徐平勇[1]2004年在《Syntaxin和Munc18的相互作用及其在胰腺β细胞分泌中的功能研究》文中进行了进一步梳理胰岛素是机体最重要的激素之一, 它调节机体的血糖稳定、促进细胞代谢、调节细胞的分裂分化和生长发育。胰岛素储存在致密核心大囊泡中,通过囊泡分泌释放到细胞外。胰岛素的释放需要经过囊泡转运、锚定、启动和融合等多个步骤。Syntaxin1A (Stx1A)和 Munc18a在囊泡的转运和细胞分泌中发挥着关键的调控作用。然而它们的调控机制尚有待于进一步的研究。 本论文首先用Confocol和宽场荧光显微镜技术研究了在胰岛素分泌细胞系INS-1以及非分泌细胞系中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中Stx1A和Munc18a的胞内定位和相互作用。结果表明在INS-1细胞膜上Munc18a与Stx1A呈簇状共定位分布,但是不与Stx1A的氨基端Habc结构域缺失突变体共定位,表明Stx1A的Habc结构域在Stx1A与Munc18a相互作用以及Munc18a在膜上定位中起着至关重要的作用。在没有内源性Stx1A表达的CHO细胞中,EGFP标记的Stx1A不能定位到细胞膜上,即使与Munc18a共表达也不能定位到细胞膜上,表明Munc18a不足以将Stx1A转运到细胞膜。相反地,在INS-1细胞中Stx1A的上膜有助于Munc18a向细胞质膜的转运。Stx1A的一种双点突变体(Stx1A-L165A/E166A)可以使它保持开放的构型,在体外结合实验发现不与Munc18a发生相互作用,但是我们发现在体内仍能与Munc18a呈簇状共定位在细胞膜上,表明Munc18a可以通过结合闭合构型或者开放构型的Stx1A而转运到细胞膜上。体内荧光共振能量转移(FRET)证明了共定位的Munc18a与Stx1A发生了相互作用,但是Stx1A-DM尽管与Munc18a共定位分布,却没有观察到明显的FRET的发生。表明Munc18a与Stx1A以及Stx1A-DM之间可能具有不同的作用方式。 最后,用西伯利亚森林脑炎病毒(SFV)表达系统在原代β细胞中过量表达Munc18a研究其对胰岛素分泌的影响,通过两次连续钙离子光解释放(flash)技术发现过量表达Munc18a的细胞与对照细胞相比,第一次flash的慢簇发成分(SlowlyReleasable Pool,SRP )和延迟成分(sustained component)的大小减少了50 %,但 I
康利军[2]2006年在《Munc13-1在小鼠胰岛素分泌调控中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理胰腺β细胞在葡萄糖刺激下表现典型的双相分泌反应,完全的双相分泌是健康β细胞的标志,糖尿病伴随着胰岛素双相分泌的受损。40多年来,胰岛素双相分泌的细胞生物学基础一直存在很大的争议。一般认为胰岛素的双相分泌对应于不同类型的囊泡库,已锚定和成熟的囊泡(RRP)对应于第一相分泌,而可释放囊泡的补充则构成第二相分泌。但是双相分泌的产生是一个多因子参与的极其复杂的过程,进一步阐明其机理具有重要意义。Munc13是C. elegans Unc-13和Drosophila Dunc-13在哺乳动物中的同系物,有四种亚型,是SNARE蛋白的调节蛋白之一。Munc13-1/unc13基因敲除使神经突触不能形成RRP囊泡,从而使神经递质释放被完全阻断。