邵阳市疾病预防控制中心 湖南邵阳 422000
【摘 要】目的：探究实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用价值。方法：从本中心2012年7月至2015年10月接收的流感样病例收集的咽拭子样本中，随机抽取采集时间在发病3天内的标本300份，采用实时荧光RT-PCR进行流感病毒核酸检测，并进行比较两种方法对于流感病毒检测差异。结果：在本次选取的300份标本中，实时荧光RT-PCR阳性检出共84份，阳性检出率为28.00%，通过MDCK细胞培养阳性检出共35份，阳性检出率为11.67%，组间统计学分析具有显著性差异（P＜0.05）。结论：研究表明，实时荧光RT-PCR与细胞培养法对于流感病毒的检测均具有一定的特异性，且前者可以作为流感病毒核酸检测的一种快速有效的手段，并且适用于公共卫生疫情监测实验室诊断，而细胞培养法可以作为流感病毒监测的基础。
【关键词】实时荧光RT-PCR；细胞培养法；流感病毒检测；应用价值
流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒，可引起急性呼吸道传染病-流行性感冒（简称流感）。流感为我国法定的乙类传染病，是国际上第一个实现全球监测的、并且至今无法完全加以控制的一种病毒性急性呼吸道传染病，所以能够有效地分离和鉴定流感病毒已成为流感病毒的监测和临床诊断的前提[1]。临床常采用细胞培养法以及实时荧光RT-PCR对流感病毒进行分离、检测，为进一步探究实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用价值，特进行如下研究：
1 资料与方法
1.1样本来源 从本中心2012年7月至2015年10月接收的流感样病例收集的咽拭子样本中，随机抽取采集时间在发病3天内的标本300份，其中男性164例，女性136例，年龄在3—67岁不等，平均年龄为（43.34±3.43）岁。
1.2器械和试剂 采用的器械主要包括ABI 7500荧光定量扩增仪、二氧化碳培养箱以及倒置显微镜。①PCR：提取试剂 QLAGEN RNeasy Mini Kit，扩增试剂Invitrogen super-Script Ⅲ platinum one-step qRT-PCR，甲、乙型流感病毒核酸检测试剂盒（生产厂家：江苏硕士生物科技有限公司），试剂均在有效期内；②细胞培养：MDCK细胞、抗A（H1N1）、（H3N2）、（SWH1）亚型血清，抗B型Yamagata以及Victoria系病毒血清，胎牛血清等。
1.3方法 ①实时荧光RT-PCR法：对已经采集的咽拭子样本实施检测，参照试剂盒中说明书进行操作，采用QLAGEN RNeasy Mini Kit提取样本，并通过反应体系进行配置，然后采用ABI 7500荧光定量扩增仪扩增。操作条件为：50℃30min、95℃5mi预变性、95℃10s变性、55℃40s退火延伸及检测，55℃收集荧光。反应液为7.5ul，酶混合液为5ul，去RNA酶水为3.5ul，甲、乙型流感反应液为4ul，病毒核酸模板RNA为5ul，总体积为25ul。②细胞培养法：采用无菌移液管将细胞Hank，s液移出细胞培养瓶，然后取适量临床标本置于细胞培养瓶中，然后摇动数次后放置于37℃环境的5%二氧化碳培养箱中1小时，吸出接种物后，采用Hank’s液清洗细胞2遍，然后将病毒生长液放置在细胞培养瓶中，随后进行培养，每天观察细胞的变化，在有75%-100%的细胞发生病变时开始收获，进一步判断流感病毒的亚型。
1.4统计学分析处理 应用统计学软件SPSS18.0对本次研究所得数据进行统计学分析处理；计数资料用χ2检验，用（n，%）表示；P<0.05表示差异有统计学意义。
2.1不同检测方法流感病毒阳性检测以及不同亚型检测结果比较 本次选取的300份样本经过不同检测方法检测后，实时荧光RT-PCR阳性检出共84份，阳性检出率为28.00%，通过MDCK细胞培养阳性检出共35份，阳性检出率为11.67%，组间统计学分析具有显著性差异（P＜0.05）。详细分析结果见下表1：
3 讨论
流感病毒分离鉴定是较为经典的实验室诊断手段，也是流行病学监测的基础，其在流感病毒临床诊治领域也具有重要的指导意义。截止目前，流感病毒分离的主要方法有鸡胚培养法和细胞培养法，并且后者也是流感病毒监测的金标准[2]，且已经成为流感病毒抗原性以及基因特异性、耐药性等方面研究的必要手段[3]。在社会经济迅猛发展的趋势下，荧光PCR等分子生物学技术的出现，让人越发感觉病毒分离培养操作的繁琐，同时耗时也相对较长，并且还需要保证样本中有存活的病毒，对于标本的采集以及运送和保存等方面的要求均较高，这种传统的病毒培养的方式在疫情爆发或者临床急需检测时受到一定的限制[4]。实时荧光RT-PCR技术可迅速、准确的检测流感病毒核酸，有助于分析流感病毒的类型与流行趋势，为预防流感发生提供参考依据。
本次研究中，实时荧光RT-PCR对于流感病毒的阳性检出率显著高于细胞培养阳性检出率（P＜0.05，有显著性差异），这一结果通过以往的临床研究也能得出[5]。实时荧光RT-PCR检测率之所以较细胞培养高，这可能与两者具体的检测对象差异有关。实时荧光RT-PCR主要是针对病毒核酸进行检测，而细胞培养则需要确保有存活的病毒。实时荧光RT-PCR具有直观、重复性好、特异性强、敏感性高和易操作的特点，可动态实时监测核酸产物的形成，因此不管是存活的病毒还是已经降解的病毒，均能检测出。已经有越来越多的研究者表示，可以将实时荧光RT-PCR作为流感疫情爆发或者急需检查情况下流感病毒诊断的重要手段。总之，无论是传统的细胞培养法还是实时荧光RT-PCR对于流感病毒的检测均具有一定的特异性，细胞培养可作为临床流感病毒检测的基础，而实时荧光RT-PCR对于流感疫情爆发时，具有较高的敏感度，两者对于流感病毒的临床监测和诊治均存在一定的价值。
参考文献：
[1]姜红涛，姚秀林.实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较[J].中外医疗，2015，（8）：192-193.
[2]倪语星，尚红.临床微生物学检验[M].第5版.北京：人民卫生出版社.2012.1
[3]杨露露.实时荧光定量 Real-timePCR 和 RT-PCR 技术在流感疫情检测中的作用[J].世界最新医学信息文摘（电子版），2014，（2）：138-138.
[4]张巍巍，张丽荣，胡钰等.3种流感病毒检测方法的比较和应用[J].中国实验诊断学，2012，（9）：1642-1645.
[5]姚秀林.实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用效果观察[J].中国医药指南，2016，（4）：47-48.
论文作者:罗梦花
论文发表刊物:《航空军医》2016年第7期
论文发表时间:2016/6/23
标签：流感论文; 病毒论文; 荧光论文; 实时论文; 细胞培养论文; 阳性论文; 检出论文; 《航空军医》2016年第7期论文;