舒茂国[1]2002年在《机械应力促进培养的人皮肤成纤维细胞增殖的相关研究》文中进行了进一步梳理目的 建立机械牵拉培养细胞模型；探讨人皮肤成纤维细胞在体外应力牵拉作用下增殖特性的改变；研究单次较大幅度的机械应力(40％的延长度)作用下细胞增殖核抗原表达与细胞外基质分泌的情况；探讨TGFβ_1、bFGF在应力作用下的表达状况。通过实验，模拟临床常用的皮肤软组织扩张术应力刺激细胞增殖的效应，利用体外细胞培养模型，在分子水平研究应力作用于皮肤成纤维细胞并促进细胞增殖的机理，同时验证自行研制的机械应力刺激细胞培养模型的可行性，为以后更深一步研究皮肤扩张术应力刺激细胞增殖的机理建立一种新的实验研究方法。方法 实验第一部分为机械牵拉细胞培养模型的设计与制作，根据国外报道常用的机械牵拉细胞培养模型的原理，结合皮肤扩张术和牵张术的临床应用特点，自行设计并制作出机械牵拉细胞培养模型；取植皮术中剩余的全厚皮，常规原代培养皮肤成纤维细胞，取3-5代的成纤维细胞种植于模型的弹性膜上继续培养。采用牵拉变形40％为本实验用的延长度。实验第二部分分为对照组(未牵拉组)与实验组(不同时间点的牵拉组)，分别于牵拉前、12h、24h、36h、48h、60h、72h时间点后，计数每个时间点的细胞数，绘制生长曲线；利用MTT法检测细胞的增殖情况；利用流式细胞仪测定牵拉后细胞周期改变的特点；同时取牵拉48小时组与对照组细胞，经过细胞计数、蛋白定量后行WESTERN-BLOT检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。实验第叁部分采用MTT法测定条件培养液刺激皮肤成纤维细胞增殖的情况；WESTERN-BLOT方法检测牵拉后12h、24h、36h、48h、72h不同时间点TGFβ_1、bFGF的表达情况。实验第四部分取牵拉48小时组与对照组细胞，利用细胞甩片机制成细胞涂片，免疫组化染色，检查Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达。结果：经过反复设计、调整、最终研制成功了牵拉细胞培养模型，该模型具有价格便宜、制作方便、操作简单、消毒可靠、培养过程中观察容易等优点。人皮肤成纤维细胞在模型中生长状态良 第。军医大学项士学住论文好，细胞形态与正常比较未见明显差异。通过对牵拉后不同时间点的细胞增殖数量的检测，证实牵拉后细胞的数量较对照组明显增加；利用流式细胞仪检测牵拉前后不同时间点细胞周期的变化，发现牵拉36小时后S期细胞比例达到最高：而蛋白电泳的方法亦证实牵拉后48小时P＊＊A的表达阳性而对照组阴性。利用牵拉48小时后模型中培养细胞的上清液作用常规培养的成纤维细胞的条件培养液，结果证实牵拉后的条件培养上清液能明显刺激细胞增殖；利用蛋白电泳的方法比较牵拉后不同的间点TGFpl、bFGF的表达，发现牵拉48小时后两者的表达较未牵拉时明显增加。利用免疫组化的方法检测发现牵拉后48h、Ill型胶原蛋白的表达增加。结论：人皮肤成纤维细胞在牵拉细胞培养模型中生长良好，单次较大幅度的机械应力刺激能改变细胞周期，刺激PCNA的表达，促进细胞增殖，使 TGF PI、bFGF的表达增加，同时导致 1、Ill型胶原蛋白的合成增加。
付思祺[2]2013年在《皮肤组织扩张与细胞牵拉培养对表皮细胞生长及表达硫氧还蛋白影响的实验研究》文中认为目的建立充分模拟皮肤组织扩张过程的贴壁细胞机械牵拉培养体外模型；研究不同牵拉方式对表皮细胞增殖的影响。研究皮肤组织扩张与细胞机械牵拉对表皮细胞表达硫氧还蛋白(thioredoxin, TXN)的影响。质粒转染人永生化表皮细胞HaCat细胞使其过表达TXN,探讨TXN对细胞增殖的影响。一方面为研究人皮肤组织扩张术的分子机制提供新的线索；另一方面,将TXN作为新的潜在的分子靶点,为研究TXN的转基因治疗用于加快组织扩张速率提供新的实验证据。方法1、选取额部扩张器的患者,在附加切口分别取张力最大处扩张皮肤组织和邻近颞侧正常皮肤组织,分离出表皮层,利用Real Time PCR检测SMC5L1, PTH2_HUMAN, CKLF, TXN, S100B, TGIF2, SNAI2, PPP1R3C在mRNA水平的表达,利用免疫组织化学染色和Western Blot蛋白半定量检测TXN蛋白的表达。2、根据国外报道常用的机械牵拉细胞培养模型的原理,结合皮肤组织扩张术的临床应用特点,自行设计并制作机械牵拉贴壁细胞培养模型；取植皮术中剩余的全厚皮,常规原代培养皮肤成纤维细胞和表皮细胞,取2-5代的细胞种植于模型的弹性膜上继续培养,观察成纤维细胞和表皮细胞在牵拉后细胞排列的差异。为研究不同牵拉方式对HaCat细胞增殖的影响,牵拉实验分为对照组(C,未牵拉组)、实验1组(M1,采用单次最大牵拉40%的延长度)、实验2组(M2,采用渐进式分四次达到最大牵拉40%的延长度,牵拉10%→停留→牵拉20%→停留→牵拉30%→停留→牵拉40%)。分别于牵拉后12h、24h、36h、48h、60h、72h时间点后,计数每个时间点的细胞数,利用MTT法检测细胞的增殖情况。