（1广东药科大学附属第一医院 广东 广州 510080）（2广东省代谢病中西医结合研究中心 广东 广州 510080）
【摘要】血管紧张素（Angiotensin，Ang）是一组多肽化合物家族，它们在调控血压和心血管重构等生理病理过程中起重要作用，是心血管领域研究的热点之一。液相色谱质谱联用技术（LC-MS）是近年来兴起的一种组学分析技术，它以高通量、高灵敏度、高特异性的优势被广泛应用于分析生物基质中蛋白质、多肽等生物大分子方面的研究。其中，也包括在血液、尿液等生物样本中血管紧张素及其代谢组分的检测。探讨生物样本中血管紧张素代谢组份的LC-MS检测过程中的样本采集和前处理、色谱质谱系统的选择、参数的优化等方法策略对该项技术的进一步推广及应用具有重要意义。
【关键词】液相色谱质谱联用技术；血管紧张素；样品前处理
【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）15-0011-03
血管紧张素（Angiotensin，Ang）是广泛存在于人体及哺乳动物体内的一类具有生物活性的多肽类化合物家族，它们在调控血压和心血管重构等生理病理过程中起重要作用，是心血管领域研究的热点之一[1]。
血管紧张素的代谢物广泛分布于各类生物组织和体液内，例如血清、尿液、血管及心肾等组织器官。其在生物样本中的丰度差异大，含量较低[2]。检测生物样本中的血管紧张素主要有免疫法和液相色谱-质谱法（LC-MS）[3]。免疫法具有灵敏度高，前处理简便，耗时短的优点，但也有检测通量低、容易发生血管紧张素代谢物之间的交叉免疫反应而准确性[4]、线性定量范围很窄等缺点。LC-MS是近年来发展起来的一种分析方法，由于LC-MS的定性与定量检测依赖于多肽本身的化学性质和氨基酸物理结构信息，精确度和灵敏性较高；LC-MS可以一次分析单个样品中的多个化合物组份，是一种高通量检测方法，特别适合用于生物样本中血管紧张素的组学研究。然而，该项检测在生物样本的采集与前处理，系统的选择与参数调试方面也有许多特殊之处，本文结合近年来的研究，就这些问题的进展作一综述，为该项技术的进一步推广应用提供参考。
1.生物样本的采集及前处理
生物样本基质非常复杂，血管紧张素通常在生物样本中的丰度低，分解代谢速率快，需要及时终止血管紧张素的代谢进程。在进行LC-MS进行定性定量分析前需要优化一系列前处理来减少对色谱质谱系统的干扰，同时尽量避免低丰度的血管紧张素肽在前处理中的损失，增加检测的准确性和可靠性。生物样品的前处理操作是LC-MS定量分析其中血管紧张素的关键因素也是技术难点。
1.1 样本采集
样本中含有各种血管紧张素代谢酶影响样本中血管紧张素组分实际含量的准确检测。实现代谢的终止需要抑制或破坏相关蛋白酶的活性，主要有两种途径：物理方式—降温和脱水干燥；化学方式—添加酶蛋白抑制剂。例如，Bujak和Olszanecki将细胞培养上清在采集终点迅速放置于-70℃冰箱速冻，而组织则通过60℃烘干[5-6]，通过低温和脱水抑制酶的活性、破坏反应环境来中止血管紧张素的进一步代谢。冷冻和干燥方法成本较低、方便快捷，适合大量样本的处理，但存在酶活性抑制不够彻底的问题，同时热干燥法产生的高温也会破坏血管紧张素的稳定性。添加蛋白酶抑制剂可以有针对性地抑制酶的活性，例如，Olkowicz等在收集大鼠血清时加入EDTA、邻二氮杂菲等蛋白酶抑制混合物[7]。Lortie等采用预包被焦亚硫酸钠、膦酰二肽、甘氨酸的毛细玻璃管作为采血工具[2]，使得样本在采集的第一时间就可以与蛋白酶抑制剂反应。但是血管紧张素代谢的相关蛋白酶种类繁多，抑制剂不能完全抑制所有蛋白酶的活性，因此在样本采集处理中常需要综合两种方法[8]。
1.2 样本前处理
