葛秀秀[1]2001年在《大豆抗疫霉根腐病机制的初步研究》文中指出本文对大豆抗感品种和不同株龄感病品种接种疫霉根腐病菌1号生理小种前后形态组织结构差异和多种生化性状的动态变化规律进行了较系统地分析和研究，并以此初步探讨了大豆抗疫霉根腐病的形态结构和生理生化机制。主要结果如下：1 大豆对疫霉根腐病菌的形态结构抗性 疫霉根腐病菌主要吸附在大豆侧根和主根根尖的分生区、伸长区，然后成囊、萌发生成初生菌丝和次生菌丝。大豆对疫霉根腐病菌的形态结构抗性从宏观到微观依次表现为：具有侧根/主根比例较小的根型；根尖分生区肿大；根和茎的细胞结构发生系列变化（细胞壁物质累加，叶绿体迅速成熟，液泡出现吞噬现象，粗糙型内质网增多）。2 大豆潜在的生理生化抗性 接种前抗感品种间幼苗根、茎、叶中SOD、PO、PPO、PAL活性和总多酚、总黄酮含量差异不显着（α=0.05），因此，大豆对疫霉根癌病菌的苗期抗性是病原菌侵染后诱导植株产生一系列生理主化变化的结果。 未经接种疫霉根腐病菌的感病品种根中PO活性的增强和黄酮类化合物含量的累积主要集中在出苗后14天以内，14天以后植株根中SOD活性、PPO活性、PAL活性和总多酚类物质含量均随株龄的增加而增大，可见，大豆成株对疫霉根腐病菌的抗性与其生长发育过程中SOD、PPO、PAL、PO活性的增强以及总多酚类物质和黄酮类化合物的累积是密切相关的。3 大豆对疫霉根腐病菌的生理生化抗性 大豆接种疫霉根腐病菌后，抗病品种幼苗根和叶中的PAL活性，根、茎、叶中总多酚类物质含量，叶中和接种48h后根、茎中黄酮类化合物含量以及较大株龄的感病品种根中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均比相应对照增加，而感病品种均比相应对照降低。较大株龄的感病品种接种后根中总多酚类物质和黄酮类化合物也表现出不同的累积、消耗过程。这证明苯丙氨酸类代谢途径与大豆植株对疫霉根腐病的苗期抗性和成株抗性密切相关，形成各种各样的次生代谢物质是大豆防御疫霉根腐病菌的重要反应。 接种疫霉根腐病菌后，大豆抗病品种幼苗根和茎中多酚氧化酶活性比相应对照酶活性增加，感病品种幼苗茎中和根中部分多酚氧化酶活性低于对照，可见，抗病品种植株体内的酚类物质可以通过酚氧化酶转变成更具毒性的氧化产物来和病原菌相抗衡，这是继苯丙氨酸类代谢途径之后的防御反应。 大豆接种疫霉根腐病菌后，抗感品种幼苗根、茎、叶中PO活性和SOD活性均比相应对照增加，而且抗病品种SOD酶活性增加的幅度比感病品种的大；较大株龄的感病品种根中PO活性和SOD活性亦表现有较相应对照酶活性增加的阶段。因此，利用PO和SOD等保护酶系统清除多余氧自由基、避免膜脂质过氧化是大豆对疫霉根腐病菌的又一防御机制。
郭娜[2]2011年在《大豆miRNA的鉴定与在抗疫霉根腐病中的功能分析》文中研究说明由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufinann&Gerdemann, P. sojae)引起的大豆疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性土传病害之一。研究大豆疫霉根腐病的抗病机制,是培育广谱、稳定、高效、持久抗病品种的基础。microRNA(miRNA)是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小分子RNA,通过碱基互补配对的方式识别靶标mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶标mRNA或者抑制靶标mRNA的翻译。miRNA在植物生长发育和病害防御中起着重要的作用。本研究首先证明植物基因沉默系统对卵茵的抗性具有重要的作用。利用同源搜索方法对栽培大豆中的miRNA进行预测；以大豆疫霉根腐病抗病、耐病和感病品种为材料,通过人工接种和miRNA芯片技术,鉴定与大豆疫霉菌侵染相关和抗病类型相关的miRNA;通过生物信息学方法预测miRNA的靶标基因并进行功能分析。