蒋芳玲[1]2003年在《辣椒遗传转化体系的优化及转录因子JERF-33#导入的研究》文中认为辣椒(Capsicum annuum L.)是一种非常重要的蔬菜作物。但由于各种生物或非生物胁迫，辣椒产量和品质受到严重的影响。因此，提高其综合抗性已成为重要的研究课题。 为提高辣椒的抗性，可将抗病或抗逆基因导入辣椒中，但在植物中，抗病性和抗逆性往往受不同基因所控制。因此，导入单个抗病或抗逆的功能基因，辣椒的综合抗性难以得到改良，而同时克隆抗病抗逆基因又费时费力。其中编码转录因子的基因，由于其DNA结合蛋白的特殊调控特性，可以使一个或多个基因同时表达。将转录因子基因导入辣椒中，与只导入单个功能基因相比，对辣椒综合抗性的改良具有更为重要的意义。 从番茄cDNA表达文库中分离到的JERF-33#基因属于AP2／EREBP转录因子家族，此类型转录因子中包含一个保守的60个氨基酸左右的DNA结合域，能和GCC盒相互作用，调控抗病、抗逆相关基因的表达。本试验旨在将JERF-33#基因导入辣椒中，以提高辣椒的综合抗性。 要将JERF-33#基因导入辣椒中，首先必须建立一个稳定的遗传转化体系。而辣椒基因工程发展的最大障碍是遗传转化率太低。本研究以叁个甜(辣)椒品种为试材，通过导入报告基因—绿色荧光蛋白基因，分别就农杆菌悬浮培养基的pH值、共培养添加物、共培养时间和温度对外源基因导入的影响进行了较为系统而深入的研究，建立起农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。本研究结果表明： (1)农杆菌悬浮培养基pH为5.2时最有利农杆菌转化。 (2)农杆菌共培养培养基中添加AS200μM时，抗性愈伤组织荧光表达率最高。 (3)22℃时共培养，农杆菌转化率最高。 (4)共培养4天最有利于农杆菌的转化。 在此基础上，建立起了优化的辣椒遗传转化体系，并利用此体系，首次将JERF-33#转录因子基因导入辣椒中，通过PCR检测，获得转基因成株18株。
杨国顺[2]2003年在《转JERFs基因提高辣椒抗病性的研究》文中研究表明辣椒是一种重要的蔬菜作物和调味品。但由于各种病害的危害，辣椒的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性一直是十分重要的研究课题。通过常规育种手段从现有资源中选育出多抗、高抗、优质、高产品种难度大，耗时长。伴随病原菌的侵染，病程相关蛋白基因的表达是植物产生抗病反应的标志。通过抗微生物蛋白(如病程相关蛋白)的超表达是提高作物抗病性能的策略之一，然而，单个PR基因的表达仅能导致对几种真菌病害抗性的部份增加。在系统获得抗性中，许多病程相关基因的协同表达，从而有效地提高植物的广谱性抗病性。所以应用基因工程技术提高植物抗病性的一种更加有效的方法是使许多PR基因协同性的表达。就目前的技术而言，同时导入多个基因于一个植株中有较大的困难，因此导入控制抗逆基因表达的转录因子基因可能对全面改良作物抗逆性提供一种全新的途径。植物基因工程的发展与完善，为作物的遗传改良提供了新的策略和强有力的工具，转基因技术已在200多种植物中获得成功。辣椒基因工程经过近10年的研究，已取得了一些成就，但进展缓慢，离体再生困难和遗传转化率太低是限制其发展的两大因素。为突破上述瓶颈，本研究以中椒5号甜椒和湘研10号辣椒为试材，分别就6-BA与IAA的不同浓度及组合、PA以及ABA对子叶离体再生的影响进行了较为系统的研究，建立了辣椒子叶高效植株再生体系。在此基础之上，利用GFP作为报告基因，研究农杆菌转化过程中工程菌液的pH值、共培养基中AS的浓度、共培时的温度与共培时间对转化效率的影响，建立了稳定有效的遗传转化体系。 应用上述试验体系，本研究成功地将从番茄cDNA表达文库中分离出的编码ERF型转录因子的新基因JERF10、JERF26、JERF33、JERF36(统称JERFs)导入中椒5号甜椒和湘研10号辣椒外植体(离体子叶)中，经Km筛选、PCR、Southern杂交、Northern杂交检测，获得了抗病性明显增强的转基因植株。在未实施任何胁迫的情况下，JERF33超表达的转基因植株中可见PR蛋白基因组成型表达。 本试验获得主要结果如下： 1．