陈宝生[1]2002年在《食管癌表达降调基因的研究》文中研究表明食管癌研究的主要方向之一是找到较特异、而且变化频率较高的分子标志或影响肿瘤发生发展的关键基因。国内外在食管癌相关基因研究方面已做了大量工作，如在食管癌发现了p53、p16和MGMT的突变、c-myc和cyclin D扩增、Rb的杂合性缺失及其相应蛋白的表达异常。然而迄今为止，食管癌变的分子机制尚不清楚。因此，继续寻找食管癌发生发展的相关基因仍是食管癌研究的一个重要课题。 本研究采用mRNA差异显示技术比较了叁例配对的食管癌／癌旁组织的基因表达情况，发现10个在食管癌中表达下调的基因，采用Northern blot、Dot blot、RT-PCR等技术确定了它们在食管癌中的异常表达频率。在这些获得的食管癌表达下调基因中，SPRR3、SPRR1、S100钙结合蛋白等是上皮细胞分化复合物的组成成分。我们同时发现催化这些蛋白形成分化复合物的酶TGM3在食管癌中也显着下调，提示上皮细胞分化复合物的形成障碍可能是食管癌变的一个重要事件。 本研究采用RH方法将在食管癌中表达下调的新基因C15orf6定位于15号染色体2区6带(15q26)。采用体外翻译系统获得了C15orf6的真核表达蛋白。制备了SPRR3以及C15orf6的多克隆抗体，从蛋白水平对SPRR3和C15orf6的表达进行了检测。结合免疫组化和GFP分析，发现C15orf6
潘蓓青[2]2016年在《PTPN1促进食管癌细胞侵袭运动的分子机制研究》文中认为PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor type 1)是一种非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶,主要通过调节细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平发挥功能,参与细胞增殖、生长和迁移的多个细胞信号通路的调节。研究表明,PTPN1在多种肿瘤组织中表达异常,并参与多种肿瘤的发生发展。我们在前期工作中发现PTPN1在食管癌组织中存在高表达,是CRT促进食管癌肺转移的关键下游分子。本研究旨在进一步深入探讨PTPN1促进食管癌细胞侵袭运动的分子机制。首先,我们通过在食管癌细胞中敲降PTPN1验证了PTPN1可正向调控食管癌细胞的侵袭运动能力。同时,我们发现敲降PTPN1可降调EGFR表达和Erk1/2的活性。通过siRNA敲降EGFR和抑制剂抑制Erk1/2的活性,我们验证了EGFR-Erk1/2通路对食管癌细胞侵袭运动能力的正向调控,并通过回复实验证实了PTPN1主要通过激活EGFR-Erk1/2通路增强食管癌细胞的侵袭运动能力。接着,我们通过Realtime PCR、MG132等实验发现PTPN1主要在mRNA水平调控EGFR的表达,进一步的核质分离实验和免疫荧光检测表明PTPN1可促进EGFR的转录因子Spl的浆核易位。为深入研究PTPN1对EGFR-Erk1/2通路以及食管癌细胞侵袭运动能力的调节机制,我们通过GST Pull-down联合LC/MS/MS技术高通量筛选了PTPN1在食管癌中潜在的相互作用蛋白共358个,并利用免疫共沉淀和免疫荧光技术对其中的高分候选分子MYH9在食管癌细胞中和PTPN1的相互作用进行了验证。MYH9为非肌型肌球蛋白重链ⅡA,参与细胞迁移、粘附及胞质分裂等多个过程,被报道与多个蛋白包括Spl的异常定位相关,而其与PTPN1的相互作用尚未见文献报道。为确定MYH9的调控作用,我们在食管癌细胞中敲降MYH9,发现食管癌细胞的侵袭运动能力和EGFR的蛋白及mRNA水平显着降低,并伴随着Spl的核浆易位。然而MYH9的ATPase抑制剂Blebbistatin并不能影响食管癌细胞的侵袭能力和EGFR的表达,进一步的回复实验证实MYH9的杆状尾部在MYH9对EGFR的调控中起到关键作用。以上结果提示MYH9可能通过其杆状尾部而不依赖其细胞骨架功能完整性介导PTPN1对食管癌细胞侵袭运动能力和EGFR蛋白表达的调控。为进一步确定MYH9是否为PTPN1的关键下游分子,我们首先通过Phos-tag技术以及免疫沉淀法联合广谱酪氨酸磷酸化抗体检测发现PTPN1可促进MYH9的酪氨酸去磷酸化。结合数据库信息,我们利用PTPN1底物捕获突变体和MYH9杆状尾部的非磷酸化突变体证实了PTPN1直接作用于MYH9的Y1408位点。接着,我们使用PTPN1的活性损伤突变体验证了PTPN1通过其酪氨酸磷酸酶活性促进食管癌细胞的侵袭运动和EGFR的表达,并通过MYH9杆状尾部的持续磷酸化突变体和非磷酸化突变体的回复实验证实了MYH9杆状尾部的Y1408非磷酸化形式在PTPN1促进EGFR表达中的关键作用。本研究揭示PTPN1在食管癌细胞中通过MYH9提高EGFR蛋白表达而促进食管癌细胞侵袭运动的分子机制,为进一步阐明PTPN1在食管癌发生发展中的作用提供了新的线索。
