1.4. 咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院检验科，湖北 咸宁 437100; 4. 湖北蒲纺集团医院）
2.3长沙医学院医学检验系，湖南 长沙410219
【摘要】 目的 探讨泌尿生殖道解脲脲原体（Uu）、人型支原体（Mh）菌落培养的实用方法，通过生化鉴定和菌落的确认，提高Uu、Mh检验质量。 方法用拭子直接划线接种A7平板和培养液直接接种以及孵育后的培养液接种A7平板3种方法培养菌落，同时做生化鉴定。 结果 以Uu、Mh生化鉴定阳性（排除细菌生长）作为比对依据。用培养液直接接种A7平板生长的菌落阳性率最高，75例Uu生化阳性者，49例长出Uu菌落（26例不生长），阳性率 65.3%（49/75）；30例Mh生化阳性者，27例长出Mh菌落，阳性率 90.0%（27/30）。对26例不生长Uu菌落的培养液，用DNA荧光定量法检测，全部>500copies，均为Uu阳性，说明Uu已死亡。 结论 用接种生化药敏条后的余液直接接种A7平板，生化鉴定和观察菌落同步，操作简便易行，可同时验证生化鉴定的结果，优于另外2种菌落培养方法，可作为常规操作推广应用。但是，提高UU菌落的阳性率仍需要进一步的探讨。
【关键词】 解脲脲原体，人型支原体，泌尿生殖道；菌落培养，支原体；方法学
【中图分类号】R874.2【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0422-02
泌尿生殖道解脲脲原体（Uu）和人型支原体（Mh）为快速生长的支原体，它们的人工培养、鉴定已不困难[1]。但是，生化鉴定仅以Uu分解尿素、Mh分解精氨酸为唯一特征，因泌尿生殖道中的一些细菌也分解上述物质，其结果的准确性遭到质疑[2-5]。Uu、Mh菌落有独特的形态，若生化鉴定和菌落特征结合起来，就可以准确的鉴定出Uu、Mh。目前，菌落培养缺少统一要求和操作标准，也未得到检验人员的重视，虽有相关报道[4]，但多数实验室不做菌落培养。为此，我们在生化鉴定的同时，观察了标本直接划线接种A7平板以及培养液直接和孵育后再接种A7平板的3种方法培养菌落，对支原体菌落培养方法进行了探讨，现将结果报道如下。
材料和方法
一.材料：
1.临床标本为本院就诊的妇科门诊病人322人的标本（无重复送检及剔除细菌生长标本），年龄17-45岁，由接诊医生采取宫颈拭子送检。
2.支原体培养、鉴定、计数药敏试剂盒，产品编号42505 R1、R2和R3（试剂条）和支原体A7平板，产品编号43003，为法国梅里埃公司生产。
3.标准菌株：Uu ，ATCC 27813；Mh ，ATCC 23114为本室收藏菌株。
4.试验设备：旋涡混悬器、隔水式恒温培养箱、CO2产气袋、哥伦比亚血平板为商品购进。
5.图像采集系统：联想电脑、奥林巴斯显微镜和JVC图像采集器。
6. Uu DNA荧光定量法检测由广州中山大学达安临床检验中心协助完成。
二.方法：
1. 拭子先“Z”形划线接种A7平板后，再在R1中搅拌洗涤30次，盖好瓶盖，颠倒混合10次后全部倒入R2中，再盖好瓶盖，在旋涡混悬器上混匀120秒，再次颠倒混合10次，静置10分钟后，用无菌吸嘴（需另外高压灭菌）接种液体生化试条（R3，按说明书操作）后，无菌吸取余液20ul滴在A7平板中央处，稍作倾斜，静置30分钟使培养液渗入平板。剩余R2盖好瓶盖，放35℃孵育24h、48h、72h 后分别吸取培养液转种A7平板（同上），观察Uu、Mh菌落。所有试验均标记姓名、检验日期，做好记录。
2.分别吸取Uu （ATCC 27813）和Mh （ATCC 23114）复活菌液20ul，无菌加入R1中，混合后全部倒入R2中，在旋涡混悬器上混匀120秒，接种A7平板以及液体生化试条（同上），验证鉴定结果。
3.已接种的平板底朝上，放入CO2产气袋并封口，折断安瓶后即有气体产生，然后随生化条（R3）和培养液瓶（R2）一起放入35℃恒温箱。定时吸取24h变色的培养液转种A7平板培养菌落，并记录其24h 、48h的生化鉴定结果。菌落也每24h 、48h观察一次，但以48h生长的菌落为统计数据。当孵育48h的生化鉴定与菌落不一致时，二者均延长孵育至72h再观察，记录阳性结果。
4.所有阳性培养液，除外观清晰透明外，均需转种血平板放35℃孵育48 h确认无菌，剔去有污染的结果。
5.菌株存活观察：对24h阳性培养液继续孵育至48h、72h，并分别转种A7平板孵育 ，在24h 、48h观察菌落
