李德敏[1]1999年在《小鼠白细胞分化抗原PTA1的分布与功能研究》文中认为白细胞分化抗原是免疫细胞膜表面标记中最重要的一类，由国际人类白细胞分化抗原协作组按CD序号命名。多数CD分子在其它哺乳动物中都存在同源分子，其中以小鼠的同源分子研究最多。小鼠与人CD分子的研究相互呼应，互为补充，有力地推进了白细胞分化抗原的研究。 血小板／T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation anigen，PTA1)是最早发现于人混合淋巴细胞反应诱导的杀伤性T细胞(CTL)表面，影响CTL分化的一种白细胞分化抗原。后来发现还表达于活化T细胞、NK细胞、血小板、血管内皮细胞等，参与细胞分化、血小板活化聚集等功能，与血小板功能异常、自身免疫性疾病、移植物抗宿主反应等疾病的发病机制有关。 人PTA1基因于1997年克隆成功，证明是一种新的白细胞分化抗原，属于免疫球蛋白家族，胞膜外区有两个免疫球蛋白样结构域。次年，猿和猴PTA1 cDNA克隆成功，发现与人的同源性在93～95％，表明PTA1在生物进化中高度保守。 鉴于小鼠作为动物模型在免疫学研究中具有的其它动物所无法替代的重要性，以及小鼠白细胞分化抗原的研究进展，本研究从表达分布、功能、基因等方面对小鼠PTA1进行了较系统的研究。 首先通过免疫荧光组织染色及原位杂交技术，发现PTA1在小鼠组织中有表达，且主要分布于淋巴器官，尤以T淋巴细胞聚集区为主。在心肌、肝、肺、肾、骨骼肌等组织未发现PTA1的表达。其次应用免疫荧光染色及流式细胞仪技术，对PTA1在小鼠细胞水平的分布进行了研究。发现PTA1主要表达于胸腺、脾脏及T淋巴细胞系，而在成纤维细胞系、肥大细胞系、巨噬细胞系中无表达。PTA1在T细胞中的表达可被T细胞多克隆刺激剂PHA及蛋白激酶C活化剂PMA所诱导，且PHA的诱导能力较PMA强。接着采用细胞杀伤试验及重导向杀伤试验对PTA1在小鼠杀伤细胞中的作用进行了研究，发现小鼠PTA1与人一样，也参与混合淋巴细胞反应中CTL的分化，但其抗体LeoAl不影响CTL对靶细胞的杀伤，也不影响NK和LAK细胞对靶细胞的杀伤。在重导向杀伤试验中，PTA1参与混合淋巴细胞反应诱导的杀伤细胞、NK细胞和LAK细胞的重导向杀伤。最后，采用反转录-PCR的方法，用非严谨的条件尝试克隆小鼠PTA1基因，结果获得了一段非编码的小鼠基因序列。 本研究结果显示，小鼠PTA1具有与人相似的表达规律，并具有相似的功能，表明PTA1是生物进化过程中一种保守的免疫分子，可能具有重要功能。本研究的结果，为应用小鼠作为实验模型对PTA1进行进一步的研究打下了良好的理论和实验基础。
庄然[2]2007年在《CD226及其配体CD112/CD155分子相互作用机制的研究》文中认为血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1, PTA1)属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)成员,其胞膜外区含有2个V样结构域。在2000年召开的第七届人类白细胞分化抗原国际协作组会议(HLDA7)上获得编号CD226。CD226分子最早通过单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)LeoA1被发现,在使用人混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)得到的活化细胞免疫小鼠时获得LeoA1,它所识别的抗原称为T细胞谱系特异的活化抗原1(T lineage-specific activation antigen 1, TLiSA1)。随后发现除活化T细胞表达外,该分子也分布于血小板,因而命名为血小板/T细胞活化抗原1。美国DNAX研究所也研究了同一蛋白分子,并命名其为DNAM-1(DNAX accessory molecue-1)。该分子于1996年基因克隆成功,cDNA全长2603bp,包含7个外显子,开放读框编码336个氨基酸,胞浆区具有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。