Munc13蛋白含C2结构域和可与DAG结合的C1结构域。DAG/佛波醇结合到C1结构域增强了Munc13-1促囊泡成熟的能力,但是在内分泌LDCV囊泡上,Munc13的作用尚不清楚。本课题以Munc13-1基因敲除小鼠(KO)和Munc13-1H567K点突变小鼠(KI)为研究对象,系统研究了Munc13-1在胰岛素分泌及其在DAG信号调控过程中的作用。主要实验结果如下:1) Munc13-1基因敲除小鼠出生后几个小时内死亡,我们发现培养2-3天的新生小鼠β细胞表现典型的成年小鼠β细胞特点,如Na+通道失活及对葡萄糖的响应等。本培养方法的成熟为以出生致死型基因敲除小鼠为模型研究胰岛素分泌的分子机制奠定了基础。2)虽然Munc13-1在神经递质的释放过程中是不可缺少的因子,但它在内分泌大致密核心囊泡(LDCV)分泌的作用却尚不清楚。我们以膜电容检测和光解释钙技术相结合,发现在Munc13-1 KO小鼠中,延迟型组分的分泌几乎完全被抑制,KI小鼠中也明显降低。但是代表可释放囊泡分泌的簇发型分泌相却没有明显改变。连续去极化实验得到类似的结果,RRP排空后的恢复时间常数在KO小鼠中也明显延长。表明Munc13-1是胰岛素延迟相分泌所必需的,直接证明Munc13-1对长时程刺激下LDCV的补充起作用。由于Munc13-1的缺失使神经突触不能形成RRP囊泡,而在β细胞中却是正常的,说明Munc13-1在神经突触囊泡和LDCV的分泌中起着不同的作用。3)胰岛素双相分泌的产生机理尚有待阐明,我们以ELISA检测Munc13-1基因敲除小鼠胰岛素分泌,发现Munc13-1缺失选择性抑制葡萄糖诱导的第二相分泌,直接证明了LDCV的成熟过程是第二相胰岛素分泌的限速步骤。4)第二相分泌的产生或增强,需要代谢信号,而非膜去极化信号(通过KATP通道的关闭产生)的参与,然而具体参与的有哪些代谢信号还有待研究。我们对DAG接合能力缺失的Munc13-1H567K KI小鼠的研究表明葡萄糖诱导的DAG信号通路参与了胰岛素分泌的调控,Munc13-1是DAG/佛波醇通路一个关键的靶标分子。PMA能易化小鼠胰岛素的分泌,但KI小鼠中没有此效应,表明PKC不参与小鼠胰岛素分泌的调控,或作用于Munc13-1的上游。
汤云昭[3]2010年在《大鼠胰岛β细胞P糖蛋白的表达及功能研究》文中认为目的早期研究显示在小鼠胰岛B细胞中有一种与P糖蛋白(也称为多药耐药蛋白1, Multidrug Resistantance Protein 1, MDR1)相似的65kDa大小的膜蛋白,且借助膜片钳技术发现此蛋白有类似磺脲类受体的功能,可促进胰岛素颗粒释放。本课题目的首先探测大鼠胰岛β细胞中mini-P糖蛋白存在的可能性,并使用拮抗剂及RNA干扰技术进行该蛋白的功能研究,分析其在胰岛素两相分泌中的作用。方法(1)经胆管不离体灌注胶原酶V消化分离Wistar大鼠胰岛；INS-1细胞培养。分别提取大鼠胰岛、胰腺及INS-1细胞中的总RNA,针对MDR1特异基因序列abcblb的3'末端及5'末端设计多对引物,进行RT-PCR;萃取大鼠胰岛及INS-1细胞蛋白,以MDR1特异性抗体(C219)进行免疫印迹实验厂探测目的蛋白的存在。(2)针对P糖蛋白特异基因序列(abcblb)设计寡核苷酸序列,使用siRNA干扰技术孵育胰岛；转染效率的观察分别采用荧光显微镜观察,real-time PCR法测定目的基因的表达量及Western Blot去测定蛋白表达量的变化；进行葡萄糖刺激的胰岛素释放实验,采用放免法测定RNA干扰后大鼠胰岛的胰岛素两相分泌的变化。