6.对直接接种无Uu菌落生长的培养液，取150 ul提取Uu DNA，用DNA荧光定量法检测其Uu DNA含量，以>500copies为阳性（另文报道）。本组试验未对无Mh菌落生长的培养液检测Mh DNA含量。
7.结果判断：按说明书判断生化鉴定结果，并对应地观察平板菌落。在100倍显微镜下，先“Z”形，再“N”形移动平板，观察不留死角，在电脑中保留菌落图片，上述操作由技术熟练人员完成。Uu菌落15-60um，颗粒状，也可见片状生长；Mh菌落200-300um、油煎蛋形 [1]。以孵育48h生化鉴定阳性结果作为Uu、Mh的阳性依据，对应统计平板上生长的Uu、Mh菌落；当Uu、Mh混合生长时分别以Uu、Mh统计菌落阳性百分率。
结 果
1.Uu ，ATCC 27813；Mh ，ATCC 23114复活菌液生化结果典型、相符，在A7平板上生长出菌落。
2.在322例标本中，生化反应有 75例标本Uu 和30例Mh阳性（包括混合阳性）。其中35℃孵育24h，Uu阳性66例，Mh阳性3例；孵育48 h ，Uu阳性增加9例，Mh阳性增加27例，在同样的孵育时间内Uu生化反应早于Mh。不同方法的菌落培养结果分别是: 直接用拭子划线接种A7平板， Uu、Mh分别有40.0%（30/75）、50.0%（15/30）的菌落生长。而培养液孵育24h后转种A7平板不见菌落的阳性率提高，培养液孵育48h转种平板，Uu、Mh菌落阳性率更低，72h转种无Uu菌落生长，Mh菌落生长率降至10%。直接取拭子在培养液中的洗涤液接种A7平板，Uu菌落检出率为65.3%（49/75），，Mh为90.0%（27/30），优于前面二法，见表1。另本组试验无72h菌落阳性结果。
3. 对26份直接接种无Uu菌落生长的培养液，用DNA荧光定量PCR法检测Uu DNA含量，全部>500copies，为阳性结果。其中1份为3.2×105，6份为3.5-9.8×106，19份为1.0-7.7×107。而无颜色变化的培养液和未接种的培养液检测值均<500 copies，说明生化鉴定的75份阳性标本的确为Uu，孵育的培养液阳性无菌落生长与Uu死亡有关。
4.当阳性培养液（排除细菌、念珠菌生长）转种A7平板，即使孵育72h以上仍无Uu / Mh菌落生长，可能死亡。另外，当混合生长的细菌、念珠菌菌落覆盖平板时，会影响Uu、Mh菌落的生长或不生长，最常见的污染菌为大肠埃希菌（可以精氨酸双水解酶阳性）、肺炎克雷伯菌(可以尿素阳性)和白色念珠菌。在生化鉴定条中仅阳性质控孔变红，其他孔不变色的培养液，培养出念珠菌。
5. Mh菌落密集生长时，其形态特征不典型，多为“油煎蛋” 的“蛋心”，只有在稀少处的菌落形态大而典型；而密集生长的Uu菌落有时生长成片，Uu、Mh在各自平板上会有大小悬殊的菌落。另外，陈旧的培养液长出的Mh菌落形态可以怪异，见附图4；Uu、Mh菌落典型形态特征见附图1-附图3。
6.标本直接划线接种平板，上皮细胞与形态不佳的Mh菌落相似需细看，上皮细胞的核比Mh菌落的致密区“蛋心”小。而平板上的颗粒样杂质可能与Uu菌落混淆，但延长培养时间Uu菌落会变大；也可以用脲酶染色法[10]，活Uu菌落呈褐黑色，Mh菌落、杂质不着色；平板中的气泡折光性强，可区别Uu菌落。
讨 论
1.对阳性（红色）培养液转种平板，可发现生长的细菌尿素/精氨酸阳性，也可能因分解培养液中其它的氨基酸、蛋白胨，导致产碱变红。转种平板比观察培养液混浊更准确的发现细菌或念珠菌，特别是念珠菌生长时混浊不明显。生长的细菌时会导致难以解释的结果。当仅有念珠菌生长时，可出现仅培养液瓶或阳性对照孔变红，而鉴定孔不变色。本次统计数据剔除了有细菌和酵母样菌生长者。由技术熟练人员在100倍显微镜下以“Z”形和“N”形移动平板，观察不留死角，有时，培养液阳性，而整块平板仅见到1-2个菌落，很容易漏检。
2.Uu、Mh培养液阳性，但不能100%生长菌落，与Uu过快死亡、极少数Mh在72h生长菌落有关。试验证明，常规的菌落培养方法尚不能完全验证Uu / Mh生化鉴定的结果，特别是Uu。细菌经24h孵育会大量繁殖得到增菌，但是 Uu活株会快速死亡，培养液孵育的活菌数量难以累积，因此，可以解释为什么培养液阳性，而平板上仅生长出1、2个菌落，或者无菌落生长，通常平板上生长的 Mh菌落数量也多于Uu菌落。培养液经35℃孵育48h转种平板Uu菌落明显减少，甚至无菌落生长，说明Uu更易死亡。Uu DNA定量检测进一步证明，培养液阳性在排除细菌生长后可以确定是Uu。生化反应是活的Uu / Mh不断分解尿素/精氨酸产生碱的累积使酚红变色，不会因为Uu/Mh死亡而褪色。目前，Uu、Mh通过孵育增菌尚需改良培养基。文献建议在培养液变色初期及时转种平板[1]，这在实际工作中难以做到，特别是在夜晚，人工观察也不像自动化仪器及时报警和难以及时转种，有必要研制抗死亡的培养基。此外，当标本/培养液中的Uu / Mh 菌量过少时影响菌落的检出，通过对菌量的稀释也证明，培养液变红，而平板上未见菌落。
