王子艳[1]2011年在《氧分压对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响》文中指出造血干细胞体外扩增是解决其数量不足问题的有效途径,但由于体外培养环境与体内造血微环境存在很大差异,造血干细胞经过体外扩增后其生理功能可能丧失。因此,有必要优化体外培养环境,使造血干细胞在扩增的同时保持其正常的生理功能。氧分压是造血干细胞体外培养过程的关键参数,在常规培养体系中可达21%,而在骨髓造血微环境中一般只维持在5%左右,氧分压对造血干细胞的体外扩增特性和生理功能具有重要影响。为此,本文以脐血CD34+细胞为对象,分别在有血清和无血清培养体系中,采用SCF+IL-3+IL-6和SCF+TPO+FL两种细胞因子组合,考察了氧分压对总细胞和造血干/祖细胞体外扩增、造血干/祖细胞体外分化以及扩增后CD34+细胞再扩增能力的影响,并通过NOD/SCID小鼠模型考察了有血清体系中氧分压对造血细胞生理功能的影响。结果表明,无血清体系中氧分压对造血干细胞的体外扩增特性没有显着影响。有血清体系中的结果如下：(1)常氧分压条件下总细胞的扩增倍数显着高于低氧分压条件,说明常氧分压更有利于总细胞的扩增；(2)低氧分压条件下总细胞中CD34+细胞、CD34+CD38-细胞和CFCs所占的比例显着高于常氧分压条件,说明低氧分压更有利于保持扩增后细胞的干／祖细胞特性；(3)氧分压对造血干／祖细胞体外向各系血细胞的分化没有显着影响；(4)常氧和低氧条件下扩增的CD34+细胞都具有再扩增能力；(5)常氧和低氧条件下培养的造血细胞都能成功植入NOD/SCID小鼠体内并向各系分化,且具备集落形成能力；(6)低氧条件下培养的造血细胞在NOD/SCID小鼠体内的植入能力、多系造血重建能力和集落形成能力均优于常氧条件下培养的造血细胞,说明低氧分压更有利于保持造血细胞的生理功能。这些研究为体外扩增的造血干细胞应用于临床提供了良好的实验基础。
鲍春雨[2]2004年在《脐血造血干/祖细胞体外扩增及无血清培养的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:作为造血干细胞的新来源,脐血以其独特的优势已广泛应用于移植治疗、生物免疫治疗、基因治疗等领域。但由于单份脐血的采集量低,不足以满足成人移植的需要,长期以来,研究者们一直在探索脐血干/祖细胞的有效分离、扩增的方法。本课题旨在寻求一种简便、高效、实用的脐血干/祖细胞的分离方法,并且对分离后的细胞进行体外扩增,来考察分离后的脐血干/祖细胞的增殖能力,探索扩增后最佳的应用时机;同时,比较有血清与无血清方法体外扩增脐血干/祖细胞的异同,探究无血清方法临床应用的可能性。方法:体外分离并培养脐血单个核细胞(MNC),计数MNC总数、流式细胞仪检测CD34+细胞含量、混合集落生成单位(CFU-mix)培养观察集落形成能力,验证脐血干/祖细胞分离和扩增的效果。1.将自行配制的比重为1.064g/L的蔗聚糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)分离液与传统的比重为1.077g/L淋巴细胞分离液密度梯度分离脐血,检测上述指标,比较分离效果;2.用上述两种分离液分离的脐血MNC进行添加细胞因子(IL-3、SCF、GM-CSF)的为期叁周的体外扩增,并对扩增后的细胞进行上述指标的检测,观察每周脐血干/祖细胞的增殖、分化情况。3.采用比重为1.064g/L的分离液分离的脐血MNC,用无血清造血干细胞培养体系和传统的含马血清的培养体系,进行叁周的体外扩增,检测上述指标,比较二者扩增效果。结果:1.1.064g/L组的CD34+细胞数、CFU-mix产率分别比1.077g/L
张洁霞, 毛平[3]2005年在《脐血CD34~+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究》文中进行了进一步梳理脐血是造血祖细胞的丰富来源之一,选择合适的培养条件,体外诱导其定向扩增为红系祖细胞,输入体内产生成熟红细胞。本实验旨在探讨脐血单个核细胞(MNC)体外红系定向扩增的理想因子组合(Flt3配基FL联合TPO、SCF、EPO及FL、SCF、TPO)对CD34+细胞扩增的影响。将单个核细胞接种至stemspan无血清培养液中,共分3组:A组为对照组,B组为TPO+SCF+FL+EPO+IGF1组,C组为TPO+SCF+FL组,C组在第6天及以后换液加入EPO和IGF1。