孙平[1]2004年在《血管抑素基因转染及联合化疗治疗人卵巢癌裸鼠移植瘤的实验研究》文中认为目的: 1.研究血管抑素Angiostatin基因对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相关机理。 2.研究血管抑素基因联合化疗药物顺铂对人卵巢癌细胞SKOV3诱导的裸鼠腹腔肿瘤和腹水的抑制作用及其相关机理。 方法: 使用BALB/C遗传背景的雌性裸小鼠作为实验动物,4-5周龄,按SPF级饲养。人卵巢上皮癌细胞株SKOV3用含有10%小牛血清的RPMI medium 1640在37℃、5%CO_2条件下培养。收集肿瘤细胞,调整细胞悬液浓度。于裸鼠背部皮下注射细胞悬液0.2ml(细胞总数约为5×10~6个),裸鼠腹腔内注射细胞悬液0.2ml(细胞总数约为1×10~7个),建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤和腹水瘤动物模型。血管抑素基因真核表达质粒采用分子生物学方法大量制备,转染细胞时以阳离子脂质体DOTAP作为介导。 皮下移植瘤实验:将荷瘤裸鼠随机分为空白对照组、空质粒组和基因治疗组,待肿瘤生长至直径约0.4cm时,分别向瘤体内注射无菌生理盐水、空质粒pcDNA3、Angiostatin/pcDNA3。观察各组裸鼠的肿瘤生长曲线,21天后取肿瘤标本作免疫组织化学检查(SABC法)及蛋白质印迹(Western Blotting)检查,检测各组肿瘤组织中Angiostatin、VEGF的表达和微血管密度(MVD),利用TUNEL染色法行原位细胞凋亡分析。
孙平, 孔北华[2]2008年在《血管抑素基因转染联合化疗药物对人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的治疗作用》文中研究表明目的研究血管抑素(angiostatin)基因转染联合化疗药物顺铂对人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的协同治疗作用及其相关机制。方法使用人卵巢癌细胞株SKOV3建立人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型。将荷瘤裸鼠随机分为4组,分别注射空质粒PcDNA3、angiostatin/PcDNA3、化疗药物顺铂、angiostatin/PcDNA3+顺铂,质粒用脂质体DOTAP介导转染细胞。观察各组动物的腹水量及腹腔荷瘤量,检测各组肿瘤组织中angiostatin的表达和微血管密度,利用TUNEL染色法行原位细胞凋亡分析。结果联合治疗组裸鼠的腹水量(P<0.01)及腹腔瘤负荷(P<0.005)均显着低于其他实验组;肿瘤组织中angiostatin蛋白局部高表达,微血管密度显着低于其他实验组(P<0.01),细胞凋亡指数显着高于其他实验组(P<0.05)。结论Angiostatin基因联合化疗治疗人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤可以产生协同抑制作用,多途径联合用药是提高疗效的有效方法之一。
何小平[3]2006年在《重组人Canstatin蛋白及溶瘤腺病毒He-Cans治疗胰腺癌的实验研究》文中提出本课题旨在将抗血管生成治疗与基因治疗相结合,探讨胰腺癌治疗新策略。首先利用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从人胎盘组织扩增出新的血管生成抑制剂基因canstatin,插入质粒pET-22b(+)构建原核表达载体pET/canstatin,转化大肠杆菌,在IPTG诱导下表达出重组人Canstatin蛋白,体内实验证实其能通过抑制血管生成有效抑制胰腺癌生长。继而,将canstatin基因插入载体pCA13和pXC7C,构建出穿梭载体pCA13-Cans和pXC7C-Cans,再分别与pBGHE3共转染293细胞,获得重组非增殖型腺病毒Ad5-Cans和增殖型腺病毒(溶瘤病毒)He-Cans。体内外实验证实,溶瘤病毒He-Cans能有效抑制胰腺癌生长,疗效强于Ad5-Cans和Canstatin蛋白,且副作用少,具有良好临床应用前景。其作用机制主要是:①表达Canstatin蛋白,抑制肿瘤新生血管形成;②在肿瘤细胞中特异性增殖并裂解肿瘤细胞,从而发挥溶瘤作用。
胡晓霞[4]2005年在《基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究》文中认为卵巢癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,它的5 年存活率低。侵袭和转移是卵巢癌重要的生物学特征,是引起卵巢癌患者死亡的主要原因。基质金属蛋白酶(MMP)通过降解细胞外基质(ECM)在肿瘤的侵袭和转移中起了关键性的作用。而基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)可抑制MMPs 的活性,MMPs 和TIMPs 的平衡失衡可导致肿瘤浸润和转移。本研究的目的是探讨基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢癌中的表达及与卵巢癌侵袭转移的关系,同时探讨反义核酸及RNA 干扰技术对MMP-9 基因的抑制作用及对卵巢癌细胞生物学行为的影响,并探讨使用RNAi 作为一种新的基因治疗的方法。应用RT-PCR 方法检测48 例卵巢癌、21 例良性卵巢肿瘤及22 例正常卵巢组织中MMP-9、2、7 及TIMP-1、2、3 mRNA 的表达情况,进行阳性率及半定量的比较,将结果与临床及病理资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox 回归模型分析。