于牵拉后48小时用Western blot蛋白半定量检测表皮细胞系在不同牵拉条件下和非牵拉条件下表达增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的情况。3、采用自制的可调控细胞牵拉培养装置对HaCat细胞实行牵拉培养和无牵拉培养,Western blot蛋白半定量检测牵拉培养实施48小时后TXN蛋白表达情况。4、用质粒pcDNA3.1-hTXN转染HaCat细胞,Western blot蛋白半定量检测转染48h和72h TXN和PCNA的表达。结果1、与前期基因芯片结果一致,定量PCR显示TXN mRNA相对表达水平在扩张皮肤组织和正常皮肤组织中分别为2.01±0.41和1.00±0.00,说明在mRNA水平扩张皮肤表皮层TXN表达较正常皮肤表皮层明显上调,有统计学意义(P<0.05)；TXN在表皮细胞、毛囊细胞和汗腺细胞的细胞核中高表达,扩张皮肤组织和正常皮肤组织中TXN阳性细胞率分别为(59.87±4.2)%和(41.52±8.4)%,扩张皮肤组织中TXN阳性细胞较正常皮肤组织高,有统计学意义(P<0.001)；扩张皮肤组织和正常皮肤表皮层中TXN蛋白表达量分别为1.48±0.24和0.65±0.14,显示扩张皮肤组织较正常皮肤组织表皮层显着升高,有统计学意义(P<0.05)。2、研制两套牵拉细胞培养模型,一个是置入式牵拉细胞培养装置,该装置既可完成牵拉培养,又可置入普通培养皿,另一个是可控式牵拉细胞培养装置,可对细胞进行大幅度的持续性、渐进性的牵拉。二者方便消毒,易于观察细胞形态。3、对人皮肤成纤维细胞和表皮细胞经牵拉培养发现,牵拉膜上的细胞生长状态良好,细胞沿牵拉方向呈明显极性排列,而未牵拉的皿内细胞排列杂乱无序。4、与对照组(C组)相比,渐进牵拉组(M2组)和单次牵拉组(M1组)的细胞数目均增加,在48h处达到高峰；牵拉48h后,台盼蓝计数法结果显示叁组的细胞数分别为(1.65±0.46)×105、(2.36±0.35)×105和(2.08±0.43)×105；MTT法结果显示叁组的细胞吸光值分别为1.765±0.065、2.866±0.205和1.986±0.033。与C组相比,M2组细胞数增加明显,有统计学意义(P<0.05)。5、比较不同牵拉方式作用48h后HaCat细胞表达PCNA蛋白的情况,正常组(C组)、渐进牵拉组(M2组)和单次牵拉组(M1组)中PCNA表达量分别为3.29±0.21、7.49±0.34和3.98±0.18,M2组与C组比较PCNA表达明显增加,有统计学意义(P<0.05)；M1组与C组比较PCNA表达有所增加,无统计学意义(P>0.05)。6、比较机械应力牵拉培养48h后HaCat细胞表达TXN蛋白的情况,渐进式牵拉组(M组)较非牵拉组(C组)HaCat细胞表达TXN蛋白高,M组和C组中TXN表达量分别为0.79±0.09和0.14±0.05,M组与C组比较TXN表达明显增加,有统计学意义(P<0.05)。7、将pcDNA3.1-hTXN质粒转染HaCat细胞,对照组、48h组和72h组TXN表达量分别为0.009±0.0003、0.048±0.0020和0.068±0.0110,对照组、48h组和72h组PCNA表达量分别为0.029±0.0001、0.076±0.0109和0.091±0.0093。72h组PCNA蛋白水平较C组表达增加明显,有统计学意义(P<0.05),48h组PCNA蛋白较C组有所增加,无统计学意义(P>0.05)。说明TXN的过表达会导致PCNA的表达增加。结论1、TXN在表皮细胞、毛囊细胞和汗腺细胞的细胞核中高表达,扩张皮肤组织表皮层中TXN mRNA和蛋白表达明显高于邻近正常皮肤组织表皮层；2、可调控式牵拉培养装置可对贴壁细胞进行渐进式牵拉,渐进式牵拉方式更能充分模拟体内组织扩张术的过程。3、机械应力可刺激表皮细胞表达TXN增多,TXN可能与机械应力促进细胞增殖有一定关系。4、表皮细胞系中过表达TXN可能促进细胞的增殖,为后续研究组织扩张分子机制和转基因技术加快组织扩张速度提供实验基础。
舒茂国, 郭树忠, 韩岩, 杨力, 张琳西[3]2004年在《机械应力作用皮肤成纤维细胞增殖的相关研究》文中研究说明目的 研究机械应力作用皮肤成纤维细胞增殖效应。方法 自行设计一种新的机械牵拉细胞培养模型 ,原代培养皮肤成纤维细胞 ,取 3～ 5代的成纤维细胞种植在模型的弹性膜上 ,待细胞达到 75 %～ 80 %融合度时 ,实施 4 0 %延长度的机械牵拉 ,检测实验组及对照组 12、2 4、36、4 8、72h时间点的细胞数 ,利用MTT法检测不同时间点细胞的增殖变化 ,同时利用流式细胞仪检测不同时间点的细胞增殖周期。结果 采用 4 0 %延长度的机械牵拉可以明显导致细胞增殖 ,同时 ,代表细胞增殖特性的S期也随机械牵拉发生改变。结论 4 0 %延长度的机械牵拉可以改变细胞的增殖周期 ,导致细胞增殖