黄晓平[3]2003年在《中国北方食管鳞癌杂合性丢失的研究》文中研究说明食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国食管鳞癌的发病率和死亡率均很高。寻找食管癌相关的癌基因和抑癌基因可以为食管癌的诊断和治疗提供标志物，同时也可能为该病的预后判断提供指标。 为了找到与食管鳞癌发生和发展密切相关的抑癌基因，我们对130例中国北方食管鳞癌进行杂合性丢失研究，对可能的靶基因在基因组DNA和转录水平进一步分析。结果发现： 1．在13号染色体长臂上存在两个微小重迭缺失区域：其中一个位于13q12．3，在D13S171和D13S267之间；另一个位于13q14，在D13S263和D13S168之间。在所检测的病例中有22％出现连续叁个或以上微卫星标志的杂合性丢失。在较晚期的食管癌D13S263的杂合性丢失频率较高，而较高病理分级的食管癌D13S171和D13S263座位的杂合性丢失频率较高。 2．运用基因内多态标志进行基因的杂合性丢失研究发现，食管癌中基因DICE1、KIAA1016、RB1、LOC112865和MICA的杂合性丢失频率分别为68％、63％、54％、50％和67％。 3．CAGRI的基因内多态位点及其邻近的微卫星标志D13S220、D13S267、D13S219和D13S1493在食管癌中的杂合性丢失频率分别为47％，56％，67％，64％和66％。在15个患者中D13S267和D13S1493同时出现杂合性丢失。在较高病理分级的食管癌中CAGRI及其邻近的微卫星标志的杂合性丢失频率
赵颖[4]2012年在《MTDH对宫颈癌生物学行为及化疗、放疗敏感性的影响及机制研究》文中指出在严重威胁妇女健康的各种恶性肿瘤中,宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌,位居第二位。全世界每年约有500,000新发病例,其中超过80%发生于发展中国家。我国宫颈癌发病率居世界第二位。虽然高危型HPV感染是宫颈癌发生的主要病因,然而从HPV感染到宫颈癌发生之间大约有10-20年的时间,说明宫颈癌的发生是一个多个因素、多种分子参与的复杂过程。目前治疗宫颈癌的方法主要包括手术治疗、放射治疗和化学治疗。放疗和化疗是治疗宫颈癌的重要方法,主要用于晚期、复发或是无法手术的患者,或是和手术联合应用。虽然上述治疗手段提高了早期宫颈癌的治愈率,但局部晚期的患者生存率仍低,宫颈癌发生发展的确切机制尚未完全阐明,其治疗效果也有待提高。因此,寻找与宫颈癌发生发展相关的分子生物学指标以及提高化疗和放疗疗效的特异性靶分子,是我们亟待解决的问题。MTDH (Metadherin)最初是在被HIV-1病毒感染或使用病毒糖蛋白gp120、 TNF-α处理的人类胎儿星形胶质细胞中发现的。近些年来MTDH作为肿瘤恶化的一个关键分子以及肿瘤信号通路的复杂网络中的一个关键位点已经逐渐被人们所熟知。研究表明MTDH在多种恶性肿瘤中高表达,如乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤、肝癌、食管癌等,且和这些肿瘤的进展和不良临床结局相关。另外,研究发现MTDH可以促进癌症的侵袭、转移、化疗耐受、血管形成等多种恶性生物学行为,它可能是一种原癌基因。目前MTDH在宫颈癌中的作用尚缺乏研究。另外,研究者发现干扰MTDH可以增加乳腺癌和神经母细胞瘤对顺铂的敏感性,而放疗和顺铂的作用机制相似,均可引起DNA损伤,所以我们猜想MTDH可能影响肿瘤细胞对放疗的敏感性。本研究旨在探讨MTDH对宫颈癌的生物学行为及化疗、放疗敏感性的影响,为提高宫颈癌的治疗效果提供新的特异性靶点。本课题进行了两部分的研究,第一部分：构建干扰MTDH的质粒,转染入细胞干扰MTDH的表达,进一步研究其对宫颈癌细胞的增值、侵袭能力、凋亡、周期分布及化疗、放疗敏感性的影响。第二部分：研究MTDH调节宫颈癌细胞放疗敏感性的机制,为提高宫颈癌放射治疗的效果提供新的策略。第一部分MTDH对宫颈癌细胞生物学行为及化疗、放疗敏感性的影响[研究目的]研究调节宫颈癌细胞中MTDH的表达后对其生物学行为及化疗、放疗敏感性的影响。[研究方法](1) Real-time PCR和Western Blot法检测人子宫颈鳞状细胞癌细胞株SiHa、C-33A和人子宫颈腺癌细胞株HeLa中MTDH mRNA和蛋白的表达水平。(2)构建干扰质粒：将针对MTDH的短发夹RNA(shRNA)连入pSuper-retro-puro载体,合成干扰质粒prp-MTDH。