结果显示MMP-9 阳性表达率和MMP-9、MMP-2 半定量值在卵巢恶性肿瘤组织中明显高于正常卵巢组织(P<0.05);TIMP-2、MMP-7、TIMP-3 在卵巢恶性及良性肿瘤组织中的阳性表达率及半定量值明显高于正常卵巢组织,MMP-9/TIMP-1 在卵巢恶性肿瘤组织中的比值(0.91±0.67)明显高于正常卵巢组织(0.15±0.34);MMP-9 表达水平与卵巢恶性肿瘤的手术病理分期及预后有关,在Ⅲ-Ⅳ期患者中的表达(1.13±0.66)显着高于Ⅰ-Ⅱ期(0.60±0.54)患者(P<0.05),其阳性患者中位生存时间为43.00±17.12 个月,其累积生存率为47.37%,明显低于MMP-9 阴性者(100%)。经Cox 模型多因素生存分析,MMP-9、MMP-2、TIMP-2及残余灶大小可作为卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。研究结果提示MMP-9、MMP-2、MMP-7、TIMP-2、TIMP-3 基因在卵巢恶性肿瘤组织中的表达增加。MMP-9的高表达及MMP-9与TIMP-1 的平衡失调在晚期卵巢癌的发展中起重要作用,MMP-9 有可能作为监测晚期卵巢癌患者预后的一个指标。利用人卵巢癌组织进行RT-PCR扩增TIMP-1基因cDNA,获目的片段(631bp)连接至pcDNA4载体,转化大肠杆菌TOP10筛选阳性克隆并鉴定,并对克隆的全长片段进行DNA序列测定,构建人基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)真核表达重组质粒。利用聚合酶
王素梅[5]2008年在《组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究》文中研究表明卵巢恶性肿瘤是最常见的女性恶性肿瘤之一,5年存活率低,侵袭和转移是卵巢恶性肿瘤重要的生物学特征,是引起卵巢恶性肿瘤患者死亡的主要原因。组织蛋白酶通过降解细胞外基质(ECM),从而在肿瘤的侵袭和转移中起关键性的作用。组织蛋白酶抑制剂可抑制组织蛋白酶的活性,组织蛋白酶及其抑制剂的平衡失调可促进肿瘤的侵袭和转移。本研究的目的是探讨组织蛋白酶及其抑制剂在卵巢恶性肿瘤中的表达及与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,探讨血清中组织蛋白酶L(CTSL)及其组织抑制剂(CC)对卵巢恶性肿瘤的诊断意义,并通过体外实验进一步探讨CTSL与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系,从而寻找卵巢恶性肿瘤基因治疗的方法。组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值目的:探讨组织蛋白酶及其组织抑制剂在卵巢组织中的表达及临床价值。方法:应用RT-PCR方法检测47例卵巢恶性肿瘤患者,20例卵巢良性肿瘤患者,21例正常卵巢组织中CTSB、CTSL、CTSD、CC的mRNA表达,进行阳性率和半定量的比较,并分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理的关系。结果:CTSB、CTSL、CC在卵巢恶性肿瘤组织中的半定量明显高于卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织(p＜0.05);CTSD在叁组之间的表达无统计学意义(p＞0.05);CTSB的表达与腹水量和组织学类型有关(p＜0.05);CTSL的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移有关(p＜0.05);CC的表达与病理分级、肝转移和大网膜转移有关(p＜0.05);CTSD的表达与肝转移和腹水量的多少有关(p＜0.05);单因素生存分析CTSL阳性率与患者的预后相关(p＜0.05),Cox比例风险回归模型分析CTSL阳性率是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:卵巢恶性肿瘤中CTSB、CTSL、CC表达增高,并与卵巢恶性肿瘤转移有关,有可能成为卵巢恶性肿瘤预测转移和预后的指标。血清CTSL及CC含量测定在卵巢恶性肿瘤中的临床价值目的:探讨CTSL及CC在卵巢恶性肿瘤患者血清中的含量及其临床意义。方法:采用ELISA方法检测64例卵巢恶性肿瘤、23例卵巢良性肿瘤及20例正常对照血清中CTSL及CC的含量,并对其中17例初诊卵巢恶性肿瘤手术患者进行术前、术后血清CTSL和CC含量的动态观察,将结果与临床资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox比例风险回归模型分析。结果:卵巢恶性肿瘤患者血清中CTSL及CC的含量显着高于良性组及正常对照组,差异有统计学意义(p＜0.05);同一患者术前、术后血清CTSL的含量差异有统计学意义(p＜0.05);复发患者的血清中CTSL及CC含量高于未复发患者(p＜0.05);在卵巢恶性肿瘤患者术前血清中,CTSL的含量与肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移及残余灶的大小有关(p＜0.05);CC的含量与淋巴结转移有关(p＜0.05);血清CTSL、CC与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。血清CTSL对卵巢恶性肿瘤诊断的敏感性为72.7%,特异性为76.7%,阳性预测值为70.58%和阴性预测值为76.7%,准确率75.0%。单因素生存分析CTSL的含量与患者的预后相关(p＜0.05),Cox比例风险回归模型分析显示残余灶大小是卵巢恶性肿瘤的独立预后因素。结论:血清CTSL含量在卵巢恶性肿瘤中异常升高,血清CTSL水平有可能作为诊断卵巢恶性肿瘤,判断有无复发及转移的生物学指标。