CD226分子与表达于杀伤性T细胞(CTL)和NK细胞的CD96(Tactile)分子在蛋白水平有22%的同源性,与BGP-1、CD36、PRR和果蝇神经胶质蛋白Neuroglian也有一定的同源性。CD226基因产物是分子量约为65kDa的I型跨膜糖蛋白,表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨核/血小板谱系及活化的血管内皮细胞;广泛参与了免疫系统的生理和病理学功能,如T细胞、巨核细胞的分化,NK细胞对肿瘤细胞、病毒感染细胞的杀伤,血小板的活化与聚集,单核/巨噬细胞穿越血管内皮细胞等过程,并参与其中的信号转导。CD226分子体内天然配体于2003年得到鉴定,为同属于nectin/Necl家族的黏附分子:人脊髓灰质炎病毒受体(PVR/Necl-5/CD155)及其家族成员人PVR受体相关分子(PRR-2/nectin-2/CD112),CD112同时也是单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的受体。CD226的配体表达广泛,包括神经细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等。在与CD112和CD155相互作用后,CD226分子可以向细胞内传递活化型信号,参与固有免疫和适应性免疫应答,引发多种免疫学效应,包括细胞间的黏附、浸润及杀伤活性的发挥等过程。但是目前有关这些细胞间黏附分子相互作用的确切分子机制尚不完全清楚。CD226、CD112和CD155分子同属于免疫球蛋白超家族成员,胞膜外区具有相似的空间结构,这一类黏附分子是通过什么样的结构域相互作用从而传递了活化性的信号仍不明确。探讨参与CD226与其配体CD112和CD155分子作用的蛋白结构域,有助于深入理解黏附分子、杀伤细胞活化型受体等免疫细胞膜分子激活的分子机制。本研究首先通过RT-PCR方法,从人结肠癌细胞系SW480中克隆出CD226分子的两种配体CD112和CD155基因的开放读框全长。针对其胞膜外区(extracellular domain,ED)基因序列和相应的目的载体多克隆位点,合成带有酶切位点的引物,将CD112和CD155分子胞膜外区分别插入可以表达分泌型融合蛋白(带有人IgG Fc段标签)的真核表达载体pCMD7,转染CHO细胞并在真核细胞抗生素G-418选择压力下培养和有限稀释法克隆化筛选后,分别获得了可稳定表达CD112ED-Fc和CD155ED-Fc融合蛋白(C端带有Fc标签)的CHO细胞株,用抗Fc单抗亲和层析柱纯化融合蛋白,并利用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,各制备了一套可满足免疫印迹、免疫沉淀、免疫组化染色、流式细胞术以及功能实验要求的单克隆抗体,并利用该单抗初步分析了CD112和CD155分子在机体免疫系统抗肿瘤中的作用,以及CD155分子在正常和肿瘤组织中的表达。由于现有真核表达载体pCMD7的多克隆位点过于简单,所以我们改构了pSecTag2B载体,使其可以表达带有3C酶识别位点和C端Fc标签的融合蛋白。利用该载体,同上述方案分别建立了可以稳定分泌胞膜外区第一个和第二个结构域的CD226D1-Fc和CD226D2-Fc融合蛋白的CHO细胞株。纯化的融合蛋白可用于细胞杀伤、细胞黏附等免疫学功能实验模型,以分析CD226分子与其配体CD112/CD155分子相互作用的结构域。应用可溶型分子液相与固相结合试验,发现CD112或CD155与固相化全长CD226分子有较高的结合能力,而与CD226D1和D2的结合能力明显下降。采用CFSE/PI双标记法以及NK细胞为效应细胞、K562细胞为靶细胞的杀伤实验中,CD226-Fc以及CD112-Fc和CD155-Fc融合蛋白均可以明显抑制NK细胞的杀伤活性,而CD226D1-Fc和CD226D2-Fc的抑制作用很弱;FMU-CD112.8和FMU-CD155.12 mAb也具有抑制作用。说明CD226-CD112和CD226-CD155相互作用都参与了NK细胞识别和杀伤靶细胞。采用CFSE荧光标记的PBMC与ECV304内皮细胞黏附阻断实验模型证实,CD226全长分子可以显著抑制PBMC与ECV304细胞之间的黏附,同样发现CD226D1和CD226D2的抑制作用非常弱。