根据miRNA在抗病、耐病和感病材料之间的表达差异,分析miRNA在抗大豆疫霉根腐病途径中的机制和作用,为培育和改良大豆疫霉根腐病抗性品种奠定基础。主要研究结果如下：1.植物基因沉默系统对卵茵抗性的作用利用烟草疫霉菌Pp025和辣椒疫霉菌Pc35接种拟南芥基因沉默突变体zippy, ago1-27、sgs3-11、rdr6-11,发现突变体的抗病性与野生型相比,略有增强。利用烟草瞬时转化系统,将p19注射至烟草叶片,然后接种Pp025,发现与对照GFP相比,病斑长度明显增长。利用发根农杆菌K599介导的大豆瞬时转化系统,将p19转入大豆,然后接种大豆疫霉菌P6497,发现转化p19的阳性根毛对疫霉菌的抗病性有轻微的下降。结果初步显示,植物的基因沉默系统与卵菌抗性之间存在着密切的关系。2.栽培大豆中miRNA的预测通过比对拟南芥、水稻、苜蓿等所有植物中已知的miRNA成熟体序列与栽培大豆的EST序列,经过层层严格筛选,鉴定到48条新的miRNA,并利用RT-PCR对预测的部分miRNA进行实验验证。使用植物靶基因预测软件psRNAtarget,将该48个miRNA与大豆的基因组数据库进行比对,寻找可能的靶标基因,一共获得323个潜在的miRNA靶标。根据基因的功能注释,发现靶基因编码产物类型多样,其中包括转录因子、抗性蛋白等。同时还分析了包含有候选miRNA的EST的来源,结果发现有部分EST与胁迫响应有关,推测来源于这些EST的miRNA可能受胁迫的调控。3.大豆中保守miRNA的表达分析选择7个保守的miRNA进行表达分析。8个大豆品种进行大豆疫霉菌P6497处理,通过Northern blotting技术,对这7个miRNA进行检测。结果发现,有6个miRNA在这8个品种中都有表达。4.与大豆疫霉菌侵染相关和抗性相关的miRNA的鉴定为了鉴定与大豆疫霉菌侵染相关的miRNA,我们利用生物芯片检测了叁个对P6497具有不同抗性反应的大豆品种(Williams,感病品种；Conrad,耐病品种；Williams82,抗病品种,含有Rpsl-k)接种P. sojae前后miRNA的表达模式,找到97个受P. sojae调控的miRNA,同时分析了与抗性类型相关的miRNA.利用qRT-PCR对芯片中有显着表达的9个miRNA进行了验证,结果发现定量结果与芯片结果的一致性较高。5. miRNA靶基因的预测及功能分析通过BLAST比对,对miRNA的靶标进行预测,并与前人已发表的大豆-大豆疫霉菌互作的基因芯片数据进行比较,找到与miRNA表达趋势相反的靶标基因,并利用实时定量PCR方法进行验证。利用Gateway技术将与卵茵侵染显着相关的10个miRNA前体构建至植物表达载体pEarleyGate103中,并在烟草和大豆中进行遗传转化,初步结果表明过表达miRNA能影响大豆疫霉菌的致病性。通过上述研究,我们初步明确了植物基因沉默系统在抗卵茵病害过程中具有重要作用,鉴定了48个大豆新型miRNA并对它们的特性进行了分析,同时利用基因芯片技术分析了所有已知植物的miRNA在大豆不同抗性品种中的表达规律,发现了一批与疫霉根腐病抗性和病原菌侵染相关的大豆miRNA,并对它们的靶标基因进行了预测,实验证明大豆miRNA可以调节这些基因的表达来进一步影响大豆的抗病性。
霍云龙[3]2005年在《大豆抗疫霉根腐病基因鉴定及分子标记》文中认为由Phytophthora sojae引起的大豆疫霉根腐病是一种世界性大豆病害,由于大豆疫霉菌土传特性和极强的生存能力,防治该病最经济、有效的方法是利用抗病品种。中国是大豆的起源地,蕴藏着丰富的抗病大豆资源。鉴定抗病基因及利用抗病基因十分必要。 本研究的主要目的是对大豆品种(系)进行抗大豆疫霉根腐病基因推导;对野生大豆品种进行初步抗源筛选,为抗病育种提供材料;对两个可能含有新抗病基因的品种进行抗病基因鉴定及分子标记鉴定、定位和作图。主要研究结果如下: 采用离体子叶接种方法对125份大豆品种(系)进行抗大豆疫霉根腐病病基因推导,结果表明:含Rps6的品种有11个,含Rps4的品种有8个,含Rps1d的品种有4个,含Rps1c的品种有1个,含Rps3a的品种有1个,含Rps3b的品种有1个,含Rps3c的品种有1个,含Rps7反应模式的品种有1个,含Rps2的品种有1个,基因型未明确的品种有58个。