舒茂国, 郭树忠, 张琳西, 杨力, 杨清芳[4]2002年在《培养细胞牵拉模型的建立与牵拉后细胞生长曲线的相关研究》文中研究表明目的 :建立一种机械作用细胞培养模型 ,将细胞培养在该模型上 ,验证模型的可行性。方法 :自行设计一种机械牵拉细胞培养模型 ,将 3～ 5代的皮肤成纤维细胞种植在弹性硅胶膜上 ,设计牵拉组与非牵拉组 (牵拉组采用 4 0 %的延长率 ) ,比较牵拉与非牵拉组 12h、 2 4h、 3 6h、 4 8h、 72h细胞数量 ,绘制生长曲线。结果 :细胞在牵拉模型上生长良好 ,4 0 %延长度的牵拉能刺激细胞增殖 ,生长曲线显示牵拉能明显刺激细胞增殖。结论 :细胞在牵拉模型上生长良好 ,牵拉能刺激细胞增殖 ,模型可以用于模拟体外应力刺激细胞效应的实验研究
任科伟[5]2012年在《周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成的机制研究》文中研究说明目的探讨ERK1/2在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用。方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养，0、0.5、1和2小时后采用Western blot检测ERK1/2的表达和磷酸化水平；8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen的基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用ERK1/2特异性抑制剂（PD98059）和针对ERK1/2的shRNA阻断ERK1/2的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。结果周期性机械应力能促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成明显增加，而且ERK1/2的磷酸化水平显着增高，差异均具有统计学意义（p <0.05foreach）。但是，当ERK1/2的活化水平被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均明显降低，差异均具有统计学意义（p <0.05foreach）。结论周期性机械应力能够促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成，在此过程中ERK1/2发挥了重要的信号传导作用。目的探讨PLCγ1和Rac1在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用以及Rac1、PLCγ1和ERK1/2叁者之间的相互关系。方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养，0、0.5、1和2小时后采用Western blot检测PLCγ1和Rac1的表达和磷酸化水平；1小时后采用Rac1GTPase activity assay检测Rac1的活化水平。第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用PLCγ1特异性抑制剂（U73122）和Rac1的特异性抑制剂（NSC23766）阻断PLCγ1和Rac1的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，1小时后采用Western blot检测ERK1/2、PLCγ1和Rac1的表达和磷酸化水平；8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和typeII collagen的基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。结果周期性机械应力能促进PLCγ1和Rac1的磷酸化水平以及Rac1的活化水平均明显增高，差异均具有统计学意义（p <0.05for each）。但是，当PLCγ1的活化水平被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均显着降低，而且ERK1/2的磷酸化水平也明显下降，差异均具有统计学意义（p <0.05for each），而Rac1的磷酸化水平则没有显着改变，差异没有统计学意义（p>0.05）。当Rac1的活化水平被抑制以后，周期性机械应力上调的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均明显降低，而且ERK1/2的磷酸化水平也显着下降，差异均具有统计学意义（p <0.05for each），而PLCγ1的磷酸化水平则没有明显影响，差异没有统计学意义（p>0.05）。结论PLCγ1和Rac1相互平行，共同调控ERK1/2，从而介导周期性机械应力下大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成。