本实验研究中,我们还构建了含CD226胞膜外区不同结构域的截短体和CD226/ICAM-1绿色荧光蛋白嵌合体分子,及其配体CD112/CD155分子与红色荧光蛋白融合表达载体,转染CHO细胞后,采用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察分析了CD226与其配体CD112和CD155分子间的相互作用结构域。结果显示,单独CD226第1结构域(羧基端连接ICAM-I分子胞膜外区第5结构域和跨膜区、胞浆区)或者单独CD226第2结构域(氨基端连接ICAM-I分子胞膜外区第1结构域)的嵌合体膜型分子均不能与细胞表面膜型CD112或CD155分子有效结合,只有包括了D1和D2的完整CD226分子才能有效结合CD112或CD155分子,并引发相应分子在细胞膜上的极化和聚集,出现明显的帽形成(capping)。上述多个模型的实验均证实,CD226分子胞膜外区2个V样结构域都参与了同配体的结合;在高浓度可溶形式条件下,CD226分子胞膜外区单独一个结构域仍可以与配体分子以较低的亲和力结合,可以部分的模拟天然分子的结合效应,但胞膜外区2个V样结构域的完整性对于CD226与其配体有效结合及活化信号的传递是必需的,缺失任何一个结构域都不能有效的与相应配体发生高亲和力的结合,也不能诱导受体和配体膜分子在相应细胞膜表面的极化和聚集。说明CD226与配体的结合有赖于完整的蛋白空间构象。这些实验结果为进一步深入研究免疫细胞活化型受体CD226分子参与机体多种免疫学功能的分子机制奠定了实验基础。
贾卫[3]2001年在《一种新的白细胞分化抗原CD226(PTA1)分子结构和功能关系的研究》文中认为以CD命名为主的人类白细胞分化抗原（human leukocyte differentiation antigen，HLDA）参与机体免疫活性细胞识别抗原，充当某些补体片段、IgFc段、细胞因子、病毒等的受体，介导细胞间、细胞与基质间的相互作用，参与细胞活化、信号转导、成熟分化以及免疫细胞效应功能的发挥，与机体免疫应答、炎症反应、造血调控、创伤愈合、凝血、肿瘤发生和转移等重要的生理和病理过程密切相关。 血小板/T细胞活化抗原1（platelet and T cell antigen 1，PTA1）是一种新的白细胞分化抗原，在2000年召开的第七届人类白细胞分化抗原国际协作组（HLDA7）会议上，被命名为CD226。PTA1最早通过单克隆抗体Leo A1所发现，表达于活化的T细胞表面，称为T细胞谱系特异的活化抗原1（T lineage-specific activation antigen1，TLiSA1）。随后发现也表达于血小板，随即命名为血小板T细胞活化抗原1。又名DNAM-1（DNAX accessory molecue-1）。PTA1也表达于NK细胞、活化内皮细胞以及前髓样细胞和巨核血小板谱系。该分子1996年基因克隆成功，含有7个外显子，cDNA全长2603bp，编码336氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，分子量为67kDa，含有8个N连接、3个O连接的糖基化位点。胞浆区近膜端前8个氨基酸中富含7个精氨酸，胞浆区还有7个苏氨酸、6个丝氨酸以及3个酪氨酸。属免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成员，胞膜外区有2个V样结构域，是目前发现的IgSF中唯一仅含有2个V样结构域的分子。与表达于杀伤性T细胞（CTL）的Tactile（CD96）有22％的同源性，与BGP-1、CD36、PRR和果蝇神经胶质蛋白Neuroglian也有一定的同源性。主要参与NK细胞、CTL的杀伤功能，与血小板的凝集有关。 我们采用亲和层析法，从血小板表面纯化了天然CD226分子，纯化的蛋白分子保持了较好的免疫反应性，以此为免疫原制备的抗CD226分子的多克隆抗体效价达4×10~(-5)经Western blot鉴定，多抗识别纯化分子的分子量为67kDa。以纯化的CD226分子为免疫原，免疫Balb/c小鼠，制备了7株分泌抗CD226分子的单克隆抗体杂交 第四军医大学博士学位论文 英文摘要 瘤 FMU．7，多次传代和长期培养可稳定分泌单克隆抗体，腹水效价一般在 10‘．10 一。