吴志刚[1]2003年在《几丁质/壳聚糖酶产生菌的分离及发酵条件、酶学性质研究》文中认为本实验室从浙江省滩涂淤泥筛选了一株既产几丁质酶又产壳聚糖酶的菌株CJ-5，经鉴定属于气单胞菌属(Aeromonas)。通过对Aeromonas sp. cJ-5发酵条件的研究，确定其最佳产几丁质酶的条件为：培养温度30℃，pH7，几丁质底物浓度2.5％，500mL摇瓶的培养基装量为100mL；最佳产壳聚糖酶的条件为：培养温度30℃，pH6，壳聚糖底物浓度2.5％，摇瓶装量为125mL。在3升发酵罐中以几丁质为底物进行发酵，几丁质酶活力可达0.41U／mL，壳聚糖酶活为1.5U／mL。通过对硫酸铵沉淀获得的粗酶进行酶学性质研究，发现该菌产生的几丁质酶与壳聚糖酶的最适反应温度为36℃与56℃，其最适反应pH都为7.0。两种酶在50℃以上的温度条件下容易失活。通过非变性电泳和SDS-PAGE的分析，确定了该菌产生的几丁质酶的分子量为250kD，壳聚糖酶的分子量为50kD。通过以几丁质为底物的发酵液试验表明，发酵液具有明显的抑制真菌以及促进水稻生长的作用。
冯俊丽[2]2004年在《壳聚糖酶产生菌的鉴定及其发酵条件、酶学性质研究》文中提出从自然界筛选到一批几丁质／壳聚糖酶产生菌株，利用16S rRNA序列分析对其进行初步的鉴定。结合形态特征和生理生化性质，将一株高产壳聚糖酶菌株C-28归为细菌域、变形杆菌门、β-变形杆菌纲、伯克霍尔德氏菌目、伯克霍尔德氏科。研究确定C-28最佳产酶发酵条件为：培养温度33℃、壳聚糖浓度2％、接种量2％、pH6、装量300ml。在此培养条件下，48h时摇瓶中发酵液的最高酶活力可达3.81 U／mL，是迄今所见报道中最高的发酵液酶活力水平。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-200凝胶柱层析，纯化了C-28壳聚糖酶，该酶的分子量为34.9kD，最适反应pH值为7.0，最适反应温度为46℃，在45℃以下、pH 5.0—8.0的环境中比较稳定，Mn~(2+)、Mg~(2+)、Na~+、K~+对该酶的酶活力有促进作用，而Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)对它具有抑制作用。薄层层析对酶解产物分析表明该壳聚糖酶对底物的作用方式是内切型。此外，还对CJ-5菌株产生的几丁质酶与壳聚糖酶进行了纯化及理化性质的研究。
姚祥春[3]2008年在《气单胞菌产几丁质酶的工艺条件优化和应用初探》文中指出几丁质酶(chitinase Ec.3.2.14)能够催化几丁质水解为几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,广泛存在于各种微生物、植物及动物细胞和组织中。由于几丁质酶在生物防治和处理几丁质废物等方面具有巨大的应用潜力,因而受到广泛的重视。本文对实验室保藏的几丁质酶产生菌Ch2进行了形态结构特征、生理生化特征的鉴定,并用Biolog进行分析,初步确定为气单胞菌属(Aeromonas sp.)菌株。通过对Ch2菌株的生长曲线、生长条件的研究,初步了解菌株的生长特性。进行了Aeromonas sp.Ch2发酵工艺条件的优化,以提高其产酶活力。经优化确定的较佳培养基组成为:胶体几丁质0.5%,蛋白胨1.2%,尿素0.2%,MgSO_4 0.05%,K_2HPO_4 0.03%,NaCl 0.5%;较佳培养条件为:培养基初始pH为6.5-7.0,培养温度为28℃,接种量为6%,摇瓶装量为50 mL培养基/250 mL叁角瓶,180 r/min摇床培养3d。按优化工艺进行发酵,菌体产几丁质酶的活性达到1.69 U/mL,比优化实验前提高了7.5倍。进行了该菌3L发酵罐产酶的研究,比较了分批发酵和补料发酵过程中发酵液中菌体生长规律,pH、还原糖和酶活力之间的关联情况。补料发酵时,几丁质酶的活力在65h达到产酶高峰,达到1.802U/ml,产酶高峰比分批发酵提前7h,酶活力比分批发酵提高了5%。粗酶液经硫酸铵盐析(60%饱和度,4℃)、亲和层析(以再生脱乙酰几丁质为介质)纯化后,样品经SDS-PAGE电泳只显示单一条带。分别进行了产酶菌体和几丁质酶初步盐析粗品的抑菌试验,结果显示几丁质酶粗品的抑菌效果好。同时考察了几丁质酶粗品对壳聚糖的降解效果,结果显示几丁质酶粗品对脱乙酰度低的壳聚糖降解效果较好。
