（1.黑龙江中医药大学佳木斯学院 黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江中医药大学附属二院 150040）
【摘 要】目的：构建前列腺干细胞抗原(PSCA)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合表达的核酸疫苗，并对其免疫原性进行初步测定。方法：将pVAX1-GM-CSF-PSCA质粒以及相应对照质粒分别免疫BaLB/c小鼠，通过ELISA和ELISPOT法分别检测免疫后小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应。结果：pVAX1-GM-CSF-PSCA质粒免疫组的小鼠能够诱导更加强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应。结论：GM-CSF与抗原PSCA融合表达显著增强了核酸疫苗诱导免疫应答的能力，将进一步通过实验研究其免疫保护效果。
【关键词】前列腺干细胞抗原；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；核酸疫苗
【中图分类号】R743 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）02-0233-02
1 材料和方法
1.1 实验动物、质粒、细胞和试剂
普通级4-6周龄的BaLB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司；质粒小提试剂盒、DNA片段纯化回收试剂盒购自天根生化（北京）技术有限公司；限制性内切酶、T4连接酶均为NEB公司产品；转染试剂脂质体2000购自Invitrogen公司； pVAX1真核表达载体购自Invitrogen公司；293T细胞为本科室保存；其他生化试剂均为国产分析纯。
1.2 重组质粒的构建和鉴定
根据Genbank人PSCA（GenBank: AF043498.1）和GM-CSF（GenBank: M11220.1）的编码区基因，设计GM-CSF（编码区基因33-467）和PSCA（编码区基因18-389）的融合基因。两段基因之间以(G4S)3柔性Linker进行连接，构成GM-CSF-PSCA融合基因，在融合基因的上、下游分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，设计后的融合基因送Invitrogen公司进行全基因合成。合成后的融合基因利用BamHⅠ和XhoⅠ从克隆载体上释放，然后定向克隆至真核表达载体pVAX1，构建真核表达质粒pVAX1-GM-CSF-PSCA，并通过双酶切鉴定大小。
1.3 重组质粒瞬时转染293T细胞
主要步骤：1）转染前一天，将对数生长期的293T细胞接种于6孔板，接种密度以第二天转染时达到80%汇合度为宜，铺板后的细胞置于37℃,5% CO2的细胞培养箱中过夜培养。2）转染复合物的准备：在1支EP管中加入240µl的无血清培养基DMEM，然后再加入10µl的脂质体2000试剂，轻柔混匀后，放置5分钟，此为A液；取另1支EP管，加入4µg的重组质粒pVAX1-GM-CSF-PSCA，用无血清培养基DMEM补加到250µl，充分混匀后，放置5分钟，此为B液；将B液轻轻的加入到A液中，用移液器轻柔混匀后，室温放置30分钟，此为C液。3）将培养过夜的293T细胞用DMEM无血清培养基洗2次后，加入500µl的无血清DMEM培养基，然后将步骤2）中的C液缓慢、均匀的加入到各个板孔中，轻柔混匀，置于37℃,5% CO2的细胞培养箱，6小时后，换DMEM完全培养基，继续培养48小时。
1.4 流式细胞术和免疫荧光检测重组质粒的表达
重组质粒pVAX1-GM-CSF-PSCA转染48h后，胰酶消化收集六孔板中的细胞，用冰预冷的含有2%胎牛血清的PBS洗涤细胞2次，加入鼠源的抗人PSCA单克隆抗体，室温孵育1小时， PBS洗涤细胞2次后，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，避光孵育30分钟， PBS洗涤细胞2次，1%多聚甲醛重悬，流式细胞仪检测融合抗原的表达；流式检测后，将细胞滴片，进行免疫荧光检测。
1.5 动物分组和疫苗接种