在间接 ELISA实验中，与天然 CD226分子和 p“lflg均有良好的反应性，与 hlgG无交叉反应。所有抗体可结合 COS7细胞瞬时转染的 CD226分子。采用生物 传感器单抗配对方式表位分析（palnNise i of印itope mopping）的方法，发现 FMUI－7、Leo AI和 New EI可分别识别 CD226分子 7个不同的表位。其中，FMUI 和 FMUZ以及 FMU4和 FMUS识别相同的表位，其余均识别不同的表位。Le。AI 和New EI、FMU6和FMU7识别的表位较接近。分别以Leo AI、NewEI、FMUI 或FIAUZ为包被抗体，以FMU3作为酶标抗体，可建立双抗体夹心ELISA，用于检 测可溶性 CD226分子。除 Leo AI和 FMU3外，其余抗体可应用于 Western blot实 验。 建立了 Leo AI与抗 CD226 PoAb双抗体夹心 ELISA方法，首次发现人活化外 周血单个核细胞培养上清中和人血清中存在可溶性 CD226分子（sCD226），正常人 血清中 SCD226水平为 36．23士4．siP g／L，肿瘤和一些发生移植排斥反应等临床疾病 患者血清中SCD226水平升高，肺癌、贲门癌、脑膜瘤、肾肿瘤及睾丸肿瘤等患者 血清 SCD226为 57．26rt．00卜叭，从而表明血清中 SCD226水平的升高与一些临床 疾病有关。 通过构建 PTA分子胞膜外区不同结构域截断突变体真核表达载体，瞬时转染 COS7细胞，间接免疫荧光染色、流式细胞术分析结果表明，识别CD226分子胞膜 外区的 9株单抗中，Leo AI、New EI、FMU、FMUZ、FMU4和 FMUS识别的表 位位于DI结构域，FMU6和FMU7识别的表位位于DZ结构域，PMU3识别的表位 位于＊结构域，且紧邻DZ结构域。在混合淋巴细胞培养（MLC）培养的第0天， 分别加入CD226分子的单抗，仅Leo AI、New EI、FMUI、FMUZ和FMU3能够 明显抑制 MLC诱导的 NK和 CTL的杀伤活性，抑制率分别为刀．3％和 49二％。在 重导向杀伤试验（RCA）中，Leo AI、New EI、FMUI、FMUZ和 FMU3单抗可以 明显上调NK细胞的杀伤水平，在M：50／l时，将NK细胞的特异性杀伤率上调 至 70o（对照 20o），提示CD226分子胞膜外区 VI结构域参与NK和 CTL的功能。 所有识别 CD226分子胞膜外区的单克隆抗体中，仅 Leo AI、New EI、FMUI、 FMUZ和liU3可结合活化Jurkat细胞、MLC诱导的活化T细胞、Hutl02BZ细胞 以及血小板表面的CD226
李州利, 孙凯, 张继帅[4]2002年在《两种新的与移植免疫相关的白细胞分化抗原》文中研究说明白细胞分化抗原 (ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ ,ＬＤＡ)是白细胞分化成熟为不同谱系和分化不同阶段以及活化过程中出现或消失的细胞表面标记[1] 。大多数ＬＤＡ已用ＣＤ加以编号和分类。从 2 0世纪80年代以来 ,ＣＤ编号
孙忱[5]1999年在《PTA1在巨核细胞/血小板谱系中的表达，分布与功能研究》文中提出1985年Burns等用活化T淋巴细胞为免疫原免疫小鼠，通过淋巴细胞杂交瘤技术制备的LeoA1 mAb识别人T细胞活化抗原TLiSA1(T lineage-specific activation antigen 1)，并证实该分子与杀伤性T细胞的分化有关。Scott等进一步研究发现TLiSA mAb可以诱导人血小板活化聚集，竞争结合试验结果显示，每个血小板表面约有1200个TliSA分子，遂将此分子更名为PTA1(platelet and T cell activation antigen 1)。 本实验室与Burns教授实验室合作，对PTA1分子表达与分布及结构与功能进行了长期研究。主要实验结果包括：(1)多克隆T细胞刺激剂例如PHA、PMA、CD3单抗等诱导的人活化T细胞、长臂猿白血病细胞系MLA-144、T细胞杂交瘤47C7均表达PTA1分子，IL-1、IL-2、TNF-α和PMA等对人活化T细胞PTA1的表达有上调作用，而转化生长因子-β(TGF-β)则显示出明显的下调作用。PTA1多克隆抗体对NK细胞的分化有明显影响。(2)对全血细胞进行了系统的FACS分析表明，人静止T细胞、B细胞、粒细胞系统、单核细胞及红细胞系统均不表达PTA1分子。而正常人脐带血内皮细胞、早期髓样细胞系及部分巨核细胞系组成性表达PTA1分子，提示PTA1分子对髓系和巨核／血小板谱系发育、分化及细胞功能可能具有重要影响。(3)已完成PTA1／Ig融合蛋白真核表达载体的构建和表达及PTA1配体的部分鉴定工作。 最近，Sherrington等由TPA活化的人T细胞性白血病Jurkat细胞cDNA