(3)筛选稳定干扰MTDH的细胞株：将空质粒prp-N和干扰质粒prp-MTDH分别转染入SiHa细胞,嘌呤霉素筛选出稳定干扰MTDH的细胞系(SiHa/MTDH shRNA)和转染空载体组细胞系(SiHa/shRNA Vector),并用real-time PCR和Western Blot检测干扰效果。(4)MTT法检测降调MTDH对SiHa细胞增殖活性的影响。(5)流式细胞术检测降调MTDH对SiHa细胞凋亡及细胞周期的影响。(6) Transwell小室侵袭模型检测降调MTDH对SiHa细胞侵袭能力的影响。(7)MTT法检测降调MTDH对SiHa细胞化疗敏感性的影响。(8)克隆形成实验检测降调MTDH对SiHa细胞放疗敏感性的影响。[结果](1) real-time PCR结果显示SiHa和HeLa细胞中MTDH mRNA表达水平相当,C-33A细胞中MTDH的水平低于上述两种细胞。Western Blot(?)(?)检测MTDH在这叁种细胞中的蛋白表达水平与real-time PCR结果趋势一致。(2)稳筛出干扰MTDH的细胞系(SiHa/MTDH shRNA)和转染空载体组细胞系(SiHa/shRNA Vector), real-time PCR和Western Blot检测结果表明SiHa/MTDH shRNA组中MTDH的表达明显低于SiHa/shRNA Vector组。(3)降调MTDH降低了SiHa细胞的增殖活性。(4) MTDH对SiHa细胞的凋亡和细胞周期分布无影响。(5) MTDH对SiHa细胞的侵袭能力无影响,SiHa/shRNA Vector组和SiHa/MTDH shRNA组穿过Transwell小室的细胞数无差别。(6)降调MTDH增加SiHa细胞对顺铂、紫杉醇和5-氟尿嘧啶的敏感性：加入梯度剂量的上述化疗药后,SiHa/MTDH shRNA组的相对细胞存活率明显低于SiHa/shRNA Vector组(p<0.05)。(7)降调MTDH增加SiHa细胞对X-线放疗的敏感性：梯度剂量的X-ray作用于细胞后,SiHa/MTDH shRNA组相对细胞存活率明显低于SiHa/shRNA Vector组(p<0.05)。[结论及意义]干扰质粒pSuper-retro-puro-MTDH能够成功抑制宫颈癌细胞系SiHa中MTDH的表达。降调MTDH对宫颈癌细胞的凋亡、周期分布和侵袭能力无影响,但可以降低宫颈癌细胞的增殖活性和其对顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和X-线的敏感性,它可以作为提高宫颈癌化疗、放疗敏感性的特异性分子靶标。第二部分MTDH调节宫颈癌细胞放疗敏感性的机制研究[研究目的]探讨降调MTDH增加宫颈癌细胞对放疗的敏感性的作用机制。[研究方法](1)流式细胞术检测MTDH对SiHa细胞放疗前后细胞周期分布的影响。(2)流式细胞术检测MTDH对SiHa细胞放疗前后凋亡率的影响。(3) Western blot检测MTDH对SiHa细胞放疗前后凋亡相关蛋白表达水平的影响。(4)免疫荧光法检测SiHa细胞中放疗引起的γ-H2AX焦点在MTDH调节前后的变化。(5) Western blot检测MTDH对SiHa细胞DNA损伤修复通路中的蛋白表达水平的影响。[结果](1)降调MTDH的表达减少SiHHa细胞中放疗引起的G2期阻滞：2Gy的X-ray照射后10个小时,转染空载体组(SiHa/shRNA Vector组)中有38.11±0.75%的细胞阻滞于G2期,而干扰组(SiHa/MTDHshRNA组)中33.45±0.94%的细胞阻滞于G2期,少于空载体组(p<0.05)。不加放疗时两组阻滞于G2期的细胞比例无差别。(2)降调MTDH的表达增加SiHa细胞中放疗引起的凋亡：2Gy的X-ray照射后24个小时,转染空载体组(SiHa/shRNA Vector组)和干扰组(SiHa/MTDH shRNA组)中发生凋亡的细胞比例分别为9.90±0.28%和12.59±0.52%(p<0.05),表明降调MTDH的表达增加放疗引起的凋亡；不加放疗时两组凋亡率分别为3.51±0.50%和4.75±0.25%,差异无统计学意义。(3) MTDH改变SiHa细胞放疗后Bcl-2的表达：抗凋亡蛋白Bcl-2在转染空载体组(SiHa/shRNA Vector组)和干扰组(SiHa/MTDH shRNA组)中表达无差异,2Gy的X-ray放疗后24个小时,转染空载体组(Silla/shRNA Vector组)中Bcl-2表达上调,而干扰组(SiHa/MTDH shRNA组)中Bcl-2表达水平与放疗前相当。