将实验小鼠随机分为4组，每组6-8只，分别为空白对照组、空载体pVAX1组、单独抗原pVAX1-PSCA组以及融合抗原pVAX1-GM-CSF-PSCA组。各组小鼠通过股四头肌分别注射100µg的质粒，于初次免疫后的第10天和第20天分别加强免疫1次。末次免疫后的第14天处死小鼠，进行相关免疫学检测。
1.6 抗体水平检测
末次免疫后2周，小鼠眼眶采血，分离血清，ELISA法检测疫苗诱导的抗体水平。具体步骤为：将重组PSCA抗原包被于ELISA板孔中（l0µg/孔），用封闭液进行封闭后，将各组小鼠血清系列稀释后加入到各孔中，37℃孵育2小时。孵育结束后，PBS洗涤3次，然后每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时，孵育结束后，PBS洗涤3次，加入TMB进行显色，用2M的硫酸终止反应后，酶标仪检测450nm处的吸光度，高于阴性对照2倍以上的定义为阳性。
1.7 ELISPOT检测
取出预先包被好IFN-γ抗体的PVDF板，将分离的各组小鼠的脾细胞加入到各实验孔中，然后疫苗组的板孔加入刺激抗原PSCA，阴性对照加入相应量的BSA，阳性对照加入ConA，37℃孵育36-48小时后进行显色反应。每一组实验设置3个平行对照，ELISPOT的斑点数通过ELISPOT Reader(AID, 德国)进行读数和分析。
2 结果
2.1 重组质粒的酶切鉴定
利用引入的酶切位点Bam HⅠ和XhoⅠ，将GM-CSF和PSCA融合基因定向克隆至pVAX1，构建真核表达质粒pVAX1-GM-CSF-PSCA。利用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定重组质粒，从图1可以看出，质粒双酶切后，得到大小约820bpbp和3000bp的两个片段，大小与理论值相符（图1），表明融合基因GM-CSF-PSCA成功克隆入载体中。
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2.2 重组质粒的表达鉴定
重组质粒pVAX1-GM-CSF-PSCA瞬时转染入293T细胞48h后，流式细胞仪检测结果发现，融合基因能够在细胞中高水平表达，阳性表达率为8.65%（图2A）。荧光显微镜拍照结果也显示，融合基因主要在293T细胞膜上表达（图2B）。
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2.4 疫苗免疫后诱导的细胞免疫反应
利用IFN-γ分泌的ELISPOT实验来检测融合基因免疫后诱导PSCA特异性T细胞反应的能力。实验结果显示，pVAX1-GM-CSF-PSCA免疫后的小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力高于单独抗原质粒pVAX1-PSCA（图4）.如图5所示，ELISOPT的斑点数分析后，融合基因组的斑点数显著高于单独抗原组（P<0.001）。上述结果表明，pVAX1-GM-CSF-PSCA免疫后能够显著增强小鼠脾细胞IFN-γ因子的释放。
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3 结论
本研究将GM-CSF和PSCA 构建到同一表达载体, 设计一种新型的融合表达核酸疫苗。通过实验结果可以看出，将GM-CSF和PSCA融合表达，免疫后的小鼠能够同时诱导体液免疫反应和细胞免疫反应，并且融合基因免疫后诱导的免疫反应要显著高于单独抗原诱导的免疫反应。因此，可以说以GM-CSF与抗原融合表达的这种模式，具有良好的成为候选疫苗的前景。融合抗原的免疫保护能力和保护机制，将通过实验进行深入研究。另外，后续实验将以电脉冲接种这种高效的疫苗接种方式将融合抗原免疫小鼠，以期进一步提高该核酸疫苗的免疫原性。
参考文献：
[1]Nishikawa H,Shiku H. DNA vaccine.Nihon Rinsho.2008 Oct;66(10):1867-72.
通讯作者：
杨克科
基金资助：
黑龙江省中医管理局科研项目,项目编号为zhy12_w016，课题名称为二妙散对银屑病样小鼠的治疗作用及机制研究。
论文作者:杨克科, 王景
论文发表刊物:《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿
论文发表时间:2016/3/21
标签：质粒论文; 免疫论文; 小鼠论文; 细胞论文; 抗原论文; 基因论文; 疫苗论文; 《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿论文;