在所选材料中,安徽所含抗病基因最丰富,其次为武汉,山东和山西次之。 采用下胚轴接种方法,利用大豆疫霉菌株PSUSAR1对412份野生大豆品种进行抗病鉴定:有56份资源表现为抗病反应,有63份资源呈中间反应类型,293份资源表现为感病。被鉴定的野生大豆资源中来源于安徽的野生大豆资源抗性最丰富,之后抗病资源较丰富的省份依次是辽宁、江苏、湖北、陕西、浙江,这些省份的抗性资源比率都在30%以上。 对可能含有未知抗病基因的大豆品种诱变30杂交群体的F_4代分离群体进行抗性遗传分析,表明诱变30的抗性是受一个显性单基因控制,暂将其命名为RpsYB30。通过BSA法对抗大豆疫霉根腐病基因RpsYB30的以分子标记鉴定、标记定位和作图,将该基因定位于大豆基因组分子图谱的L连锁群上,该连锁群上没有已知抗病基因,因此确定抗病基因RpsYB30是一个新抗病基因。 对可能含有未知抗病基因的大豆品种皖豆15两个杂交群体的F_4代分离群体进行抗性遗传分析,表明两个群体的抗性都是受显性单基因控制。将Williamsx皖豆15群体中抗病基因暂定名为RpsWD15。通过BSA法对Williamsx皖豆15杂交组合中抗大豆疫霉根腐病基因进行分子标记鉴定、标记定位和作图,结果将抗病基因RpsWD15定位于大豆基因组分子图谱的D2连锁群上,D2连锁群上不存在已知抗病基因。所以确定该抗病基因是一个新抗病基因。用早熟18与皖豆15杂交组合F_4代分离群体直接验证与抗病基因RpsWD15相关的标记,结果基本一致。
孙石[4]2008年在《大豆疫霉根腐病抗性的遗传分析及基因定位的初步研究》文中进行了进一步梳理由大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病(Phytophthora root rot,PRR)是一种毁灭性的大豆病害,在大豆主要生产国美国、巴西、阿根廷、中国等均有发生,对大豆生产造成很大的危害,培育和种植抗病品种是防治该病害最经济、安全、有效的途径。大豆对疫霉根腐病存在完全抗性和部分抗性,完全抗性是小种专化性抗性,通过限制大豆疫霉的侵染来实现的,是由Rps基因控制的,迄今已鉴定并定名了14个抗病基因,它们分布在4条大豆连锁群的8个位点上。然而,大豆疫霉变异迅速、复杂,自从1948年首次发现此病害以来,已鉴定六十多个生理小种和许多未定名的分离物,所有已知抗病基因均被“击败”。而大多数品种抗源单一,常使抗病品种在推广8～15年后就会“丧失”原有的抗性。因此,迫切需要拓宽新的抗病基因。迄今为止,各国的抗性品种选育主要集中在完全抗性品种的选育,但完全抗性品种在大面积推广种植后会因新的致病小种的流行而丧失抗性,并且单基因抗性品种的大面积推广容易对大豆疫霉产生选择压力从而产生新的生理小种。部分抗性(partial resistance)是另一类具有非小种专化性的数量抗性,能够减轻和减缓新生理小种产生的压力。黄淮地区是我国的大豆主产区之一。本研究旨在筛选出黄淮地区的优异抗源,发掘新的抗病基因,明确大豆疫霉根腐病抗性的遗传机制,对新的抗病基因进行分子作图,从而为抗病育种提供理论指导和物质基础,推动大豆抗疫霉根腐病育种的发展。1、抗性鉴定。利用7个具有不同毒力公式的大豆疫霉菌株,对黄淮夏大豆主产区的96个大豆品种(系)和一套含已知13个Rps基因的大豆鉴别寄主进行了接种鉴定,96个大豆品种(系)对7个大豆疫霉菌株共产生38种反应型,有4种反应型分别与单个抗病基因的反应型一致,有10种反应型与2个已知基因组合的反应型相同,有5种反应型与3个已知基因组合的反应型相同,其它反应型为新的类型。根据“基因对基因”学说,抗病基因的推导结果有7个品种可能含有Rps3a,有4个品种可能含有Rps3b,有1个品种可能含有Rps3c,有5个品种可能含有Rps7,有一些品种可能含有国际上尚未命名的新的抗病基因,这些抗源品种是我国大豆抗疫霉根腐病育种的有效抗源。