(4) MTDH增强SiHa细胞修复放疗引起的DNA双链断裂的能力：0.5Gy的X-ray放疗后,转染空载体组(SiHa/shRNA Vector组)中γ-H2AX焦点持续时间短,放疗后4小时几乎完全消失,而干扰组(SiHa/MTDH shRNA组)中γ-H2AX焦点在放疗后8小时仍存在。(5)降调MTDH后ku70表达下调：干扰组(SiHa/MTDH shRNA组)中ku70的表达水平低于转染空载体组(SiHa/shRNA Vector组),放疗后这利,差异更明显,而ku86, DNA-PKcs, Rad51的表达水平在两组间无差异。[结论及意义]降调MTDH增加宫颈癌细胞对放疗的敏感性的可能机制包括：(1)降调MTDH减少放疗引起的G2期阻滞。(2)降调MTDH增加放疗引起的凋亡。(3)降调MTDH降调Ku70的表达、减弱SiHa细胞修复DNA双链断裂(DSBs)的能力。
杨扬[5]2012年在《食管鳞癌细胞抗失巢凋亡UBCH7基因的筛选与鉴定》文中提出目的食管鳞癌是人类十大恶性肿瘤之一，其死亡率居我国恶性肿瘤死因第四位。失巢凋亡是内皮及上皮细胞脱离细胞外基质发生细胞凋亡的一种特殊的死亡形式，细胞获得抵抗失巢凋亡能力是肿瘤细胞发生远处转移的前提条件之一。虽然一些研究提示，Maspin、SKP2、xCT、PTTG1、TM4SF3、ECRG2、CTTN和CyclinB1等基因表达的改变可影响ESCC细胞在体内的致瘤及转移能力，本课题组前期在食管磷癌研究中也已发现多个抗失巢凋亡相关的癌基因，尽管这些基因都可参与食管鳞癌细胞失巢凋亡抗性的调节，但它们是通过不同的信号通路发挥作用，这些结果显示食管鳞癌细胞中存在复杂的信号网络以适应宿主微环境，从而赋予食管鳞癌细胞更强的转移潜能。本实验主要目的是在食管磷癌中寻找更多与抗失巢凋亡相关的基因，以进一步阐明食管鳞癌细胞转移的分子机制，开发有效的诱导肿瘤细胞失巢凋亡的策略，从播散环节阻止肿瘤发生远处转移，有可能成为预防和控制肿瘤扩散的一条有效途径。方法采用逆转录病毒文库功能筛选的手段，首先构建食管磷癌细胞系的逆转录病毒文库，并感染对失巢凋亡较敏感的NIH3T3细胞，利用感染病毒cDNA文库中混合细胞系进行软琼脂集落形成实验，挑取出在悬浮条件下仍可生长形成较大集落的细胞单克隆（即潜在具有抵抗失巢凋亡能力的细胞），最后通过逆转录病毒载体特异引物PCR扩增失巢凋亡抗性克隆基因组中的外源插入片段，在食管癌细胞系cDNA文库中获得潜在的具有失巢凋亡抗性的基因。结果发现经食管癌逆转录病毒cDNA文库感染的NIH3T3细胞经软琼脂悬浮培养后，大部分克隆形成的多个抗失巢凋亡集落与感染pMSCV-GFP的NIH3T3细胞形态有明显差别，挑取直径明显大于对照组的克隆细胞，将获得的失巢凋亡抗性克隆扩大培养，提取基因组DNA，采用逆转录病毒特异性的pMSCV5’和pMSCV3’引物，扩增靶细胞基因组中的外源插入片段，结果显示亲本NIH3T3细胞组未扩增出产物，感染pMSCV-cDNA的靶细胞组扩增了食管癌混合cDNA文库中各种长度的cDNA。经测序和数据库比对，发现其中一个克隆整合有UBE2L3/UBCH7基因。为验证逆转录病毒文库功能筛选实验的准确性，我们利用携带pMSCV-UBCH7的逆转录病毒感染NIH3T3细胞，在NIH3T3中高表达UBCH7基因，发现可显着增强NIH3T3细胞抵抗失巢凋亡能力；与此同时,以具有高转移潜能、高失巢凋亡抗性、且高表达UBCH7蛋白的MLuC1食管癌细胞系作为模型，利用两个特异性siRNA序列分别敲降MLuC1细胞中UBCH7，发现降调UBCH7表达后，导致MLuC1细胞抗失巢凋亡能力显着降低。结论通过逆转录病毒cDNA文库筛选鉴定到的UBCH7是一个与食管磷癌失巢凋亡抗性相关的基因。
王博石[6]2012年在《非经典蛋白激酶PKC_ι在食管鳞癌中的作用机制研究》文中研究表明我们在前期工作中发现非经典蛋白激酶PKCι (Protein Kinase C iota, PKCiota)在食管鳞状细胞癌(ESCC,以下简称食管鳞癌)中存在DNA水平的基因拷贝数扩增和蛋白水平的高表达。然而,PKCι在食管鳞癌细胞中的作用机制尚不清楚。在本项研究中,我们发现利用RNAi技术降调食管鳞癌细胞系PKCι的基因表达引起细胞凋亡,同时降调(3-catenin蛋白水平；在PKCι表达被敲降的细胞中回复β-catenin蛋白的表达,可阻止降调PKCl引起的细胞凋亡。说明PKCι通过β-catenin调控食管鳞癌细胞的生存。此外,我们还发现降调PKCι通过增加细胞内的活性氧物质水平(ROS),增强食管鳞癌细胞的自噬水平。进一步的研究发现PKCι对β-catenin蛋白稳定性的调控与细胞自噬相关：降调PKCι引起的β-catenin表达水平降低可以被自噬抑制剂所逆转；自噬诱导剂可引起β-catenin蛋白水平降低；在自噬诱导剂存在的条件下,高表达PKCι蛋白阻止自噬诱导剂引起的β-catenin蛋白降解。