李德敏, 金伯泉, 苏丽, 贾卫, 孙凯[6]1999年在《小鼠血小板/T细胞活化抗原1的表达分布与功能》文中提出目的研究小鼠血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ＰＴＡ１）在小鼠组织及各种细胞系的表达分布与诱导，及其在杀伤性Ｔ细胞和ＬＡＫ细胞诱导中的作用。方法应用流式细胞仪技术分析ＰＴＡ１在小鼠组织及细胞系中的表达及诱导；用同种异体抗原诱导杀伤性Ｔ细胞，用ＩＬ－２诱导ＬＡＫ细胞，分别研究ＰＴＡ１特异性单克隆抗体对其分化的影响。结果小鼠ＰＴＡ１主要在Ｔ细胞系呈诱导性表达，参与杀伤性Ｔ细胞的分化，但不参与ＬＡＫ细胞的诱导。结论小鼠ＰＴＡ１与人ＰＴＡ１有相似的分布特点与功能，是一种进化中高度保守的白细胞分化抗原
徐向升[7]2006年在《小鼠PTA1/CD226与配体分子相互作用结构域的研究》文中指出目的：阐明小鼠PTA1(mPTA1)／mCD226对杀伤性T淋巴细胞(CTL)分化的影响。确定mPTA1分子与mTage4参与相互作用的结构域，以深入研究这两种分子的功能。 方法：①利用小鼠PTA1-hIgFc真核表达载体表达并纯化mPTA1融合蛋白，免疫家兔，获得抗mPTA1多克隆抗体，并用偶联mPTA1-Fc融合蛋白的Sepharose-4B亲和层析柱纯化多克隆抗体。间接免疫荧光染色及流式细胞术鉴定多克隆抗体的特异性。②通过混合淋巴细胞培养(MLC)诱导产生CTL效应细胞，以~(51)Cr释放实验检测mPTA1多克隆抗体在MLC中对T淋巴细胞分化及杀伤功能的影响。③扩增编码mTage4全长分子和mPTA1、hICAM-1分子不同结构域的DNA序列，构建含mTage4和mPTA1不同结构域编码序列的截短体以及mPTA1／hICAM-1荧光蛋白嵌合体分子基因的真核表达载体，并转染COS-7真核细胞，通过激光扫描共聚焦显微镜研究这两种分子间的相互作用。 结果：①获得了mPTA1-hIgFc融合蛋白和针对mPTA1胞膜外区的多克隆抗体，该抗体能与转染细胞表面mPTA1分子结合。②mPTA1多克隆抗体对MLC诱导的CTL的杀伤有明显的抑制作用，并呈剂量依赖关系，mPTA1多抗加入的时间愈早，抑制杀伤作用的效果愈明显。③DNA序列测定证实
王东琳[8]2008年在《CD226抗体治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究》文中认为人CD226曾先后被称为T细胞谱系特异性活化抗原(1 TLiSA1,1985)、血小板T细胞活化抗原1(PTA1,1989)DNAX辅助分子1(DNAM-1,1996),并于2000年首次以我国实验室为主要研究单位在国际人类白细胞分化抗原协作组(HLDA)大会上获得编号为CD226。该分子于1996年基因克隆成功,cDNA全长2603bp,包含7个外显子,开放读框编码336个氨基酸,胞浆区具有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。CD226分子与表达于杀伤性T细胞(CTL)和NK细胞的CD96(Tactile)分子在蛋白水平有22%的同源性,与BGP-1、CD36、PRR和果蝇神经胶质蛋白Neuroglian也有一定的同源性。CD226成熟蛋白由318个氨基酸组成,分子量约为65kDa,属免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白,表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨核/血小板谱系及活化的血管内皮细胞;广泛参与了免疫系统的生理和病理学功能,如T细胞、巨核细胞的分化,NK细胞对肿瘤细胞、病毒感染细胞的杀伤,血小板的活化与聚集,单核/巨噬细胞穿越血管内皮细胞等过程,并参与其中的信号转导。