1.2.1去除大分子蛋白 常用方法有超滤法和化学沉淀法。化学沉淀法通常使用非极性溶剂如乙腈、甲醇等与样本充分混合，蛋白在此条件下变性被沉淀分离[7]。这种方法快捷并且经济，不需要特殊装置，适合大量样本的处理。但是需要大量有毒溶剂。超滤法是通过超滤装置，使大分子蛋白被超滤膜截留，而分子量1kDa左右的血管紧张素则选择性地被分离出来作后续操作。不过此方法使用超滤管，增加了成本，且有报道称超滤步骤会降低血管紧张素肽的回收率[2]。因此不同的样本基质在选择去除蛋白的方式前需要充分评估回收率，以满足后续质谱的检测要求。
1.2.2萃取富集除盐 萃取步骤可以富集血管紧张素组份，减少其他分子干扰，提升灵敏度，并且减少仪器的损害。相比渗透法和液液萃取法，固相萃取更为简便、少环境污染和化学试剂耗费。常用的固相萃取装置为C18材质的反相色谱柱[9, 10]，Olkowicz和Cui L等采用Sep-Pak C18填料的SPE进行萃取，证明其回收率均可达到75%～90%[7，11]。在固相萃取基础上，有学者通过包被制作的固相血管紧张素抗体对洗脱液中的血管紧张素成分进行二次纯化，在质谱上获得了极其优良的信噪比，显著减轻了血清在质谱上的基质干扰效应[12]。固相萃取柱成本高；针对不同的样本基质和检测物质需要开发相应的方法，比较耗时；操作步骤较为繁琐，对使用者要求较高等，不适合大量样本的处理。
2 液相色谱质谱系统
2.1 原理
液相色谱质谱联用技术基于两级仪器系统，前级是液相色谱仪，用于样品中血管紧张素代谢组份的捕捉和分离，样本通过液相泵以一定流速抽入色谱系统后，目标物被吸附在色谱柱的填料上，随后通过色谱柱流动相中有机相与水相比例的变化，不同极性的血管紧张素代谢成分被梯度洗脱，依次进入离子源，血管紧张素在高压电场作用下完成离子化过程，进入质谱分析器，不同质荷比（m/z）的带电粒子在特定电场下以一定运动形式被质量分析器捕捉分析，经过电信号转换，形成质谱响应值，通过数据的分析与整理，完成血管紧张素组份的定性与定量检测。
2.2 色谱
超高效液相色谱和纳升液相色谱相比常规液相系统可以较小的样本量在较短时间内完成分析，在复杂的生物样本中有效地分离各个组分，提升了分析的灵敏度。
早期对血管紧张素组份进行分析使用的是常规反相色谱柱，如Bujak等使用HPLC搭配反相C18色谱柱对血清及组织内的血管紧张素进行了有效的分离[6]。近期使用的是柱径更小的反相C18色谱柱，它上样体积更小，却可获得更为优良的分离度和灵敏度[13]。Olkowicz等人将大鼠血清前处理后使用二维色谱系统，nano-LC搭配C18捕获柱（2cm×75μm,粒径3μm,孔径100?），C18分析柱（150mm×75μm,粒径2μm,孔径100?），25min完成各个组分的有效分离，发现，相比单独使用分析柱，血管紧张素的检出限得到较大提升[7]。二维色谱的优势在于通过第一级色谱柱可以起到对样品进行净化和富集作用，减少了色谱系统的干扰，配合微流控技术可以显著提升检测的灵敏度。
可见二维纳升液相色谱结合超高效液相分析技术最适合复杂生物样本中低丰度的生物样本中血管紧张素多组分检测，整体节约了分析时间和宝贵的样本，同时提升了检测的分离度和灵敏度。
2.3 质谱
质谱电离方式主要有两类：电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）。分析多样化体现在质谱的质量分析器上，常用的有四极杆分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器。以及不同分析器经过串联技术形成的串联质谱仪（MS/MS），如三重四极杆质谱、四极杆飞行时间质谱、四极杆离子阱质谱，串联质谱技术旨在通过结合不同质谱检测器，优势互补，增强串级功能，获取丰富的物质结构信息，提高检测的准确度和灵敏度。