免疫沉淀实验证明降调PKCι能够增加多聚泛素化修饰的β-catenin蛋白,并增强β-catenin与自噬受体蛋白LC3的相互作用,从而促进β-catenin的自噬降解。在食管鳞癌肿瘤组织中检测发现,PKCι蛋白的表达水平与β-catenin和经典的自噬底物p62蛋白的累积正相关,说明PKCι在食管鳞癌组织中高表达与自噬水平的降低有关。为深入研究PKCι对β-catenin蛋白的自噬依赖性调控,我们通过GST-pull down技术寻找到一个与PKCι和LC3相互作用的蛋白Hsc70。分析发现Hsc70与p62和β-catenin也存在相互作用关系,构成β-catenin蛋白自噬降解复合物,证明了PKCι对β-catenin的调控依赖于Hsc70。在PKCι降调的食管鳞癌细胞系中,泛素E3连接酶RNF111蛋白水平增加,而且RNF111与p62、Hsc70、β-catenin存在于同一复合物中,其负责促进β-catenin的多聚泛素化。降调PKCι引起的β-catenin降解也依赖于RNF111。我们还发现PKCι以自噬依赖的方式调控下游分子VPRBP和DDEF2。本项研究揭示了癌蛋白PKCι在食管鳞癌细胞中新的作用通路,为阐明食管鳞癌的分子机制提供了新的依据,并为食管鳞癌分子诊断标志和药物靶点的筛选提供了新的线索。
刘复兴, 王明荣, 徐昕, 韩亚玲, 蔡岩[7]2006年在《食管鳞癌FHIT蛋白表达的免疫组化分析》文中研究指明目的FH IT基因是食管鳞癌候选肿瘤抑制基因,本研究旨在探讨FH IT蛋白在食管鳞癌中的变化。方法用免疫组化SABC法分析了65例食管鳞癌及对应癌旁组织FH IT蛋白表达。结果FH IT蛋白在食管癌和癌旁的表达并无显着差异。结论食管癌中FH IT癌蛋白表达的变化与基因改变的变化并非一致。一部分食管癌FH IT基因表达降调则可能要归因于表遗传机制。
邓友平[8]1998年在《叁氧化二砷（As_2O_3）抗癌作用及其细胞和分子机制的研究》文中认为叁氧化二砷(As_2O_3)是我国传统中药砒石的主要成分。近年来发现，As_2O_3对急性早幼粒白血病(APL)具有非常显着的疗效，并且对全反式维甲酸(ATRA)或常规化疗药物耐药的病人仍然有效。初步的机制研究表明As_2O_3能诱导APL细胞凋亡，并与降低Bc1-2的表达以及调节PML／PMLRARα蛋白有关。鉴于大多数恶性肿瘤为非血液系统肿瘤，为了探讨As_2O_3是否对血液系统以外的肿瘤，也有一定的作用，本文着重探讨了As_2O_3对血液系统以外肿瘤的体内外生物学作用及其细胞和分子机制，结果显示： 1．As_2O_3能明显延长白血病L1210和肝癌腹水小鼠的生命，抑制小鼠肉瘤S180的生长。As_2O_3对昆明小鼠腹腔注射的急性毒性为10.339mg／kg；结合手术治疗，As_2O_3对小鼠L795肺腺癌远地转移抑制作用可达81.8％。 2．MTT结果显示As_2O_3对多种人肿瘤细胞系的生长和存活具有显着抑制作用，且表现为时间和剂量依赖关系，而且在低剂量下效果已比较明显。IC_(50)比较分析显示不同肿瘤细胞系对As_2O_3作用的敏感性依次是人胃腺癌MGC803＞胃腺癌SGC7901＞肺腺癌GLC-82＞食管癌Ec8733＞食管癌Ec109细胞。
张果[9]2005年在《锌指转录因子GKLF作为抑癌基因的相关功能的初步研究》文中研究说明恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，是当前全人类所面临的一个非常严峻的问题。肿瘤的发生发展往往涉及原癌基因的异常活化和抑癌基因的失活，进而引起细胞信号传导的异常。 无论是正常细胞，还是癌细胞，均需获得各种信号以维持其生命活动过程。而各种生理信号激活相应的细胞信号传导通路的结果，通常是在转录水平对靶基因的表达进行调控。由于癌细胞的生物学特性，它的信号传导通路和基因转录调控往往更为复杂。各种转录因子的活性对于基因转录调控具有重要作用。因此，积极展开转录因子功能与调控方面的研究，不仅能够诠释信号传导通路的作用机制，更为重要的是，将有助于人们更深入地认识肿瘤的本质，从而为肿瘤的预防、诊断和治疗提供理论基础。 GKLF(Gut-enriched Kruppel-Like Factor)是在1996年由Yang和de Crombrugghe所在的两个研究小组几乎同时发现的KLF家族(Kruppel-Like Factor)C_2H_2型锌指转录因子，由于其在胃肠道呈现高丰度表达，故而得名。人GKLF基因定位于染色体9q31，编码一个由470个氨基酸构成的蛋白质。