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摘要：目的：探讨肠道致病菌PCR检测及应用价值。方法：研究大肠杆菌、普通变形杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌4种肠道致病菌，通过PCR法检测，分析PCR检测在肠道致病菌检测中的作用。结果：多重PCR方法可扩增致病菌目的基因片段，具有较强特异性，可检测随意接种3个细菌。结论：多重PCR可快速、准确检测大肠杆菌、普通变形杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌4种肠道致病菌，值得推广应用。
关键词：肠道致病菌；PCR检测
随着人们生活水平和健康意识的不断提高，食品安全逐渐得到关注，食源性病原菌为导致食品健康的关键问题，目前也引起医学界的高度重视[1]加强食品安全监控，越来越受到各国卫生专家的重视。自1973年以来，关于食品安全中微生物的快速检验国际研讨会每3年举办一次。传统致病菌检测方法包括：生理检测、生化检测、血清水平检测等，但传统检测方法检测时间长、灵敏度低[2]。因此，应寻找一种操作简便、灵敏度高、检测速度快的检测方式，多重PCR检测为目前临床关注的焦点。多重PCR反应在相同反应体系中加入多种基因引物，经一次反应扩增多重目的基本，因反应体系不同引物及基因组的相互干预，必须经多重PCR体系优化，测定肠道病原菌种类，为临床诊断及治疗提供重要依据[3]。研究显示[4]，多重PCR可快速、正确区分肠道致病菌，为临床诊断提供重要依据。本文通过应用PCR检测4种致病菌，讨论临床检测效果，现报告如下。
1.资料与方法
1.1临床资料
蜡样芽胞杆菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌来源于北京兰博瑞公司，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌来源于疾病防控中心。试剂包括：营养琼脂培养基、PCR试剂、血平板培养基、革兰阴性增菌液培养基、溶菌肉汤培养基。仪器包括：离心机、梯度PCR仪、电泳仪、EC紫外成像系统。
1.2方法
表1 基因序列引物
菌种名引物序列
大肠杆菌FCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC
普通变形杆菌FGAAGGTCCCCACTTG
副溶血性弧菌CATGCCGGTGTATGAAGAA
单核细胞增生李斯特菌CGGGTAACGTCAATGAGCAAA
（1）菌株培养、DNA培养：应用营养琼脂培养基培养变形杆菌、大肠杆菌，置于37℃，可选择3个~5个菌种，菌种接种至LB液体培养基，其他菌株采用相同培养方式，在DNA提取过程中保证正规提取。（2）引物设计及合成：4种细菌依照基因序列提取，筛选特异基因为靶序列，靶序列设计引物。（3）单重PCR扩增、多重PCR建立：上述细菌单独扩增，表现为反应体系，扩增条件为90℃条件下预变性2.5min，相同条件变性30s，在65℃条件下退火30s，在75℃延伸30s，共36个循环，在75℃条件下延伸10min。建立多重PCR在单重基础完成，多2个循环，按照电泳亮度确定退火温度。（4）多重PCR特异性检测：将菌株置入相同反应体系，同时加入对应特异性引物，多重PCR扩增。多重PCR灵敏性检测，细菌培养24h后，取出悬液，梯度稀释，按照1：3：2比例提取DNA，优化后体系反应。细菌检测模拟果汁进行，选择多种样式果汁，作为样品，混合一定量的菌悬液，过夜培养，沉淀物取1ml，按照比例提取河段，进行多种PCR检测[5]。菌株及来源均由疾病预防控制中心提供。仪器包括：DNA提取试剂盒、PCR试剂、血平板、营养琼脂培养基、梯度PCR仪器。
2.结果
多重PCR检测效果显著，可扩大致病菌目的基因片段，表现特定结果形式。大肠杆菌扩增片段357bp、普通变形杆菌片段518bp、副溶血性弧菌187bp、单核细胞增生李斯特菌片段165bp，特异性强，目标菌检测灵敏度为102FU/mL，可随机接种其中3个细菌。
3.讨论
近年来，多重PCR技术在肠道致病菌检测中得到应用，且应用效果佳。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆多重PCR检测可检测肠道致病菌，在食品安全检测中发挥重要作用[6]。该检测主要为同一反应体系加入多种目的基因引物，保证在一次反应可获得多种目的基因扩增。临床应用过程中，由于一体系中多个引物、多个基因组具有排他性，在实践过程中可出现影响现象，因此，应通过一定优化，以保证检测效果[7-8]。
本研究显示，通过浓度、退火温度以优化PCR体系，正交实验把握各个组有效浓度和退火温度，同时针对多种PCR检测特异性，多体现在引物同模板匹配度，有效匹配是保证特异性的必要条件，同时在研究过程中，一次性加入不同菌群引物，扩增细菌基因片段，可实现一次性检测，充分体现检测时效性，灵敏度及模拟果汁检测方面，同文献报道结果，基本一致[9-10]。
综上所述，多重PCR可快速、正确区分大肠杆菌、普通变形杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌4种肠道致病菌，具有准确度高、检测速度快、效率高、特异性强等特点，在保证检测水平的同时，提高病原菌检测效率，值得推广应用。
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论文作者:高扬1,王彤2,尹啸冰1
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第30期
论文发表时间:2018/11/29
标签：致病菌论文; 引物论文; 肠道论文; 李斯特论文; 杆菌论文; 培养基论文; 弧菌论文; 《中国误诊学杂志》2018年第30期论文;