3. 因培养液中的Uu、Mh会快速死亡，平板上的菌落数量与生化培养液颜色的深浅存在不一致。培养液变色的快慢，或者平板上生长菌落的有或无，可能更好地反映Uu、Mh菌量，可否根据培养液变色的快慢判断致病性有待探讨，若培养液变色快，支原体的数量可能就多。目前，有关Uu、Mh浓度的计数是以颜色改变单位表示（ccu/ml），不像尿液细菌计数直接、准确。由于生化鉴定条中确定Uu、Mh浓度的方法缺少统一、公开的标准，大于104 ccu/ml的培养液菌落数量是否一定比小于104 ccu/ml的培养液多是不确定的，也未见公认的报道。此外，标本难以定量采取是支原体培养、计数缺少重复性和可比性的直接原因。
4 标本中有活的Uu / Mh，就可以在平板上长出菌落，此时培养液不变色，是因为菌量不够、产碱少所致。培养液和平板都存在孵育72h才出现阳性和生长菌落（Mh），以48h判断结果会漏检。孵育24h、48h、72h的鉴定、药敏结果会不一致。提高培养液接种的量以及接种多个平板，在UU / Mh菌量过少时，对提高菌落阳性率可能有帮助。
5 35℃孵育48h是生化鉴定的必要时间，而菌落培养还需要CO2和潮湿环境。在30℃以下（最常见是夜晚停电或孵育箱故障）会明显影响Uu / Mh生长繁殖，比如，一批培养液不变色，应查看孵育箱温度。此外，标本的混匀十分关键，拭子在培养液中随意洗涤未混匀即接种对于生化鉴定、药敏结果和菌落生长都是不规范的，也会导致难以解释的结果。
6..特别指出生化鉴定结果是Uu,而长出Mh菌落（不在此次统计中）。为验证结果，将此生化反应条和平板在35℃孵育延长至120h结果不变，这与Uu鉴定孔中加入林可霉素抑制Mh，当Mh耐林可霉素时，分解复合底物中的精氨酸被误认Uu。同样地解释生化鉴定结果是Mh，而长出Uu菌落，Mh的鉴定孔中加入了红霉素，理论上抑制了对其敏感的Uu，但耐药的Uu生长会分解复合底物中的尿素，产碱使指示剂变红。此外，生化鉴定条为Uu和Mh同时阳性，但只培养出其中的一种菌落，这种情况并不一定是生化鉴定的错误。应以单一的尿素、精氨酸为底物作为唯一鉴定特征，比用抗生素“抑制法”更能避免生化鉴定与菌落的不一致。
7.试验结果表明，虽然用拭子直接接种平板简单，理论上可避免培养液孵育造成的Uu、Mh死亡，因不能保证拭子上的标本一定接种到平板上。而且拭子先接种平板后再接种培养液瓶造成标本不够，会影响生化、药敏结果，即使采取2支拭子，无法保证标本量一致。培养液直接接种与其孵育24h后转中A7平板，菌落的阳性率接近。用接种生化条后的培养液余液接种A7平板，35℃孵育48h，生化鉴定和菌落可同步观察结果，能及时的验证生化鉴定结果，可以作为常规操作步骤推广应用，这也避免了试子先划线接种平板造成培养液中标本不够的影响。在24h后观察到菌落，可提前验证Uu、Mh，但结果报告应以48h为准，因孵育48h的菌落变大，形态更典型，且大部分Mh需要48h才生长出典型菌落。培养液孵育24h后转种，增加操作步骤，未见明显的提高菌落的阳性率。值得注意，支原体的快速死亡，Uu甚之，这导致了验证生化鉴定结果困难。对Uu而言，在培养液变色初期转种平板还有待观察，而个别在72h生长的Mh菌落也需注意，提高Uu菌落阳性率尚待进一步研究。
参考文献
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5．李雪梅，曹海燕，朱利明．探讨支原体液体培养假阳性的原因．实验与检验医学，2008（26）2：189-190
论文作者:程瑞斌1 邹林峰2,马爽3马翔4
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/27
标签：菌落论文; 培养液论文; 平板论文; 阳性论文; 生化论文; 生长论文; 鉴定论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;