GKLF蛋白的C端是锌指结构域，主要参与DNA结合；在锌指区之外，GKLF具有转录活化和抑制结构域，因此具有转录活化和抑制两种功能。 对发育过程中GKLF基因表达谱所进行的分析表明，GKLF很可能参与对细胞增殖和分化的调节。已有的资料还显示，GKLF在大肠癌、膀胱癌和胃癌中表达下调；但在乳腺癌中表达增加。与之相对应的体外实验，在大肠癌、膀胱癌和胃癌细胞系中异位表达GKLF能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡；但在乳腺癌细胞系中过表达GKLF却能够促进细胞转化。 尽管已经有了比较广泛的研究，但是关于GKLF蛋白的功能，目前依然知之甚少。首先，关于GKLF蛋白水平在食管鳞癌中可能存在的异常还没有相关报道。其次，对于GKLF在食管上皮细胞中的作用也没有系统的研究。另外一个重要的问题是，已有的研究主要关注其对细胞增殖的影响，而对于其在细胞凋亡中的作用机制，至今尚未见相关报道。 针对这些问题，我们进行了相关的工作，结果如下： 1．检测了食管鳞癌组织中GKLF的mRNA和蛋白的表达状况。RT-PCR结果显示，
王文双[10]2012年在《Twist与卵巢癌侵袭、转移及上皮间质转化的相关性研究》文中提出研究背景转移是一个复杂的多步骤过程,卵巢癌极易发生盆腹腔内侵袭播散转移,因此,如何更好地抑制癌细胞侵袭、转移成为卵巢癌临床治疗和基础研究的热点和难点。上皮间质转化,即上皮细胞从有极性的上皮表型转变为高度运动性的纤维母细胞样或间叶性表型,在早期胚胎发生中发挥重要作用。体外及体内研究均表明,上皮间质转化在上皮性肿瘤的浸润播散过程中发挥作用,上皮间质转化机制在上皮性肿瘤的进展、浸润、侵袭转移中得以激活,是上皮来源的肿瘤细胞获得侵袭性的关键分子事件,在恶性肿瘤的发展及转移播散过程中发挥主要的病理作用。生化方面,细胞上皮性标志物如E-cadherin的表达转变为间质性标志物如N-cadherin的表达为标志。Twist基因最初在果蝇的胚胎发育研究中发现,可调节细胞移动和组织重建,诱导中胚层发育。目前研究证实Twist基因与上皮间质转化现象及肿瘤转移密切相关,是上皮间质转化过程的关键调控因子,在肿瘤的侵袭转移过程中起重要的作用。目前有关Twist在卵巢癌的发生、发展及上皮间质转化、侵袭转移中的作用尚无深入研究。本课题分两部分内容来研究Twist基因在卵巢癌发生、发展及上皮间质转化、侵袭转移中的作用。第一部分研究目的检测卵巢癌组织中Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白和mRNA的表达,探讨Twist与卵巢癌临床病理特征的关系,及其与E-cadherin和N-cadherin表达相关性。研究方法1.采用免疫组化方法检测54例卵巢癌组织和54例正常卵巢组织中Twist、上皮性标记基因E-cadherin及间质性标记基因N-cadherin蛋白的表达,比较卵巢癌组织和正常卵巢组织中这叁个指标的表达情况；分析Twist、 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达与卵巢癌临床分期、分化程度及淋巴结转移的相关性；分析卵巢癌组织中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达与Twist蛋白表达的相关性。2.采用RT-PCR法检测54例卵巢癌组织和54例正常卵巢组织中Twist、E-cadherin和N-cadherin mRNA的表达,比较卵巢癌组织和正常卵巢组织中的Twist、E-cadherin、N-cadherin mRNA的表达情况。结果1.卵巢癌组织中Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白阳性表达率分别为68.5%、27.8%和48.1%,正常卵巢组织分别为25.9%、85.2%和14.8%,这叁个指标在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达,差异均有统计学意义(P均<0.05)。2.中低分化、晚期、有淋巴结转移的卵巢癌组织中Twist表达高于高分化、早期、无淋巴结转移的卵巢癌；中低分化、晚期、有淋巴结转移的卵巢癌组织中E-cadherin表达低于高分化、早期、无淋巴结转移卵巢癌；中低分化、晚期、有淋巴结转移的卵巢癌组织中N-cadherin的表达高于高分化、早期、无淋巴结转移的卵巢癌,差别有统计学意义(P均<0.05)。3.Twist、E-cadherin及N-cadherin mRNA在卵巢癌组织中的表达量(光密度比值)分别为,1.49±0.53、0.82±0.24、1.55±0.56。