目的探讨Src在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用以及Src与Rac1、PLCγ1、ERK1/2之间的相互关系。方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养0、0.5、1和2小时后采用Western blot检测Src的表达和磷酸化水平。第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用Src特异性抑制剂（PP2）和针对Src的shRNA阻断Src的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，1小时后采用Western blot检测ERK1/2、PLCγ1和Rac1的表达和磷酸化水平；8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen的基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8法检测细胞增殖。第叁阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用PLCγ1特异性抑制剂（U73122）和Rac1的特异性抑制剂（NSC23766）阻断PLCγ1和Rac1的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养1小时后采用Western blot检测Src的表达和磷酸化水平。结果周期性机械应力能促进Src的磷酸化水平均明显增高，差异均具有统计学意义（p <0.05for each）。但是，当Src的活化水平被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均显着降低，而且ERK1/2、PLCγ1和Rac1的磷酸化水平也明显下降，差异均具有统计学意义（p <0.05foreach）。当PLCγ1和Rac1的活化水平被抑制以后，周期性机械应力上调的Src的磷酸化水平均没有明显改变，差异均没有统计学意义（p>0.05for each）。结论周期性机械应力下，Src通过调控Rac1、PLCγ1和ERK1/2介导大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成。目的探讨integrinβ1和integrinβ3在周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成中的作用以及integrinβ1与相应信号蛋白之间的相互关系。方法第一阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为加压组和对照组，加压组给予周期性机械应力（200KPa，0.1Hz）刺激，对照组不给于特殊处理。两组细胞分别培养8小时后采用Real-time PCR检测integrinβ1和integrinβ3的基因表达水平。第二阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组分别采用integrinβ1和integrinβ3的功能阻断型抗体抑制integrinβ1和integrinβ3的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养，8小时后采用Real-time PCR检测aggrecan和type II collagen基因表达水平；每天8小时，3天后采用直接计数法和CCK-8检测细胞增殖。第叁阶段，取第二代大鼠软骨细胞，随机分为预处理组和对照组，预处理组采用integrinβ1的功能阻断型抗体抑制integrinβ1的活化，对照组不给予特殊预处理。两组细胞分别在有、无周期性机械应力条件下培养1小时后采用Westernblot检测Src、Rac1、PLCγ1和ERK1/2的表达和磷酸化水平。结果周期性机械应力能促进integrinβ1的基因表达水平明显增高，差异具有统计学意义（p <0.05），而integrinβ3的基因表达水平没有显着变化，差异没有统计学意义（p>0.05）。当integrinβ1被抑制以后，周期性机械应力促进的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均明显降低，而且Src、Rac1、PLCγ1和ERK1/2的磷酸化水平也显着下降，差异均具有统计学意义（p <0.05for each）。当integrinβ3被抑制以后，周期性机械应力上调的软骨细胞增殖和细胞外基质合成均没有明显改变，差异均没有统计学意义（p>0.05for each）。结论在周期性机械应力作用下，integrinβ1通过调控Src、Rac1、PLCγ1和ERK1/2介导了大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成。综上所述，本课题揭示了周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成的信号传导机制，其机制是大鼠软骨细胞膜上的integrinβ1感知了周期性机械应力后激活下游的Src，后者又促进了Rac1和PLCγ1的活化，Rac1和PLCγ1通过调控ERK1/2的磷酸化水平最终介导细胞增殖和细胞外基质合成。简言之，周期性机械应力促进大鼠软骨细胞增殖和细胞外基质合成通过integrinβ1-Src-Rac1/PLCγ1-ERK1/2信号通路。