CD226分子体内天然配体于2003年得到鉴定,为同属于nectin/Necl家族的黏附分子:人脊髓灰质炎病毒受体(PVR/Necl-5/CD155)及其家族成员人PVR受体相关分子(PRR-2/nectin-2/CD112),CD112同时也是单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的受体。小鼠PTA1/CD226基因于2002年成功克隆,由7个外显子组成,编码完整小鼠CD226分子的cDNA开放读框有1002bp,编码333个氨基酸残基,小鼠CD226分子亦属免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白。小鼠CD226与人CD226在核苷酸水平有67%的同源性,而在氨基酸水平有53%的同源性。已证实mCD112和mCD155(Tage4)是mCD226的配体。小鼠CD226介导了抗原特异性CD8+T细胞共刺激信号的转导,并可参与肿瘤的免疫监视,而小鼠CD226分子在自身免疫调节中的作用尚未有较多的研究结果。Th17细胞和Th1细胞均可诱导自身免疫应答,但其二者的相互关系尚未清楚。EAE最初被认为是由Th1细胞介导的,但近期的越来越多的研究认为,部分器官特异性自身免疫性动物模型中,Th17细胞对于诱导整个免疫病理中是必不可少的,并提出EAE首先是由Th17细胞启动介导的理论。本实验就小鼠CD226分子在体外培养体系及体内功能实验所参与的自身免疫调节进行了初步研究。本研究中首先克隆化建立稳定表达mPTA1-Fc融合蛋白的CHO-mPTA1/Ig细胞株,通过培养上清制备mPTA1-Fc融合蛋白,并成功免疫新西兰大白兔动物,获得了较高的免疫血清,通过亲和层析的方法纯化出特异性的多抗,ELISA、SDS-PAGE电泳结果及免疫荧光流式检测显示,该多克隆抗体具有良好的生物学活性和较高的纯度。在单抗制备过程中,将融合蛋白免疫大鼠,利用杂交瘤技术,建立制备大鼠源性单抗的平台,从5400个克隆孔中,通过交叉筛选挑选出5株阳性克隆,利用裸鼠体内诱生腹水及无血清培养上清纯化获得了具有较高活性的单抗克隆抗体。所获得的5株单抗经ELISA、SDS-PAGE电泳结果及免疫荧光流式检测显示,有4株能很好的识别小鼠CD226的重组蛋白及天然分子,为后续研究mPTA1分子的表达、分布及功能提供了有利的研究工具。我们利用所制备的抗体通过免疫荧光染色技术检测小鼠PTA1在不同细胞系的表达情况。结果表明,在小鼠肥大细胞系、小鼠单核/巨噬细胞系PTA1分子表达较高。此外mPTA1分子在小鼠树突状细胞系表达较高,在B细胞也有组成性的表达。而在上皮细胞来源、纤维母细胞或低分化细胞来源细胞系上表达为阴性。本研究还发现正常小鼠脾淋巴细胞即有mPTA1分子的高表达,CD4+T细胞及CD8+T细胞均表达mPTA1分子,但CD8+T细胞表达更高,小鼠NK细胞及巨噬细胞表面也有mPTA1分子的表达。小鼠脾淋巴细胞经MLC培养7天后,其mPTA1的表达更加明显,CD8+mPTA1+细胞与CD4+mPTA1+细胞均有明显增多,而且以CD8+mPTA1+细胞更为显著。同时发现,作为小鼠PBMC的脾淋巴细胞在经MLC刺激的同时,与PTA1抗体共培养后,其细胞培养上清中Th1样细胞因子INF-γ水平明显升高,胞内细胞因子的荧光标记染色结果也有类似变化。提示PTA1分子可能在CD4+Th细胞分化中发挥了重要的免疫调节作用。为进一步研究小鼠PTA1分子所参与的免疫调节机制作用,我们又进行了mPTA1的体内功能实验。首先我们成功建立了自身免疫性疾病的经典动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55肽段并辅以结核杆菌及百日咳毒素免疫EAE敏感动物品系C57BL/6小鼠后,于免疫免疫后第10天开始陆续发病,出现EAE的典型临床神经系统症状,病程为慢性单时相进展型,约在第20天达到发病高峰,发病率达到70%,同时伴随脑组织的病理改变, HE染色检测结果发现,在脑白质区小血管周围有淋巴细胞浸润,即呈“袖套样”炎性结构改变。LFB染色发现在脑的冠状切片及脊髓纵向矢状切片中发现,白质区有LFB未着色区,髓鞘稀疏不连续,部分呈片状脱失。