正常卵巢组织中,分别为1.14±0.38、1.08±0.19、1.14±0.32。上述各项指标在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达相比,差异均有统计学意义,P均<0.05。4.卵巢癌组织中,37例Twist表达阳性的卵巢癌组织中E-cadherin表达缺失者33例；而在Twist阴性表达的17例卵巢癌组织中E-cadherin表达缺失达者6例,相关分析结果提示卵巢组织中E-cadherin的表达与Twist表达呈负相关,r=-0.56。37例Twist表达阳性的卵巢癌组织中N-cadherin表达阳性者23例；而在17例Twist表达阴性的卵巢癌组织中,有3例N-cadherin表达阳性,相关分析结果提示卵巢癌组织中N-cadherin表达与Twist表达呈正相关,r=0.41。结论1.在卵巢癌组织中,Twist蛋白和mRAN表达上调,提示Twist基因与卵巢癌的发生有关；2.卵巢癌组织中Twist表达上调的同时,上皮性标记E-cadherin表达下调,同时间质性标志N-cadherin表达上调,提示Twist可能与卵巢癌中的上皮间质转化有关。3.卵巢癌组织中Twist、N-cadherin高表达和E-cadherin低表达与卵巢的期别晚、分化程度差及淋巴结转移有关,提示Twist及与其可能相关的上皮间质转化与卵巢癌的进展有关。意义应用免疫组化和RT-PCR方法检测了卵巢癌组织中Twist、E-cadherin和N-cadherin蛋白和mRNA的表达,为进一步研究Twist与卵巢癌侵袭转移及上皮间质转化的关系奠定了基础。研究目的应用RNA干扰(RNAinterference, RNAi)技术,沉默Twist基因,观察卵巢癌细胞体外增殖、侵袭、粘附特性的变化以及上皮性标记E-cadherin、间质性标志N-cadherin表达的改变,探讨Twist基因在卵巢癌上皮间质转化过程中的作用。研究方法1.利用pGenesil2真核表达载体构建两对含高效的靶向Twist基因的重组载体pGenesil2-Twist shRNA1和pGenesil2-Twist shRNA2,并对重组载体进行酶切鉴定和测序。2.将pGenesil-2Twist shRNA质粒转染人卵巢癌A2780细胞,转染后24h、48h和72h收集细胞用荧光显微镜分别测定转染效率和观察转染情况。根据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表达后发绿色荧光的特点,在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,计算质粒转染效率。3.采用Western-blot方法分别检测正常对照组,阴性对照组(本质粒中插入的片段与干扰质粒的干扰片段碱基构成相同,而顺序不同,且与基因库中没有任何同源序列),和Twist shRNA质粒转染组细胞中Twist蛋白的表达情况,分析转染pGenesil-2Twist shRNA质粒后人卵巢癌A2780细胞Twist蛋白表达的变化。4.采用RT-PCR方法检测正常对照组,阴性对照组,和Twist shRNA质粒转染组细胞Twist mRNA的表达情况,分析转染pGenesil-2Twist shRNA质粒后人卵巢癌A2780细胞TwistmRNA表达的变化。5.采用MTT法检测Twist shRNA质粒转染后人卵巢癌A2780细胞与正常对照组、阴性对照组的卵巢癌细胞的的增殖情况,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞增殖能力的影响。6.通过Transwell小室法侵袭实验,检测转染Twist shRNA质粒组、正常对照组和阴性对照组卵巢癌细胞的侵袭能力,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞增殖能力的影响。7.采用粘附实验检测转染shRNA质粒组、正常对照组和阴性对照组卵巢癌细胞的粘附情况,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞粘附能力的影响。8.采用RT-PCR方法检测转染shRNA质粒转然组、正常对照组和阴性对照组卵巢癌细胞中E-eadherin和N-cadherin的mRNA表达,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞的E-eadherin和N-cadherin mRNA表达的影响。