洪莎莎, 洪莉[6]2013年在《机械力作用于成纤维细胞的研究进展》文中研究指明本文探讨体外培养的各种成纤维细胞在机械力的作用下,细胞骨架、生长方向、细胞增殖、细胞外基质和生长因子发生的变化,以及可能发生的信号传导途径变化。在机械应力作用下,成纤维细胞的形态和骨架发生了规律的改变;细胞的生长方向发生重排,且与力的方向呈垂直趋势;适宜范围内的机械力可以促进细胞的增殖;机械应力的刺激可引起细胞外基质合成增加和多种生长因子的分泌,导致组织适应性改变;而出现这些现象的机制,可能是机械力作用于细胞启动了MAPK、一氧化氮和氧化应激途径。
邱海霞[7]2014年在《周期性机械拉伸对人真皮成纤维细胞增殖及胶原蛋白代谢的影响》文中指出皮肤创面愈合是一个复杂而有序的动态生物学过程,依赖于成纤维细胞与细胞外基质间的相互影响、相互作用。正常生理状态下,人真皮成纤维细胞处于皮肤张力作用下,成纤维细胞的增殖、分化、胶原蛋白代谢及基因表达等生物学过程都与其所处的力学环境有关。了解与调控张力作用下成纤维细胞的生物学行为是促进伤口愈合、提高愈合质量、预防瘢痕异常增生等皮肤疾病及慢性难愈性创面的基础与关键。体外研究周期性机械应力刺激对成纤维细胞生物学行为的影响,有助于进一步了解皮肤创面愈合的生物学机制,为皮肤疾病的治疗方法及评估提供重要参考。本实验通过FX-4000柔性基底应变加载系统对人真皮成纤维细胞进行力学环境培养,研究力学刺激对成纤维细胞增殖及胶原蛋白基质代谢的影响,主要研究内容及结论如下：1.采用胶原酶消化法原代提取与培养人真皮成纤维细胞,以3×104/ml密度接种于裱衬Ⅰ型胶原蛋白的柔性细胞6孔培养板,采用FX-4000柔性基底应变加载系统对人真皮成纤维细胞施加频率为0.1Hz、拉伸幅度分别为10%和20%的周期性机械拉伸,并于拉伸后24h和48h提取细胞mRNA、收集细胞及细胞培养液上清,以无压力培养为静态对照。2.采用流式细胞仪检测细胞周期,分析S期占整个细胞周期的百分比,S期代表细胞增殖特性,S期所占百分比越高,表明细胞增殖越旺盛。实验结果表明：与静态对照组比较,10%拉伸幅度作用24h后,S期占细胞周期的比例显着增高,随着时间的推移,48h,S期占细胞周期的比例降低。成纤维细胞能够对0.1Hz、拉伸幅度10%、拉伸24h的力学刺激作出反应,改变细胞周期,促进成纤维细胞增殖,拉伸48h后反而下降。3.周期性机械拉伸后,提取细胞内总RNA,收集细胞培养液上清,采用实时荧光定量PCR方法研究各组成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达；ELISA方法检测各组上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的浓度。实验结果表明：10%拉伸幅度作用24h、48h及20%拉伸幅度作用24h均可以促进成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达；10%拉伸幅度作用24h、48h均可以促进Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达；10%拉伸幅度作用48h及20%拉伸幅度作用24h、48h均可以促进细胞培养液上清中Ⅰ型胶原蛋白的合成；10%拉伸幅度作用24h及20%拉伸幅度作用24h、48h均可以促进细胞培养液上清中Ⅲ型胶原蛋白的合成。力学刺激能够影响细胞外基质Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的代谢,且与力学刺激的幅度和时间有关。