(3)建立高糖培养大鼠胰岛凋亡的模型,采用real-time PCR法测定siRNA干扰后,凋亡基因表达的变化,评价RNA干扰对于胰岛凋亡的影响,进一步分析目的蛋白在胰岛素两相分泌中的作用。(4)使用MDR1特异性拮抗剂(环孢菌素A)干预大鼠胰岛,放免法测定胰岛素的两相分泌。结果(1)RT-PCR实验提取的大鼠胰岛、胰腺及INS-1细胞中均扩增出了相应的目的片段,且在胰岛中的表达量较胰腺及INS-1细胞中表达量大。免疫印迹实验中,使用C219在胰岛匀浆蛋白中探测到65kDa大小的蛋白,在INS-1细胞蛋白萃取液中探测到了160kDa大小的蛋白。(2)在RNA干扰实验中,转染后48小时的胰岛于荧光显微镜下观察可见90%的胰岛均呈现红色荧光,提示转染成功；Western Blot实验结果提示在空白组、实验组及阴性对照组,使用C219均探测到了65kDa大小的蛋白,且实验组较空白组及阴性对照组蛋白表达量下调,而空白组及阴性对照无明显变化；siRNA干扰后abcblb基因的表达量实验组的较阴性及空白组减少,阴性组及空白组两组无变化；与abcblb基因相似的abcbla基因的表达量在叁组中无变化,胰岛素合成相关基因insuin1、insulin2及胰高血糖素合成基因glucagon表达量无变化；siRNA干扰后,叁组胰岛素分泌均呈现两相分泌,实验组的胰岛素一相及二相分泌较空白组及阴性对照组均受损。(3)高糖孵育后高糖组casp3及bax基因的表达量较正常组上调,高糖组Bcl-2基因的表达量较正常组下调,而Bcl-xl基因在两组中表达无差异；siRNA干扰后casp3 bax Bcl-2及Bcl-xl基因表达量在实验组、阴性对照组及空白组中的表达量均无变化。(4)在体外胰岛刺激实验中,MDR1拮抗剂环孢菌素A,抑制了胰岛素第二时相分泌,但胰岛素第一时相分泌无明显变化。结论(1)在INS-1细胞中有全长的P糖蛋白的表达,在大鼠胰岛中有mini-P糖蛋白的表达。P糖蛋白的表达不同,提示着二者可能具有不同的生物学功能。在INS-1细胞中,P糖蛋白可能主要与耐药相关,而在胰岛细胞中,mini的P糖蛋白可能主要与胰岛素的分泌释放相关。(2)siRNA干扰后,目的基因abcb16表达量下调,胰岛素的两相分泌均受损,而凋亡相关基因及胰岛素合成相关基因的表达无改变,提示siRNA干扰后未直接影响胰岛素的合成,且胰岛素的两相分泌受损并非通过凋亡途径,进一步支持了前述观点,P糖蛋白或mini-P糖蛋白影响胰岛素颗粒的酸化成熟,调节胰岛素的两相分泌。(3)使用环孢菌素A干预胰岛后,胰岛素的一相分泌未受影响,而胰岛素的二相分泌明显受抑制,推测其拮抗P糖蛋白或mini-P糖蛋白,从而影响胰岛素颗粒的酸化成熟,表现为胰岛素的二相分泌受损。(4)深入研究mini-P糖蛋白的结构及功能,可为新的降糖药物的研发提供理论基础,为糖尿病的治疗提供新思路。
参考文献：
[1]. Syntaxin和Munc18的相互作用及其在胰腺β细胞分泌中的功能研究[D]. 徐平勇. 华中科技大学. 2004
[2]. Munc13-1在小鼠胰岛素分泌调控中的作用机制研究[D]. 康利军. 华中科技大学. 2006
[3]. 大鼠胰岛β细胞P糖蛋白的表达及功能研究[D]. 汤云昭. 天津医科大学. 2010
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