EAE模型小鼠的脾淋巴细胞IFN-γ的胞内染色水平表达较正常小鼠有明显下降,而IL-17水平增高了近70%。当小鼠EAE模型中注射mPTA1抗体时,发现EAE的发病率、发病时间及发病程度均有较好的缓解,发病率由60%减少到30%,发病起始时间由免疫后的第7天延缓至第14天,平均临床分数由2.2分降低至0.5分。同时,在对EAE组和抗体注射组的研究中发现,抗体注射组的脾淋巴细胞IFN-γ的胞内染色水平较EAE组升高了约85%,接近正常未免疫小鼠;而IL-17水平反而较EAE组降低了约87%。这些研究结果提示我们,抗mPTA1抗体对EAE有较强的保护机制之一可能是由于通过提高了EAE小鼠机体内IFN-γ的水平,从而抑制了IL-17的产生,进而减弱了IL-17诱导的自身免疫性炎症。
陈丽华[9]2000年在《一种新的内皮细胞可诱导性粘附分子的表达调变及功能研究》文中指出血小板／T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1，PTA1)是1997年基因克隆的新分子，属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员，胞膜外区含有2个免疫球蛋白V样结构域，表达于活化T淋巴细胞、NK细胞和巨核细胞／血小板表面。IL-2、TNF-α、佛波酯(PMA)和PHA对PTA1的表达有上调作用，TGF-β有下调作用。PTA1单抗可以诱导血小板活化和聚集。在混合淋巴细胞培养初期加入PTA1单抗可抑制CTL的分化，同时降低NK细胞的杀伤活性。PTA1分子表达与疾病相关性的研究表明，PTA1在移植物抗宿主病、肾综合征出血热、尖锐湿疣患者PBMC、胃癌浸润淋巴细胞及桥本氏甲状腺炎浸润T细胞中有较高水平的表达，提示PTA1与某些感染性疾病、移植排斥反应、肿瘤及自身免疫性疾病的发生有关。PTA1配体(PTA1L)分布于活化T淋巴细胞、Jurkat细胞、Colo205结肠癌细胞系以及某些黑色素瘤细胞等。鉴于此，本室已向第七届国际白细胞分化抗原专题会议提出为PTA1分子申请新的CD编号。 实际上，CD分子分化中细胞谱系(lineage)的特异性是相对的，多数CD分子分布较为广泛，而且在不同谱系中的功能是不同的。本文首先发现，LPS刺激后的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)诱导性表达PTA1，为了进一步明确活化内皮细胞PTA1分子的分布和表达规律、搞清内皮细胞表面PTA1分子所参与的生物学功能及其信号转导机制，我们进行了以下研究：①采用免疫荧光染色及流式细胞术分析观察活化内皮细胞及肾综合征出血热病毒感染内皮细胞PTA1的表达规律；②应用ELISA方法检测活化内皮细胞培养上清中可
张新海[10]2003年在《小鼠PTA1/CD226分子的基因克隆及其表达、分布和功能研究》文中认为人血小板T细胞活化抗原1(PTA1)是1985年发现的一个表达于血小板和活化的T细胞表面的分子，1997年基因克隆成功，并在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上获准了新的CD编号(CD226)。自从发现该分子以来，对其结构、分布、功能以及与临床的关系等做了大量的研究，结果表明，人PTA1／CD226分子参与了T细胞的分化，也参与了血小板的活化和聚集；在结构上人PTA1／CD226是免疫球蛋白超家族的成员，并具有信号转导的功能；新近的研究更证实人PTA1／CD226参与了免疫突触的形成。在结肠癌等多种来源的细胞系表面发现有人PTA1／CD226分子配体的分布，另外LFA-1、4.1G、hDlg以及Rap1等分子可能与人PTA1发生作用。在临床上，与血小板功能异常、自身免疫性疾病、移植物抗宿主反应、病毒感染性疾病以及肿瘤等的发病有着密切的关系。因此，人PTA1／CD226是一个具有重要生物学功能和临床潜在应用前景的分子。 本博士论文是基于人PTA1分子研究的基础之上，克隆了小鼠PTA1分子的基因，并进行了其相应的表达、分布、分子特性、以及初步的功能学研究。主要的研究结果有： 利用人PTA1分子的氨基酸序列，从GenBank的EST数据库中检索出一段与人PTA1分子在氨基酸水平有51％的同源性的小鼠EST序列，并根据此EST序列设计特异性引物，采用RACE方法从BALB／c小鼠胸腺中克隆出小鼠PTA1分子的全长基因以及三个不同剪切体(异型)。