大庆市人民医院 163311
【摘 要】目的：检测P300/CBP蛋白在肝癌组织中的表达情况，并对其相关的分子机制进行研究。方法：临床上收集30例原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）患者的癌及癌旁组织，运用Western blot和免疫组化技术检测人肝癌组织中的P300/CBP、NF-kB、Acetyl-NF kB P65（Lys314/Lys315）表达和总蛋白乙酰化水平的改变。结果：与癌旁组织相比较，P300/CBP蛋白在HCC癌组织中高表达（P<0.05），相关下游蛋白NF-kB和总蛋白的乙酰化水平显著下降（P<0.05）。结论：HCC癌组织和癌旁组织中，P300/CBP蛋白的表达显著升高，通过对相关下游蛋白乙酰化水平的调控，激活相关信号通路，调控癌细胞的增殖、分化和凋亡，对HCC相关分子机制的研究和临床HCC的治疗提供相关的理论依据。
【关键词】原发性肝癌；P300/CBP；NF-kB；Acetyl-NF kB P65（Lys314/Lys315）
[Abstract] Objective To study the expression of P300/CBP protein and its molecular mechanism in hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods The expression of P300/CBP，NF-kB，Acetyl-NF kB P65（Lys314/Lys315）and total protein acetylation were detected by Western blot and immunohistochemistry in 30 patients with primary hepatocellular carcinoma（HCC）.Result Compared with the adjacent tissues，P300/CBP protein was highly expressed in HCC cancer tissue（P < 0.05），and the acetylation level of Acetyl-NF kB P65（Lys314/Lys315）and total protein were significantly decreased（P < 0.05）.Conclusion The expression of P300/CBP protein in HCC cancer tissues and adjacent tissues is significantly increased.By regulating the acetylation level of related downstream proteins and related signaling pathways to regulate the proliferation，differentiation and apoptosis of cancer cells.This study provides relevant theoretical basis for the study of molecular mechanisms related to HCC and clinical treatment of HCC.
[key words] hepatocellular carcinoma；P300/CBP；NF-kB；Acetyl-NF kB P65（Lys314/Lys315）
背景：原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上第5大常见恶性肿瘤，发病率和死亡率高，占常见恶性肿瘤引起死亡原因，仅次于胃癌和食道癌的第3位[1]。每年大约有超过70万新发诊断病例[2]。目前，癌症的治疗仍以手术、放疗、化疗等三大治疗手段为主[3]，其疗效尚未有突破性地进展，难以达到癌症完全根治的目的，与癌症发生发展的相关分子机制尚未完全明确。
相关研究发现P300/CBP在肝癌组织中高表达与肝癌细胞的增殖、分化和凋亡有关，但其如何通过调节细胞内相关蛋白的乙酰化水平，参与肝癌细胞增殖调节的相关分子机制尚未明确。本研究旨在通过研究P300/CBP在肝癌组织中的表达水平，及其对核转录因子NF-kB乙酰化水平的表达水平调控情况，揭示其在肝癌发生发展的相关分子机制，为肝癌临床研究和治疗提供相关的理论基础。
材料和方法
1、人肝癌组织标本的获取及处理
经过医院相关医学伦理部门的批准，在哈尔滨医科大学附属第五临床医学院病理科，收集2016-2018年原发性肝癌和癌旁组织标本30例，一部分组织冻存于-80℃冰箱，用于Western blot；另一部分组织用10%Formalin 固定液固定，经脱水、石蜡包埋后，制作6μm切片，用于HE染色和免疫组化。
2、相关材料
Western blot和免疫组化相关抗体：P300/CBP、NF-kB、Acetyl NF kB P65（Lys314/Lys315）和Anti-Acetylated Lysine均购于北京博奥森生物科技有限公司，SDS-PAGE相关试剂购于碧云天生物科技有限公司，免疫组化S-P试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。