不定芽分化伸长期添加100 μ mol/L的PA、不定芽分化期添加0.3mg/L的ABA能显 着提高不定芽的伸长率。建立了辣椒子叶高效离体再生体系，子叶不定芽高效分化 培养基:MB+6一BA3.5~5.omg/L+IAAO.5~1.omg/L+PA(Spd，Spm)75~100 p mol/L+ ABAO.3mg/L+A gN035.omg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%;不定芽高效伸长培养基:MB+6一BAO.9 mg/L+IAAO.3mg/L+GA31.omg/L+PA100pmol/L+蔗糖3%+琼脂0.7%。2.当工程菌液的pH值为5.2时，共培养基中添加200 p MAS，在23℃的黑暗条件下 共培sd，能较明显地提高辣椒的转化效率。3.应用农杆菌介导法将‘肠舒污基因导入辣椒中，对经Km筛选的植株进行PcR检测， 其阳性率为8.1%~10.7%;对经PCR检测的阳性植株，进行PCR一Southern杂交检 测，所检测样品的阳性率为100%;进一步进行基因组DNA点杂交，阳性率为72.2%~ 77.8%;对经基因组DNA点杂交检测的阳性植株，随机抽取转刀尸侧留-刀沈月0 与川泊松二刀沈尺扮基因的各8株植株进行Northern杂交检测，了石砰了口、刀涌心J基 因的表达率分别为75%、87.5%。4.获得了对黄瓜花叶病毒、辣椒疫病与辣椒疮痴病抗性明显增强的转基因辣椒新种 质，并进一步证实在转基因辣椒中，未经任何胁迫的条件下，pROKZ一刀汲心J基因 的超表达能诱导碱性一p一葡聚糖昔酶、碱性几丁质酶、渗调蛋白、蛋白酶抑制剂、 具RNA酶活性的蛋白与防御素等PR蛋白基因的组成型表达。这些研究结果表明: .左泥尺U在转基因辣椒中的异源表达能增强植株对病毒、细菌和真菌的抗性。从这 些研究结果可推测:在经济作物中利用转录调控蛋白基因可能增加其广谱性的抗病 力。
康厚祥[3]2007年在《草莓再生体系的优化及转JERF_（33）基因提高其抗病性的研究》文中研究说明草莓是一种重要的多年生常绿草本植物，其果实味道鲜美，营养丰富，经济价值高，既可用于鲜食，又可用于加工，深受人们的喜爱。但由于各种病害的危害，草莓的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性对草莓生产具有重要的实际意义。草莓转基因已有成功的报导。通过转基因的手段来增强植物的抗病性是一种行之有效的方法，转入特定的病程相关基因(PR基因)能增强植物对某种或某几种特定病害的抵抗能力，但要获得多抗、高抗的品种，就必须同时转入多个基因，就目前技术而言是难以做到的。导入调节抗逆基因表达的转录因子基因可能对全面增强作物抗逆性提供了一种全新的途径。本研究主要以丰香、章姬为试材，对再生体系进行了优化，在此基础上，利用农杆菌介导法将转录因子基因JERF_(33)基因导入草莓中。对抗性植株进行PCR、DNA点杂交检测，获得了转基因草莓植株。对转基因植株接种炭疽病试验发现，其抗炭疽病能力显着增强。本试验获得的主要结果如下：1．建立了丰香、章姬的叶片高效再生体系，其再生率均达到100％，其中丰香最适培养基配方为1／2MS+2，4-D0.10mg／L+TDZ4.0mg／L，其平均再生芽数为3.5个，章姬最适培养基配方为1／2MS+2，4-D0.07 mg／L+TDZ4.0 mg／L，平均再生芽数目达到4.6个。2．草莓叶片外植体进行一个星期的暗培养有利于其不定芽再生率的提高。3．对章姬草莓叶片进行转基因，经过Km筛选再生出的植株进行PCR检测，其阳性率为5.4％；对PCR检测的阳性株进行DNA斑点杂交，其阳性率为66.7％。证明本研究已成功地将JERF_(33)基因导入章姬草莓中。4．对转JERF_(33)基因草莓叶片进行针刺法接种炭疽病，结果表明转基因株与对照株相比其抗性显着增强。
参考文献：
[1]. 辣椒遗传转化体系的优化及转录因子JERF-33#导入的研究[D]. 蒋芳玲. 湖南农业大学. 2003
[2]. 转JERFs基因提高辣椒抗病性的研究[D]. 杨国顺. 湖南农业大学. 2003
[3]. 草莓再生体系的优化及转JERF_（33）基因提高其抗病性的研究[D]. 康厚祥. 湖南农业大学. 2007