于培养0、6、10、14天进行细胞计数,细胞集落测定,流式细胞术测定细胞的CD34、CD34CD71、CD71GPA细胞的比例。结果表明:经10天培养后,B组总细胞数扩增6.89倍,而C组3.06倍;B组CD34+细胞增加4.83,而C组2.47倍;B组集落形成细胞数增加4.3倍,而C组增加2.5倍;B组红系祖细胞BFUE和CFUE数增加5.4倍,而C组3.1倍;B组CD34+CD71+细胞数增加8.72倍,而C组3.37倍;B组CD71+GPA+细胞数增加53.4倍,而C组30.29倍。结论:脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO实现了CD34+细胞及集落形成细胞的扩增。脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO+EPO+IGF1短期液体培养获得红系祖细胞的扩增,在第0天比6天加入EPO获得更多红祖细胞(P<0.05)。由于TPO+SCF+FL+EPO+IGF1组的集落形成细胞数、CFUE和BFUE数于第10天最多,故培养后收获时
戴革, 李洁, 曹青, 李剑, 吴琼[4]2005年在《无血清培养条件下脐血造血干细胞的体外扩增研究》文中研究说明我们用自行研制的无血清培养体系和早期作用生长因子的组合,在排除血清的干扰、以及异源血清带来的免疫反应和血源性传播性疾病的情况下,研究了脐血有核细胞和CD34阳性细胞的体外扩增,现报道如下。1材料与方法1.1主要试剂HemoLym无血清培养基(江西协和干细
莫文健, 毛平, 何秋山, 应逸, 朱志刚[5]2005年在《两步法脐血巨核细胞体外扩增的研究》文中研究表明目的探寻一种通过脐血单个核细胞体外培养获得大量巨核细胞的方法。方法首先将脐血单个核细胞在无血清培养液中加入TPO、SCF、IL-6、IL-3培养至14d行巨核祖细胞体外扩增,然后单纯加入TPO、IL-6再培养4d诱导巨核细胞成熟。结果单个核细胞数扩增了约4.8倍,CD41+细胞扩增了44倍,有核细胞形态学分析50%~74%为巨核细胞,巨核细胞中94%~96%为颗粒及产板型巨核细胞,绝大部分呈“核浆发育不平衡、胞核发育延迟”现象。结论使用这种两步培养法在体外可获取大量的脐血来源的巨核细胞以供研究使用。
鲁茁壮, 吴祖泽, 张群伟, 王华, 刘红军[6]2004年在《重组人Delta-like-1胞外区促进细胞因子对脐带血造血祖细胞的扩增》文中研究表明目的 :Notch信号通路对造血干 /祖细胞的增殖分化具有重要调控作用。Delta like 1(Dll 1)是Notch的配体之一 ,本研究观察了重组人Dll 1胞外区 (hDll 1ext)对细胞因子扩增脐带血造血祖细胞的促进作用。方法 :RT PCR用于检测Notch 1及其配体在脐带血细胞上的表达情况。利用免疫磁性分离 (MACS)的方法分离人脐带血CD34+ 细胞。在无血清培养体系中 ,hDll 1ext分别和不同的细胞因子组合联合培养CD34+ 细胞 ,通过集落形成实验检测hDll 1ext对造血祖细胞的扩增作用。结果 :RT PCR方法检测到脐带血单个核细胞表达Notch 1和它的配体Dll 1,Jagged 1,表明在生理条件下 ,脐血细胞的增殖分化可能受到Notch信号的调控。hDll 1ext能促进细胞因子组合对脐带血HPP CFC的扩增 ,其中hDll 1ext和SCF ,IL 3,IL 6联合的扩增作用最强 ,无血清培养 8,12d后 ,HPP CFC分别增加为培养前的 9.7和 4 3倍。结论 :重组hDll 1ext能促进细胞因子对脐带血原始造血祖细胞的扩增作用
张艳兰[7]2012年在《CD133分子在儿童B系急性淋巴细胞白血病表达的意义及其生物学特性的初步研究》文中进行了进一步梳理一、儿童B系急性淋巴细胞白血病CD133分子表达的意义目的：探讨急性淋巴细胞性白血病（Acute lymphoblastic leukemia ALL）患儿诱导化疗前后骨髓单个核细胞CD133-1、CD133-2两种分子的表达与临床预后指标的相关性。方法：选取初诊ALL患儿59例，流式细胞术检测其骨髓单个核细胞CD133-1和CD133-2的表达比例。结果：1）初诊B-ALL患儿CD133-1、CD133-2的表达与其年龄、性别、外周血白细胞计数、骨髓幼稚细胞比例、LDH水平、细胞遗传学改变、融合基因、危险等级、完全缓解（CR）率及白细胞分化抗原CD38、CD58和CD66c等表达均无相关性（P>0.05）（其中4例T-ALL因例数太少，无统计学意义）。