3、Western blot 取一定量的肝脏组织于匀浆器中，加入适量RIPA裂解液，于冰浴上匀浆，12000xg，4℃离心10mins，取上清于冰箱中冻存备用；去一定量的蛋白液用于BCA法蛋白浓度测定及Western blot。取等量的蛋白液与蛋白上样缓冲液混合后，100℃加热变性5min，进行SDS-PAGE电泳及转膜，一抗于4℃冰箱孵育过夜，HRP标记的二抗室温孵育1hour，ECL化学发光试剂显影。
4、免疫组化 将固定好的肝脏组织经过脱蜡、脱水和石蜡包埋后，进行切片，免疫组化S-P法的相关操作步骤进行操作，加3%双氧水处理5min灭活内源性的过氧化物酶和抗原修复后，一抗于4℃冰箱孵育过夜，二抗37℃孵育30min，加入DAB显色液在显微镜下显色，脱水封片后进行光镜下拍照和相关数据分析。
5、统计分析 采用GraphPad Prism 5统计软件进行数据分析，采用t检验和卡方检验，以差异P<0.05为具有统计学意义。
结果
肝癌组织中P300/CBP蛋白表达明显增加，通过增加下游NF-kB蛋白的乙酰化水平，活化NF-kB通路，促进肿瘤的发生发展。通过Western blot实验对HCC患者癌和癌旁组织的蛋白质表达情况进行分析，我们的研究发现，与癌旁组织相比较，肝癌组织内的P300/CBP蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；同时P300/CBP下游NF-kB蛋白和组织总蛋白的乙酰化水平显著增加（P<0.05），活化NF-kB信号通路（图1）。我们通过免疫组织化学实验，也证明了P300/CBP的表达增加，促进细胞核内NF-kB蛋白的乙酰化，增加其活性，促进肝癌细胞的发生（图2）。
图2 肝癌组织内P300/CBP和Acetyl-NF-kB蛋白的表达水平及亚细胞定位。A、B图分别为免疫组织化学相关结果和数据统计图。Ca：Cancer tissue；NT：Nomal tissue。
讨论
随着科技的飞速发展，人们生活水平的提高，癌症预防知识的普及，肝癌的早期诊断、手术切除率和生产率得到了很大的改善，人们对肝癌的发生发展机制得到了更深的认识。相关研究发现，病毒性肝炎与原发性肝癌的发生有着特定的关系，目前比较明确的病毒性肝炎有乙型、丙型和丁型3种，肝癌与乙型肝炎的关系最为密切[4]。在我国，肝癌患者中约90%有乙型肝炎病毒（HBV）感染背景，肝炎病毒导致炎症、纤维化和肝硬化，最后导致肝癌的发生。日常生活中除了HBV外，诱发肝癌的因素还包括很多，例如：酒精性肝硬化、肝腺瘤、长期摄入黄曲霉素、Wilson病、酪氨酸血症和糖原累积病等。
P300/CBP就是组蛋白乙酰化转移酶（HATs）家族中的一员，p300/CBP作为转录因子和组蛋白乙酰转移酶参与许多细胞过程包括增殖、细胞周期调控、细胞凋亡、分化等[5-8]。p300/CBP还可以以多种非组蛋白为底物形成复合物进行乙酰化反应，如转录因子p53、NF-KB、c-jun等，参与调控相关信号传导通路的活性，在肿瘤、代谢性疾病、心血管疾病等疾病的发病中扮演着重要的角色[9-11]。相关研究发现，ATGL的表达通过PARP-α/p300调节P53蛋白的乙酰化来调控肝癌细胞的糖酵解活动[12]。P300通过非经典途径（调控SMAD2/3和TAZ在细胞质-细胞核之间的转移）和经典途径（组蛋白的乙酰化调控）促进TGF-β刺激肝脏星状细胞的活化，同时P300蛋白的失活抑制了相关肿瘤促进因子相关基因的编码[13]。由此可见，P300蛋白在肝癌细胞中调节发挥着至关重要的作用，抑制P300蛋白的活性或者降低P300基因和蛋白的表达有望成为治疗肝癌的一个新靶点。
研究发现，在肝癌中NF-κB通路活化，促进肝癌的发生和转移，P28（GANK）蛋白与P300相互结合，减少了由TNF-α诱导的Rel与NF-κB的结合，同时减少Rel蛋白310位赖氨酸的乙酰化，减少相关促癌基因Fas和FasL的表达[14]。抑癌蛋白menin也可与NF-κB蛋白相互结合，促进sirt1与P65蛋白结合，减少P65蛋白310位赖氨酸的乙酰化，抑制肿瘤的生长。我们的研究发现，在肝癌组织中P300/CBP蛋白的表达增加，同时增加其下游蛋白NF-kB的乙酰化水平，活化NF-kB蛋白的活性，激活NF-kB通路。NF-kB通路的活化促进相关炎症因子及凋亡蛋白的表达，控制肝癌细胞的发生、发展。但他们之间的相关分子机制尚未明确，值得我们去进一步研究。
综上所述，在肝癌组织中P300/CBP蛋白的高表达，与其下游相关蛋白的乙酰化水平的增加和相关信号通路的活化存在一定的相关性，可以用于对肝癌发生、发展相关分子机制的研究，为肝癌临床研究和治疗提供相关的理论基础。
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论文作者:王广志,赛凤英,姜楠,张凤侠,卢巍,刘杨,王宏志
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2019年3月上第5期
论文发表时间:2019/7/19
标签：肝癌论文; 蛋白论文; 乙酰论文; 组织论文; 水平论文; 细胞论文; 原发性论文; 《中国医学人文》(学术版)2019年3月上第5期论文;