刘萍[4]2009年在《绿色木霉产双功能酶的结构与功能研究》文中进行了进一步梳理纤维素酶是公认的一种具有非专一性水解壳聚糖的代表性酶类。本实验室已从绿色木霉来源的商品纤维素酶制剂中分离纯化出一种具有水解纤维素和壳聚糖活性双功能酶。为了进一步确证纤维素酶中该双功能酶的存在,本研究采用分子生物学手段,对产纤维素酶的绿色木霉菌株的双功能酶基因进行克隆和体外重组表达,并探讨该双功能酶的基因结构与双功能性质的关系。本研究对于进一步了解双功能酶结构与功能的关系具有重要的学术意义,同时对于提高该双功能酶的活力也具有重要的应用价值。研究了绿色木霉菌株(Trichoderma viride)在羧甲基纤维素钠(CMC)诱导下产高活性酶的发酵条件;采用柱层析系统对发酵液中的双功能酶组分进行分离纯化,从酶学性质和酶结构方面与本实验室前期从商品纤维素酶中分离出的双功能酶进行了对照比较;结果表明:在CMC诱导培养4天时发酵液中壳聚糖酶活力和纤维素酶活力同时达到最大值;所纯化的双功能酶与从商品酶中纯化的双功能酶为同一蛋白。该双功能酶的Maldi-Tof-Tof Mass序列测定结果表明:该双功能酶的两个主要肽段的序列与GenBank里糖苷水解酶7族(GH-7)的绿色木霉产CBHⅠ(gi|295937)的氨基酸序列具有很高的同源性,推测该CCBE可能属于GH-7族。以T.viride RNA为模板,采用RT-PCR、SMART-RACE方法克隆了双功能酶CCBE的全长cDNA序列,并进行毕赤酵母表达,结果显示:CCBE的全长cDNA序列与五个在GenBank中登录的木霉属GH-7族的CBHⅠ基因(Trichoderma.sp)具有88-100%的同源性,但与已知的壳聚糖酶和几丁质酶基因却无任何序列相似性,而重组表达产物具有强的壳聚糖酶活力,证实了绿色木霉所产CCBE属于GH-7族,两活力产自同一基因,其mRNA可能存在选择性剪接现象。采用RT-PCR法测定了不同诱导时间绿色木霉CCBE的mRNA表达水平,同时研究了不同内含子保留的剪接子基因在重组毕赤酵母中的转录表达情况,结果表明:绿色木霉CCBE的mRNA存在依赖于诱导时间的选择性剪接现象,四种剪接基因型DC(保留有两内含子)、CCBEIN1(内含子1保留)、CCBEIN2(内含子2保留)和CC(不含内含子)的出现以及所占比例随诱导时间而变化。各剪接子在毕赤酵母体内的转录产物相同,均不含内含子;四个重组表达产物的分子量大小相同,均具有强的壳聚糖酶活力,但纤维素酶活力却截然不同:只有CCBEIN1和CC具有CMCase活力,且前者活力大小约为后者的一半,由此推测内含子的保留尤其是内含子2的保留可能通过改变各表达产物的蛋白构象从而影响其活力表达。对CCBE不同内含子保留的剪接基因的毕赤酵母重组表达产物水解壳聚糖和CMC的酶学性质、水解产物进行研究,并采用删除突变对双功能酶不含内含子的基因型进行C-末端删除分析,探讨了基因结构与双功能性质的关系;结果表明:不同内含子保留的双功能酶基因的体外重组酶作用两底物的性质相近但并不完全一致,作用壳聚糖的最适温度和最适pH分别集中于55-60℃和5.0-5.2;而作用CMC则为55-60℃和4.2,水解方式均为外切;与从绿色木霉中纯化的CCBE基本保持一致,其中重组酶CC的性质与纯化CCBE的一致性最高。内含子1的保留通过改变重组酶部分CMC催化结构域的正确折迭而抑制其CMC降解活力,但对其底物结合位点无影响;而对于壳聚糖酶活力,其使酶与壳聚糖结合能力下降,但对其催化域的构象影响不大;内含子2的保留改变了纤维素结合结构域的正确构象,从而完全失去CMCase活力,但不影响重组酶壳聚糖酶活力的催化结构域和底物结合结构域,而是使其催化域附近的底物进入通道变小,从而使得大分子难以进入。由此证实了: CCBE作用壳聚糖的催化结构域和底物结合位点均位于CCBE的N-端及序列中上游位置,与作用CMC的截然不同,后者则位于C-端及序列中下游部位。本论文研究验证了绿色木霉在纤维素诱导条件下会产生具有壳聚糖和纤维素降解活性的双功能酶,采用分子生物学手段确证了纤维素酶中双功能酶的存在;同时发现了绿色木霉所产的双功能酶基因具有内含子保留的选择性剪接现象,探讨了双功能酶不同内含子保留的基因结构与双功能性质的关系。
戴秋萍, 方和娣, 陶诗, 王健鑫, 叶兴乾[5]2012年在《二株产壳聚糖酶海洋微生物的筛选和鉴定》文中研究指明采用不同培养基对海水养殖场环境样品进行壳聚糖酶产生菌的分离,结果表明海水培养基对于菌株筛选有显着的促进作用,同时甲壳类外壳是壳聚糖酶产生菌的良好来源。KJT-A和KJT-D是从海水养殖场蟹壳表面分离到的两株壳聚糖酶产生菌株,结合形态学观察、生理生化反应和分子生物学鉴定,初步确定菌株KJT-A和KJT-D分别为假单胞菌属(Pseudo-monas)和青霉属(Penicillium)。同时分析了不同温度、盐度对两株菌株生长的影响。
参考文献：
[1]. 几丁质/壳聚糖酶产生菌的分离及发酵条件、酶学性质研究[D]. 吴志刚. 浙江大学. 2003
[2]. 壳聚糖酶产生菌的鉴定及其发酵条件、酶学性质研究[D]. 冯俊丽. 浙江大学. 2004
[3]. 气单胞菌产几丁质酶的工艺条件优化和应用初探[D]. 姚祥春. 浙江工业大学. 2008
[4]. 绿色木霉产双功能酶的结构与功能研究[D]. 刘萍. 江南大学. 2009
[5]. 二株产壳聚糖酶海洋微生物的筛选和鉴定[J]. 戴秋萍, 方和娣, 陶诗, 王健鑫, 叶兴乾. 海洋环境科学. 2012