结果表明，小鼠PTA1分子cDNA的开放读框有1002bp，编码333个氨基酸残基，比人PTA1分子少3个氨基酸残基；与人PTA1分子在核苷酸水平有67％的同源性，而在氨基酸水平有53％的同源性；在结构上，小鼠PTA1分子为穿膜蛋白，其胞膜外区由四个半胱氨酸组成两个免疫球蛋白V样结构域，而胞浆区具有磷酸化及与信号分子相作用的位点；编码小鼠PTAI分子的基因定位于小鼠第18号染色体，由7个外显子组成；通过对外显子和内含子的序列分析表明，所克隆的三种异型均符合mRNA的剪切规则。 将小鼠PTAI胞膜外区克隆入真核表达载体psecTagZB，通过转染COS7细胞、表达上清经抗MyC抗体亲和层析纯化获得融合蛋白dTA IMyC，免疫新西兰兔获得兔抗小鼠 PTA多克隆抗血清；将小鼠PTAI胞膜外区克隆入原核表达载体pGEX＊Tl，转化大肠杆菌BLZI，IPTG诱导表达，用所获融合蛋白GST－mPTAI免疫BAsB止小鼠，制备单克隆抗体；通过鉴定表明，兔抗小鼠PTAI多克隆抗血清可以识别天然的小鼠TPAI分子，因而可以用于免疫荧光、免疫沉淀、以及功能阻断实验等研究中；小鼠抗小鼠PTAI单克隆抗体7G10可以识别变性的小鼠 PTAI分子，因而在 Western Blot中检测小鼠 PTAI分子效果较理想。 采用逆转录PCR 原位杂交、以及免疫荧光染色等方法对小鼠PTAI的组织细胞分布特点进行了研究。其中，RTICR的结果表明：小鼠 PTA明确地表达于胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结等免疫组织，以及 EL．4和 P815等小鼠细胞系；脾脏原位杂交结果表明：小鼠PTAI mRNA阳性细胞主要分布于脾脏被膜下及动脉周围淋巴鞘区域，亦即成熟的T淋巴细胞所分布的区域；对小鼠胸腺、脾脏、淋巴结、骨髓来源的不同细胞进行免疫荧光染色，结果表明：小鼠PTAI分子主要表达于成熟T细胞表面，其中以CD3＋CD4CDS＋细胞表达最强，另外，单核巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞以及活化的DC也有一定水平的表达。 对小鼠胸腺瘤细胞系EL－4的PTAI表达情况进行了研究，结果表明，EL－4细胞在静止时 PTA有一定水平的表达，当受 TPA刺激活化后PTAI的表达上调；对活化的EL－4细胞进行PTAI兔疫沉淀可以获得分子量为60kDa的主带，另外还有两条分于量略小的条带，活化EL－4的培养上清亦可沉淀出一个小分子量条带，表明上清中有可溶性形式存在；提取 EL－4细胞的 RNA进行 Nowhern Blot研究，发现在未刺激 EL－4细胞即有PTAI mRNA的转录，当 TPA刺激一天后，转录水平大大提高，但当联合使用 TPA和 A23187后，PTAI的转录水平反而明显下降，该结果与在Jurkat细胞上研究人PTAI的结果相类似。 取C57BL历 ／J’鼠的DC细胞作为刺激细胞，BALB儿小鼠的纯化CD4＋和CDS＋T细胞作为反应细胞，进行淋巴细胞增殖实验，并在该系统中加入抗小鼠PTAI多克隆抗体，结果表明抗小鼠PTAI多克隆抗体对由异品系DC引起的小鼠T细胞的增殖反应有抑制作用，其中以CD4＋T细胞为明显。为了使功能阻断实验更为精确，我们又构建了能稳定分泌小鼠PTAI胞膜外区FC融合蛋白的细胞系CHO－11LAlffg，大量制备融合蛋白hal／lg，交联亲和层析柱，亲和纯化出特异性高的抗小鼠PTAI多克隆抗体，为进一步的功能学实验创造了条件。 4 通过对小鼠PTAI所进行的各种研究表明，作为人PTAI同源分子，小鼠 PTA在核酸和氨基酸组成、分子结构、分布等方面有许多相似性，但亦存在有一定的差异，表现在：（）尽管小鼠PTAI分子在胞浆区含有与人PTAI相同的结合SHZ?
参考文献：
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[9]. 一种新的内皮细胞可诱导性粘附分子的表达调变及功能研究[D]. 陈丽华. 第四军医大学. 2000
[10]. 小鼠PTA1/CD226分子的基因克隆及其表达、分布和功能研究[D]. 张新海. 中国人民解放军第四军医大学. 2003