轻炎性反应，进而减轻大鼠缺血再灌注的脑水肿。
本研究结果提示，毛蕊异黄酮可能通过下调大鼠脑缺血再灌注损伤中NF-kB的表达，拮抗缺血脑组织中炎性反应，从而减轻脑水肿，进而在大鼠脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用，最终表现为大鼠神经学评分下降。本研究为今后研究毛蕊异黄酮对脑缺血再灌注损伤机制提供了一定的实验基础，可进一步探讨脑缺血半暗带区NF-kB下游炎性因子表达。
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论文作者:王文波1,谭洁2,彭志柱2,肖晶2,王勇2
论文发表刊物:《心理医生》2018年35期
论文发表时间:2019/1/4
标签：异黄酮论文; 大鼠论文; 损伤论文; 脑缺血论文; 组织论文; 作用论文; 含水量论文; 《心理医生》2018年35期 论文;