贾平[8]2003年在《表皮生长因子促进皮肤扩张术组织扩张机理及方法的研究》文中指出目的 本实验试图从细胞生物学和动物实验以及临床实验研究叁个不同的方面，研究表皮生长因子在皮肤扩张术中的作用，以探讨皮肤扩张术中皮肤扩张的机理，为其在临床中的应用提供实验依据。 方法 (1) 利用细胞培养技术，酶消化法原代培养表皮细胞，传至第3-4代，待细胞生长铺满率达60-70％后，将实验分为二组：实验组和对照组，实验组采用细胞负压牵引装置，在250mmHg的压力下，以牵拉3秒，松弛3秒，每分钟循环10次的作用方式下实施牵拉，对照组细胞不受牵拉，连续观察72h，分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h，收集细胞培养液，同时于72h观察表皮细胞在牵拉条件下和非牵拉条件下的生长情况；用ELISA法测定表皮细胞在牵拉条件下和非牵拉条件下分泌EGF的情况；(2) 以猪作为皮肤扩张动物模型，实验分为对照组即外用基质组，用药Ⅰ组即外用EGF霜剂组，外用含不同浓度促透剂的EGF霜剂组即含0.5％促透剂用药Ⅱ组和含1％促透剂用药Ⅲ组，每组在同样扩张条件下于扩张器皮肤表面每日涂抹外用软膏，计算每组皮肤扩张率和扩张囊的注水量，同时对扩张后皮肤组织进行HE染色，观察每组扩张皮肤的组织学变化；(3) 利用免疫组织化学技术ABC法以及Western blotting方法，对人不同扩张皮肤和正常皮肤磷酸化ERK的分布和表达进行测定，并对结果进行图像分析。 表皮生长因子促进皮肤扩张术组织扩张机理及方法研究 结果：（l）在实验组中表皮细胞经72小时牵拉后生长良好，且较密集，可见大量细胞集落，而对照组的细胞己死亡，可见大量的细胞碎片，实验组牵拉36 ’J＼时EGF浓度为16刀3pg／ml，其它时间点未测到，而非牵拉组各时间点均未测出EGF（二）在皮肤扩张率和扩张囊注水量方面，用药＊组和用药＊组明显高于对照组和用药1组，同时HE染色进一步证实用药＊组和用药＊组中皮肤表皮细胞增生明显活跃。（）扩张皮肤和正常皮肛表皮基底层都有磷酸化ERK的表达和分布，但扩张皮肤中的磷酸化ERK的分布和表达较明显，染色较深且密，部分阳性细胞呈多层排列，有散在的增殖团区，通过Western blotting方法，证实扩张皮肤包括胸部及颖部中磷酸化ERK表达高于正常皮肤组织；扩张皮肤的顶部和侧部差别不十分明显，而侧部和顶部与基底部有一定的差别，基底部染色较深，多为细胞核着色；对正常皮肤和不同部位的扩张皮肤以及扩张皮肤的不同部分的相对灰度值和阳性细胞密度的图像分析，进一步证实了上述观察结果。 结论：（）牵拉不但可促进表皮细胞的增殖和生长，而且可能促进表皮细胞分泌 EGF（2）外源性表皮生长因子可促进扩张皮肤的增殖，可明显地提高皮肤的扩张速率；（3）扩张皮肤表皮细胞磷酸化ERK增加，椎测磷酸化ERK可能在扩张皮肤细胞增殖过程中发挥一定的作用，在扩张刺激的作用下，表皮细胞内的Eng被大量激活，随即激活下游分于，进而引起细胞的增殖，最终实现皮肤的扩张。
舒茂国, 易成刚, 韩岩, 杨力, 张琳西[9]2008年在《机械应力刺激对培养的人成纤维细胞分泌生长因子的影响》文中研究指明目的:研究单次持续40%幅度的牵拉作用于人皮肤成纤维细胞后bFGF、TGFβ1的表达,初步探讨机械应力作用下细胞增殖的机理。方法:体外培养人正常皮肤成纤维细胞,将细胞转移至牵拉细胞培养模型中的弹性膜上,待细胞贴壁生长至75%～80%融合时,实施40%单次持续牵拉,用WESTERN-BLOT对非牵拉组与牵拉组24h、36h、48h、72h的细胞bFGF、TGFβ1进行检测。结果:牵拉各组及对照组均呈阳性表达,但牵拉48h后两者的表达较未牵拉时明显增加。结论:单次40%持续的牵拉方式可以促进bFGF、TGFβ1表达,可能是导致细胞的增殖。
申宽宏[10]2013年在《增生性瘢痕TGF-β1/Smad信号转导通路研究》文中提出背景增生性瘢痕是创伤愈合后最常见的并发症之一,是人体对创伤的一种过度的愈合反应导致以成纤维细胞异常增殖、胶原大量合成、胶原过度沉积为组织学特点的皮肤纤维增生性疾病。据统计,国人烧伤后增生性瘢痕的发生率为91.4%,烧伤创面愈合时间若超过2周,增生性瘢痕发生率高达74.67%,远高于国外报道的38.00%。瘢痕形成后影响患者的容貌,并伴有痒痛,而且产生的挛缩可导致不同程度的功能障碍,如肌腱挛缩、关节脱位、运动功能障碍、职业心理障碍等,降低了该类患者的生活质量,为后期治疗带来沉重经济和心理负担。增生性瘢痕的防治研究是一个既古老又新颖的课题。由于发病机制尚未完全阐明,目前其治疗仍是临床上颇为棘手的难题。多年来国内外学者对增生性瘢痕的发生、发展及消退的机理进行了多角度、多层面的深入研究,但直至目前对其机制的研究尚无明确的结论,防治方面也尚无良方,较一致的看法有：①增生性瘢痕主要的效应细胞是成纤维细胞,并以细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为特征；②胶原代谢紊乱是其主要的生物学层面表现；③TGF-β1/Smad信号通路与成纤维细胞的增殖、分化、迁徙、凋亡及胶原代谢等多种生理、病理过程密切相关,Smads根据不同分型,对成纤维细胞胶原代谢具有双向调控作用。压力治疗增生性瘢痕早在400多年前就已有报道,随后众多学者进行多中心、大样本、随机对照临床试验业已证实压力在烧(创)伤后瘢痕的控制和预防中发挥着重要的作用。自70年代开始,压力疗法被广泛医生所接受,并得以推广和应用,目前压力治疗已成为增生性瘢痕的标准和首选治疗方法。但压应力治疗增生性瘢痕疗效都是基于临床经验,目前对压力治疗增生性瘢痕的机理认识还不是十分清楚。