2、根部接种法及部分抗性的抗源筛选。用根部接种法接种已知抗性水平的3个大豆品种对大豆疫霉根腐病的部分抗性,结果表明本方法所获鉴定结果稳定、可靠、效率较高,建议作为我国鉴定大豆种质资源对大豆疫霉根腐病部分抗性的基本方法。另外,用大豆疫霉菌株PNJ1接种鉴定38份黄淮地区大豆栽培品种和地方品种,其中高抗品种10个,占鉴定品种的26.3%。3、遗传分析。利用分别具有完全抗性和部分抗性的的品种配置4个杂交组合,在分别采用下胚轴伤口接种法和根部接种法接种大豆疫霉菌株PNJ1条件下,研究两类抗性的遗传模式。结果表明,大豆对疫霉根腐病完全抗性和部分抗性分属不同遗传体系,完全抗性由1对主基因控制,抗病对感病表现为显性;部分抗性由1对加性主基因+加性-显性多基因控制,F_2代主基因和多基因遗传率分别为41.31%～74.84%和15.60%～50.34%,F_(2:3)代主基因和多基因遗传率分别为54.21%～77.05%和13.52%～38.24%。两类抗性都有育种价值,并且在早世代选择是有效的。选育聚合有完全抗性和部分抗性的品种是使大豆获得疫霉根腐病高水平抗性和持久抗性的最佳途径。4、基因定位。大豆品种豫豆25和郑92116具有良好的抗大豆疫霉根腐病特性,经基因推导发现它们可能含有多个抗性基因组合或者含有新的抗病基因。用豫豆25与感病材料NG6255、郑92116与NH_5分别杂交构建了两个F_(2:3)群体,用大豆疫霉菌株对这两个群体进行抗性分析,通过SSR结合BSA的方法进行了分子作图,再结合系谱分析,结果显示豫豆25和郑92116的抗性是由同一个显性单基因控制,该基因可能为新的抗病基因,暂定名为RpsYu25,根据SSR标记的位置,该基因被定位在大豆连锁群N上。5、RGA分析。根据水稻抗白叶枯病Xa21基因的富含亮氨酸重复区域(LRR)和番茄抗细菌性斑点病的Pto基因编码蛋白激酶的DNA序列,设计2对引物用于扩增48个品种中的抗病基因同源序列,经聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚类分析,结果表明供试品种间具有较丰富的RGA多态性,从48个大豆品种的抗病基因同源序列中,共扩增出53条谱带,各品种之间谱带较清晰且呈现明显的多态性,以相似系数0.746聚类,48个大豆品种可以分成7类。尽管RGA聚类和抗性表型聚类的类与类之间没有一一对应关系,但抗谱广的品种,能较好地聚在一类,如丰收黄、科丰36、即墨油豆等。因此,综合利用抗性表型和RGA分析可以为大豆疫霉根腐病抗病基因鉴定、品种的培育和布局提供一定的理论依据。
张玉梅[5]2012年在《大豆抗大豆疫霉根腐病的比较蛋白质组学研究》文中研究说明由大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病是一种毁灭性的大豆病害,广泛分布于世界各大豆产区。目前该病已经在我国一些大豆主产区发生和为害,并在局部地区造成较大产量损失,对我国的大豆生产造成很大的危害。应用抗、耐病品种是防治该病害最经济、安全、有效的途径。蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命的变化机制。基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化,而真正发挥功能的蛋白质需要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成。因此,蛋白质组学已广泛应用于植物功能基因组学的研究。本研究主要利用蛋白质组学技术对大豆和大豆疫霉互作过程中的蛋白质表达谱进行研究,并对鉴定蛋白点的功能进行分析。其目的主要是从蛋白表达水平上挖掘一些与大豆疫霉根腐病抗性有关的蛋白,进一步探讨这些蛋白在大豆—大豆疫霉互作过程中所参与的代谢途径以及大豆抗大豆疫霉根腐病的分子机制。主要研究结果如下：1.