CTSL基因真核表达质粒的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的真核表达质粒并进行表达鉴定。方法:采用RT-PCR技术从人卵巢恶性肿瘤组织总RNA中逆转录CTSL基因的ORF全长,克隆到PMD18-T载体上;亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和Western-blot检测CTSL基因mRNA和蛋白表达。结果:RT-PCR扩增CTSL ORF全长,成功克隆入PMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1质粒,重组阳性克隆经双酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正向插入pcDNA3.1质粒。RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达。结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌细胞中的作用提供了实验基础。CTSL基因介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:通过体外实验研究CTSL基因与卵巢恶性肿瘤侵袭转移的关系。方法:CTSL基因的真核表达质粒转染卵巢癌细胞HO8910,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因转染成功。通过测定细胞生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因转染后对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系HO8910-CTSL和HO8910-pcDNA3.1。细胞生物学实验显示:CTSL基因可促进卵巢癌细胞的侵袭转移,但是对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:体外实验进一步证明CTSL基因与卵巢恶性肿瘤的侵袭转移有关。CTSL基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定目的:构建CTSL基因的siRNA真核表达载体并鉴定。方法:根据GenBank数据库提供的CTSL基因核苷酸序列,设计并化学合成4对双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),瞬时转染卵巢癌细胞系A2780细胞,通过RT-PCR检测其对CTSL基因的沉默效果,从中筛选一对沉默效果最好的siRNA序列。并根据psilencer4.1载体插入片段设计要求,设计带有BamH1、HindⅢ粘性末端且能表达shRNA的寡核苷酸碱基对序列,退火后与psilencer4.1-CMV neo载体定向连接,测序进行鉴定,并通过RT-PCR验证其干扰效果。结果:成功构建CTSL的siRNA表达载体psilencer4.1-CMV neo-CTSL,经DNA测序证实与设计完全一致,并通过RT-PCR证明psilencer4.1-CMV neo-CTSL载体可沉默该基因。结论:成功构建了CTSL基因的siRNA真核表达载体,为下一步探讨CTSL基因对肿瘤细胞的作用奠定了基础。RNAi抑制CTSL介导的卵巢上皮癌细胞系侵袭转移的体外实验研究目的:研究RNA干扰CTSL基因对卵巢癌细胞侵袭转移的影响。方法:CTSL基因的siRNA表达载体转染卵巢癌细胞A2780,G418筛选,获得稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-blot技术证实CTSL基因干扰成功。通过测定转染细胞的生长曲线、克隆形成实验、细胞生长周期、细胞侵袭实验、细胞迁移实验和细胞黏附实验等了解CTSL基因干扰对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:通过筛选建立了稳定转染细胞系A2780-CTSL、A2780-Control、A2780-psilencer,RT-PCR和Western-blot技术证实其能够沉默CTSL基因表达。细胞生物学实验显示:沉默CTSL基因后可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,但对卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和黏附性影响不大。结论:RNA干扰CTSL基因可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移,有可能成为卵巢恶性肿瘤基因治疗的新方法。
参考文献：
[1]. 血管抑素基因转染及联合化疗治疗人卵巢癌裸鼠移植瘤的实验研究[D]. 孙平. 山东大学. 2004
[2]. 血管抑素基因转染联合化疗药物对人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的治疗作用[J]. 孙平, 孔北华. 中国医学科学院学报. 2008
[3]. 重组人Canstatin蛋白及溶瘤腺病毒He-Cans治疗胰腺癌的实验研究[D]. 何小平. 第二军医大学. 2006
[4]. 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 胡晓霞. 广西医科大学. 2005
[5]. 组织蛋白酶及其组织抑制剂与卵巢癌浸润转移关系的研究[D]. 王素梅. 广西医科大学. 2008
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