已有研究提示瘢痕形成的主要原因之一是成纤维细胞的胶原合成代谢和分解代谢的失衡,而这二者力量的消长及对比可能正是决定伤口愈合和组织重建的关键。压力治疗后创面不长瘢痕或瘢痕萎缩,分析其原因可归纳如下：促瘢痕形成因素水平下降；抑制瘢痕形成因素水平的增高。其中信号通路的调控分为叁个水平：细胞外刺激信号分子作用；细胞内相应传导信号分子传递；靶基因转录、翻译。多年来许多学者的研究结果证实：成纤维细胞生物学行为,尤其是胶原代谢的改变在压力治疗增生性瘢痕过程中起主要作用。既往压应力治疗增生性瘢痕研究往往集中在增生性瘢痕的血供改变上,认为压应力使组织血流淤积,局部缺血或淤血,组织氧分压降低,从而抑制瘢痕的继续增长。然而,对于压应力是通过什么样的机制影响了成纤维细胞的生物学行为及其胶原代谢知之甚少。同时,以往的研究证实TGF-β1可以在转录和翻译水平上诱导MMP-1和TIMP-1的表达对胶原代谢产生影响。结合以往已有研究结果证实创伤后增生性瘢痕组织中TGF-β1呈增高趋势,Smad7较正常皮肤组织含量低,随着瘢痕的成熟组织中Smad7含量明显增高,我们联想到压力治疗增生性瘢痕其机制可能和TGF-β1/Smad信号转导通路中抑制中间分子Smad3的活化或上调smad7有关,进而调节MMPs表达而对胶原合成与降解产生影响。近些年来,研究机械应力作用于活体细胞,观察其受应力作用后的细胞形态、结构、功能状态、增殖、分化及凋亡等各种变化,是细胞生物学研究领域发展十分迅速的研究方法,并已证明机械应力在某些生理和病理过程中起着重要作用。因此,如果以瘢痕形成的效应细胞一成纤维细胞为研究对象,从影响其胶原代谢的Smads动态变化方面着手,以重要信号转导通路TGF-β1/Smads的作用为研究主线,研究压力作用后该通路对成纤维细胞生物学行为及胶原代谢平衡的调控机制,就有可能抓住压力作用促使增生性瘢痕迅速向萎缩性瘢痕发展的关键环节。检索文献少见有关压力干预下细胞因子表达改善成纤维细胞胶原代谢平衡紊乱调节的分子机制研究,本实验首次采用离体压力模拟技术以增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象,通过压力加载系统作用前后细胞内分子环境中Smad3和Smad7基因的表达与胶原代谢之间的动态关系,寻找通路中间分子与胶原代谢改变之间可能存在的压力效应分子；其次利用RNAi技术阻断关键性的中间分子Smad3,观察通路中间分子及胶原代谢的改变,确定信号传导通路中的Smad3分子对瘢痕成纤维细胞胶原代谢的影响；通过上述实验希望获得TGF-β1l/Smad信号通路对胶原代谢平衡的调节分子作用点,为压力治疗增生性瘢痕的部分机制提供有价值的实验依据,进而初步阐明细胞重建机制及信号传导通路调控的力学效应,并丰富相应的理论,为创伤愈合后如何减少瘢痕或无瘢痕的探索开拓新的途径。研究目的：1、为压力治疗增生性瘢痕的部分机制提供有价值的实验依据,初步阐明机械性压应力通过TGF-β通路治疗增生性瘢痕的分子机制。2、初步阐明Smad3基因对增生性瘢痕形成中的作用,进一步完善TGF-β1/smad信号通路在增生性瘢痕中的相关理论,为基因治疗增生性瘢痕提供分子靶点和一定的理论依据。研究方法：1、标本收集、处理12例增生性瘢痕标本及3例正常皮肤标本,年龄20岁到60岁,收集时间为2012年3月至2012年10月,分别来自广东省第二人民医院和广州市红十字会医院,标本的获取均征得病人的同意,签知情同意书。标本入选标准为：A、经临床医生鉴定为增生性瘢痕组织；B、排除垂体、肾上腺疾病、传染病、皮肤病及免疫性疾病患者,排除局部感染、溃疡患者；C、未接受任何治疗。手术室无菌条件下组织切取后,放于无菌的容器中,均于2小时内进行实验。2、体外培养正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞并鉴定在手术室无菌条件下,将切取的新鲜皮肤、增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩组织,4h内带回无菌工作间。将组织转入超净台中,1%双抗的生理盐水反复冲洗,尽量去除血污。眼科剪修除表皮和皮下组织后用反复剪切,使之成0.5～1mm3大小组织块。吸取组织块接种于40m1培养瓶瓶壁上,组织块间留约0.3-0.5cm的间距。密闭培养瓶,放入37℃、5%C02的电热恒温培养箱内3.5h。待培养的组织小块微干涸,取出培养瓶,向瓶底轻轻注入含RPMI1640+15%FBS培养液5m1,然后缓缓翻转培养瓶,让培养液慢慢覆盖附于瓶壁上的组织小块,尽量避免晃动培养瓶。翻转后,置于37℃、含5%CO2的电热恒温培养箱内培养。一周后取出培养瓶,移除瓶内培养液,生理盐水漂洗两次后加含RPMI1640+15%FBS培养液5ml继续培养。以后待细胞萌出后,同样方法每周换液两次。倒置相差显微镜观察其细胞萌出、细胞形态、生长增殖等情况,待原代培养细胞生长基本融合成片时即可常规传代培养,每周换液两次,待细胞融合成单层再次传代。