2）55例B-ALL中，CD133-1表达阳性者21例（占38.2%），CD133-2表达阳性30例（占54.5%），二者表达阳性比例有显着差异（P＜0.05）。3）B-ALL组CD133两种亚型分子的表达与CD34表达虽然有显着性差异（P＜0.05），但无相关性（P＞0.05）；结论：1）初诊B-ALL患儿CD133-1、CD133-2的表达与其性别、年龄、外周血白细胞计数、骨髓幼稚细胞比例、LDH水平、危险等级、融合基因、细胞遗传学改变、CR率、CD38、CD58、及CD66c等表达均无相关性。2）B-ALL患儿CD133-2的表达比例明显高于CD133-1。3）CD133表达与CD34表达无相关性。二、儿童B系ALL来源的CD133+细胞生物学特性的初步研究目的：体外分离儿童B-ALL原代白血病细胞CDl33+CD19+、CDl33+CD19-等亚群细胞，初步探讨其体外生物学特性。方法：选取4例CD133表达阳性的B-ALL患儿，经免疫磁珠法（MACS）分选出CDl33+CD19+与CDl33+CD19-细胞，并用流式细胞仪对所分选细胞的CD133-2表达进行鉴定；分选后的CDl33+CD19+与CDl33+CD19-两组亚群细胞，分别接种于含干细胞因子（SCF）、白细胞介素-3（IL-3）和白细胞介素-7（IL-7）的无血清培养基中，悬浮培养4-7周后，流式细胞术检测培养细胞的CDl33、CD19及CD34的表达，RT-PCR检测其融合基因的表达。同时以MACS分选的CD133-细胞作对照。结果：1）MACS法分选B-ALL原代白血病CDl33+CD19+与CDl33+CD19-两组亚群细胞，分选后细胞总回收数为（76.9±25.63）×106，较分选前细胞总数[（99.0±21.07）×106]低，细胞总回收率为77.7%,但二者之间无显着差异（P>0.05）；流式细胞术检测所分选的细胞的CD133-2表达比例，示两者平均比例分别为(77.5±13.61）%、(76.83±5.58)％。2）CD133+CD19+、CD133+CD19-两组亚群细胞在无血清培养基中悬浮培养平均5周（4-7周），细胞生长良好，可形成克隆细胞球；通过在4个不同时间点（d0、d14、d28、培养结束前）对两组细胞进行计数，提示CD133+CD19+亚群细胞增殖速度更快，且培养至14天左右细胞即进入增殖高峰期，上述4个时间点细胞数差异有统计学意义（P<0.05）。而CD133-CD19+、CD133-CD19-两组原代细胞亚群则未形成克隆细胞球，且细胞增殖缓慢，1周内无明显细胞增殖，以后逐渐凋亡。3）CD133+CD19+、CD133+CD19-两组亚群细胞经体外无血清培养4-7周后，经流式细胞术检测，CDl33、CD19及CD34均无表达。4）2例初诊时有融合基因表达异常（分别TEL/AML1、MLL/AF4表达阳性）的B-ALL患儿，分别经无血清培养5、7周后融合基因仍表达阳性。结论：1）免疫磁珠分选技术能够成功分离纯化儿童B-ALL中CD19+CDl33+与CDl33+CD19-两组亚群细胞；2）含不同细胞因子的无血清培养基能有效支持B-ALL的CD133+细胞体外中、长期培养并维持其生物学特性；3）B-ALL中CDl33+较CDl33-细胞具有更强的体外增殖潜能,CD133-2+CD19+细胞亚群可能具有白血病干细胞特性。
参考文献：
[1]. 氧分压对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响[D]. 王子艳. 华东理工大学. 2011
[2]. 脐血造血干/祖细胞体外扩增及无血清培养的实验研究[D]. 鲍春雨. 大连医科大学. 2004
[3]. 脐血CD34~+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究[J]. 张洁霞, 毛平. 中国实验血液学杂志. 2005
[4]. 无血清培养条件下脐血造血干细胞的体外扩增研究[J]. 戴革, 李洁, 曹青, 李剑, 吴琼. 江西医学检验. 2005
[5]. 两步法脐血巨核细胞体外扩增的研究[J]. 莫文健, 毛平, 何秋山, 应逸, 朱志刚. 中国输血杂志. 2005
[6]. 重组人Delta-like-1胞外区促进细胞因子对脐带血造血祖细胞的扩增[J]. 鲁茁壮, 吴祖泽, 张群伟, 王华, 刘红军. 军事医学科学院院刊. 2004
[7]. CD133分子在儿童B系急性淋巴细胞白血病表达的意义及其生物学特性的初步研究[D]. 张艳兰. 苏州大学. 2012