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2.3.1三重四极杆质谱 四级杆质谱相比其他类型质谱在定量方面具有一定优势，通过串联四极杆质谱形成三重四极杆质谱，在优良定量基础上获得定性能力的优化。结合靶向技术可以对特定的血管紧张素代谢物实现高灵敏度的精准分析，这其中广泛被应用的有选择反应监测技术（Selected reaction monitoring,SRM）以及多重反应检测技术（Multiple reaction monitoring,MRM）。三重四级杆质谱仪结合靶向检测技术在生物样本中检测特定的血管紧张素代谢物的灵敏度已经达到fmol级别[7]。Waters-Micromass Quattro micro三重四极杆质谱的单一离子检测模式（SIR）和二级MRM模式，质荷比相差3m/z的同位素内标和目标肽达到良好线性相关，表明三重四级杆的分辨率已经可以满足血管紧张素代谢组分检测的较高要求[11]。
2.3.2离子阱质谱 离子阱质谱可以多级串联，擅长定性分析，新型的离子阱分离和检测器搭配串联质谱技术使得仪器的分辨率得到大幅度提升。早期的学者使用LCQ三维离子阱质谱搭配ESI源，SIR模式，对生物样本中血管紧张素代谢进行了大量的研究工作[9]。由于三维离子阱质谱的离子容量有限，其动态范围常因此受限制，同时其串级能力不强，SIR模式容易受到复杂生物基质中类似质荷比物质的干扰，因此对前处理操作要求较高。Orbitrap，静电场轨道阱质谱，是一种新型的高分辨率质谱检测器，通过与线性离子阱或者四级杆质谱串联可以极大的扩展其串联能力，提升仪器的分辨率，LTQ-Qrbitrap是线性阱和轨道阱串联的质谱仪，其一级质谱为高分辨的傅里叶变换检测器，可以只使用一级高分辨率质谱（hrMS）即可对目标肽进行精准定性而无需碎裂进入二级质谱。有学者把它与TSQ Vantage三重四级杆质谱进行对比研究，结果显示LTQ的HRMS线性检测范围：50～10000pg/ml，AngⅡ检出限15fg，TSQ的MS/MS线性检测范围：25～1000pg/ml，AngⅡ检出限5fg。两种仪器和检测模式都获得了极佳的定量和定性结果，但三重四极杆质谱灵敏度更优，而复合离子阱质谱的线性检测范围更宽[14]。
三重四级杆质谱和复合离子阱质谱在分析生物样本中血管紧张素代谢组学的应用中各有千秋，仪器平台的选择需要考虑研究的方向和目的。对于复杂生物基质条件下发现新的血管紧张素代谢物及研究各类生物基质的血管紧张素代谢全谱时，应对仪器的动态范围及定性的准确性进行考察。对于确定研究的血管紧张素成分，可控的浓度变化范围，则需要仪器有更高的灵敏度，以获得对极低丰度的血管紧张素代谢组分进行有效分析。
3.总结与展望
血管紧张素是一个庞大的代谢网络，近年来，液相色谱质谱联用技术在血管紧张素的新组份与新功能的发现和研究中发挥着愈发重要的作用。然而，该项技术在生物样本血管紧张素组学检测中也面临一些问题。一方面，血管紧张素组分不同肽与色谱材料亲和能力不同，导致前处理过程中亲水性差异大的肽组分回收率不稳定，随着检测组分的增加可能需要有针对地选择或开发针对血管紧张素肽亲和力更强的色谱分析材料或先预分馏再行分析；另一方面待检样本中血管紧张素肽浓度极低与LC-MS储存、检测容器的对其的非特异性吸附损失之间的矛盾尚未得到很好解决。研究相应的表面处理技术和创新材料是今后该项技术广泛应用的一个基础问题；一些近几年出现的质谱检测的新技术，例如，高分辨质谱和相应的平行反应监测模式是否能进一步提升检测的效果也需要进一步研究证实。
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论文作者:何川1,周万兴1，2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年5月第15期
论文发表时间:2018/5/31
标签：血管论文; 紧张论文; 样本论文; 质谱论文; 色谱论文; 生物论文; 基质论文; 《医药前沿》2018年5月第15期论文;