9.Westemblot技术检测转染shRNA质粒转染组、正常对照组和阴性对照组细胞中E-eadherin和N-cadherin的蛋白表达,分析pGenesil-2Twist shRNA质粒转染对于人卵巢癌A2780细胞的E-eadherin和N-cadherin蛋白表达的影响。结果1.重组载体pGenesil2-Twist shRNA1和pGenesil2-Twist shRNA2经酶切鉴定和测序,结果显示两对重组载体pGenesil2-Twist shRNA均构建成功。2.转染成功的卵巢癌细胞在显微镜下可以观察到绿色荧光(GFP),转染Twist shRNA质粒24h的卵巢癌A2780细胞的转染效率为70%以上,转染Twist shRNA质粒48h的卵巢癌A2780细胞的转染效率为80%以上。3.RT-PCR测定转染pGenesil2-Twist shRNA质粒48h后Twist mRNA的表达结果显示,Twist扩增产物(455bp)与内参照GAPDH的比值在正常对照组、阴性对照组、shRNA1转染组和shRNA2转染组分别为(1.04±0.028)、(1.10±0.026)、(0.38±0.033)和(0.51±0.029),阴性对照组和正常对照组比较差异无显着性(P>0.05), shRNA1、 shRNA2重组质粒转染组与正常对照组和阴性对照组比较差异有显着性(P<0.05)。 shRNA1质粒转染对Twist mRNA的干扰效率为65%, shRNA2质粒转染对Twist mRNA的干扰效率为56%。4.Western blot检测正常对照组和阴性对照细胞组的Twist蛋白表达明显高于转染shRNA1、shRNA2质粒细胞组的蛋白表达水平,差异具有显着性(P<0.05),其中转染shRNA1质粒组蛋白表达水平最低,与RT-PCR检测结果一致,之后应用shRNA1质粒进行后续实验。5.MTT法检测卵巢癌细胞的增殖结果显示,在转染后24h、48h和72h,Twist shRNA质粒转染组A2780细胞数与正常对照组和阴性对照组相比没有明显差异(P>0.05)。6.Transwell小室法侵袭实验结果显示,与正常对照组、阴性对照组相比,转染Twist shRNA质粒组侵袭细胞数明减少(P<0.05)。而正常对照组和阴性对照组之间相比,侵袭细胞数无统计学差异(P>0.05)。7.粘附实验结果表明,和正常对照组和阴性对照组比较,转染组细胞的粘附能力明显降低(*P<0.05)。8.RT-PCR和Western-blot方法检测转染Twist shRNA质粒组中E-cadherin的mRAN和蛋白表达较正常对照组和阴性对照组明显升高(P均<0.05),N-cadhein的的表达较正常对照组和阴性对照组明显降低(P<0.05),而正常对照组和阴性对照组中E-cadherin和N-cadhein的表达无明显差异(P均>0.05)。结论1.抑制人卵巢癌A2780细胞中Twist基因的表达,不影响卵巢癌细胞的体外增殖能力,但可降低卵巢癌细胞体外侵袭能力及与基质之间的粘附能力。2.抑制人卵巢癌A2780细胞中Twist基因的表达,可抑制卵巢癌细胞的上皮间充质转化。3.在卵巢癌上皮-间质转化及侵袭转移过程中Twist可能发挥重要作用,意义本研究应用RNAi技术抑制了卵巢癌细胞中Twist基因的表达,从而抑制了卵巢癌细胞的侵袭转移和上皮间质转化,为卵巢癌治疗提供了一个新靶点。
参考文献：
[1]. 食管癌表达降调基因的研究[D]. 陈宝生. 中国协和医科大学. 2002
[2]. PTPN1促进食管癌细胞侵袭运动的分子机制研究[D]. 潘蓓青. 北京协和医学院. 2016
[3]. 中国北方食管鳞癌杂合性丢失的研究[D]. 黄晓平. 中国协和医科大学. 2003
[4]. MTDH对宫颈癌生物学行为及化疗、放疗敏感性的影响及机制研究[D]. 赵颖. 山东大学. 2012
[5]. 食管鳞癌细胞抗失巢凋亡UBCH7基因的筛选与鉴定[D]. 杨扬. 安徽医科大学. 2012
[6]. 非经典蛋白激酶PKC_ι在食管鳞癌中的作用机制研究[D]. 王博石. 北京协和医学院. 2012
[7]. 食管鳞癌FHIT蛋白表达的免疫组化分析[J]. 刘复兴, 王明荣, 徐昕, 韩亚玲, 蔡岩. 咸宁学院学报(医学版). 2006
[8]. 叁氧化二砷（As_2O_3）抗癌作用及其细胞和分子机制的研究[D]. 邓友平. 中国协和医科大学. 1998
[9]. 锌指转录因子GKLF作为抑癌基因的相关功能的初步研究[D]. 张果. 中国协和医科大学. 2005
[10]. Twist与卵巢癌侵袭、转移及上皮间质转化的相关性研究[D]. 王文双. 山东大学. 2012
标签：肿瘤学论文; 食管癌论文; 肿瘤论文; 宫颈癌论文; 对照组论文; 食管肿瘤论文; 基因合成论文; 细胞转染论文; 质粒载体论文; 癌症论文;