本实验均在第4-8代进行。通过细胞免疫组化a-SMA染色进行细胞鉴定：将细胞培养在清洁灭菌的盖玻片上,经常规固定、脱水、抗原修复、过氧化氢灭活内源性酶,10%山羊血清封闭30min并滴加一抗1：100稀释的a-SMA(1：100稀释)4℃孵育过夜。洗涤3次后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, DAB显色。用PBS代替一抗做阴性对照。显微镜下观察细胞中阳性细胞的百分比。3、机械性压力干预将增生性瘢痕成纤维细胞样本(n=12)分为空白对照组和压力刺激组,每组6个样本。首先将样品加入进行样本孔中,然后按照仪器FX-4000C的说明书,安装压缩平板,并装在压缩系统的夹紧装置上,然后设置系统的参数：33Hz,35mmHg动态性压应力,过夜,24小时后取出细胞培养盘,进行后续实验。本实验全过程均是在特制的37℃,5%CO2的恒温培养箱中进行的。。4、通过GenBank查找TβRⅡ、smad3.smad7、MMP1、MMP2、MMP9、MMP12、Collagen Ⅰ、collagenⅢ基因序列,使用软件Primer-Express5.0进行引物与探针的设计。5、应用荧光RT-qPCR技术检测并比较空白对照组和压力刺激组TGF-β1受体、smad3、smad7、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA表达量。常规Trizol试剂抽提总RNA,并鉴定其浓度、纯度及完整性。取总RNA1μg加入无菌蒸馏水12μl,混匀后65℃孵育5min,随后立即置于冰上；将配置好的变性退火反应液加入到含总RNA的溶液中混匀,在PCR仪上进行PCR反应,所得cDNA置于-20℃保存备用。以cDNA为模板,进行cDNA PCR反应及荧光定量PCR反应,设定cDNA PCR反应条件：预变性95℃3min,变性95℃40s,退火57℃50s,延伸72℃50s,延伸：72℃10min。荧光定量PCR反应条件为：93℃3分钟,然后93℃30秒,55℃45秒,72℃45秒,共40循环。6、将增生性瘢痕成纤维细胞样本(n=12)随机分为空白对照组和smad3阻断组,每组6个样本。应用si RNA技术,取100nmol Smad3si RNA,在核酸转染试剂Lipofectamine2000的介导下转染到增生性瘢痕成纤维细胞中,阻断smad3基因,并应用荧光RT-qPCR技术检测并比较空白对照组和smad3阻断组MMP1、 MMP2、MMP9、MMP12、Collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA表达量。结果：1、空白对照组和压力实验组TPRⅡ、Smad3、Smad7及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的差异性表达：根据荧光RT-qPCR结果,增生性瘢痕成纤维细胞系中压力实验组较空白对照组TGF-β受体表达量增高,Smad3、Smad7、Collagen Ⅰ表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05), collagenⅢ表达两组差异无统计学意义(P>0.05)。2、阻断Smad3基因实验组和空白对照组MMPs和胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ差异性表达。阻断Smad3基因后,增生性瘢痕成纤维细胞系中实验组中MMP2、 MMP9、MMP12表达量较空白组表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05),而Collagen Ⅰ表达量较阻断基因前表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05),两组的MMP1、collagen Ⅲ表达量两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、机械压应力治疗增生性瘢痕可通过TGF-β1/Smad信号转导通路中抑制smad3的表达从而促进Ⅰ胶原的降解,smad3可能是其关键的压力效应分子之一。2.Smad3抑制MMP2.MMP9.MMP12的合成,从而促进增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原的表达,是增生性瘢痕TGF-β1/Smad信号转导通路中关键的促纤维化因子。3.Smad3可能是治疗增生性瘢痕的生物靶点之一。
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[10]. 增生性瘢痕TGF-β1/Smad信号转导通路研究[D]. 申宽宏. 南方医科大学. 2013
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