大豆抗感种质接种大豆疫霉后的比较蛋白质组学研究本实验采用下胚轴创伤接种法,利用2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术探讨大豆抗病品种豫豆25和感病品种NG6255在接种大豆疫霉菌株PNJ1后大豆下胚轴蛋白在蛋白水平上的变化。结果表明,与未接种大豆疫霉的植株相比,共检测到46个差异表达蛋白点。在抗病品种豫豆25中检测到26个差异表达蛋白点,其中12个上调表达,14个下调表达；在感病品种NG6255中,检测到20个差异表达蛋白点,11个上调表达,9个下调表达。在这些差异表达蛋白中,26%与能量调控有关,15%涉及蛋白命运,11%涉及抗病防卫,11%与代谢有关,9%涉及蛋白合成,参与次生代谢的占4%,另外未知蛋白达到24%。2.不同处理条件下大豆根、茎和叶的比较蛋白质组学分析利用2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术以感大豆疫霉菌株P6497的新沂小黑豆为材料,对SA、MeJA、ACC、H2O2、SNP、VB1以及P. sojae处理条件下大豆根、茎和叶进行蛋白质组学分析。结果表明：根中鉴定的35个蛋白点中,与抗病防卫及次生代谢有关各占23%,17%与代谢有关,其次是参与蛋白合成、蛋白命运、转录和代谢调控的,与细胞结构和信号转导有关的最少,各占3%,功能未知蛋白占8%。参与次生代谢有关的蛋白主要与乙烯、茉莉酸和类黄酮生物合成有关。茎中鉴定的58个蛋白点中,与能量和代谢有关的达到41%,参与抗病防卫和次生代谢的各占12%,10%与蛋白命运有关,与信号转导和转录有关的各占7%,与细胞结构有关的占4%,与蛋白合成和运输有关的各占2%。叶中鉴定到21个蛋白点,与能量有关的最多,达到62%,其次是与次生代谢、蛋白合成和代谢有关的,与蛋白命运和转录有关的最少,为5%。与能量有关的蛋白主要参与光合和光呼吸过程。3.基于iTRAQ的大豆对大豆疫霉根腐病根的蛋白质表达谱分析本实验采用根部创伤接种法,利用iTRAQ定量蛋白质组学技术研究抗大豆疫霉菌株Pm14材料苏88-M21接种后3d大豆根的蛋白质表达谱的变化。共鉴定出2136个蛋白,其中差异表达蛋白280个。这280个差异表达蛋白点中,与抗病防卫有关的最多,达到16%,14%与蛋白命运有关,12%参与代谢调控,与能量和蛋白合成有关的各为11%,8%与信号转导有关,6%与运输有关,参与次生代谢的占6%,4%与细胞结构有关,2%与转录有关,与细胞生长/分裂有关的最少,仅为1%,未知功能蛋白占9%。茉莉酸、乙烯、生长素以及泛素-蛋白酶体参与大豆抗大豆根腐病的抗性机制。
胡冠军[6]2013年在《大豆对大豆疫霉根腐病的抗源筛选、基因定位及抗病相关基因表达分析》文中研究表明大豆疫霉病是一种土传病害,严重影响大豆的产量,目前对美国、巴西、阿根廷、中国等国的大豆生产都产生了很大影响。大豆疫霉遗传变异丰富,新的生理小种不断涌现,不同地区间具有不同的优势小种。防治该病最有效的措施是选育抗病品种,而抗源筛选和发掘新的抗病基因是抗病品种选育的基础和关键。大豆与大豆疫霉间的互作符合基因对基因假说,所以用基因推导的方法对大豆品种中所含的抗病基因进行初步鉴定、配置杂交组合和遗传分析,为抗病育种提供理论和材料支撑。本研究用下胚轴创伤接种法鉴定了196份大豆微核心种质,并进行了抗病基因的推导；根据前人抗性鉴定的结果配置杂交组合,进行遗传分析和抗病基因的初定位；根据抗源筛选的结果,研究在具有抗感差异的品种中多个时间点的抗性相关基因的表达模式,探究这些关键基因是否参与了大豆与大豆疫霉菌亲和互作和非亲和互作过程。主要研究结果如下：1.完全抗性的抗源筛选用下胚轴创伤接种法,鉴定196份大豆种质资源对6个具有不同毒力公式的大豆疫霉菌株7071、JS08-12、HeN08-35、HLJ08-17、Pmg、Pm14的抗性。鉴定结果表明196份大豆品种(系)共产生29种反应型,有3种反应型与单个抗病基因的反应型一致,其余的反应型为新类型。基因推导的结果显示,可能含有Rps6的反应类型的品种有7个,占3.6%；可能含有Rps2的反应类型的品种有3个,占1.5%；可能含有Rps4、Rps5、Rps7的反应类型的品种有4个,占2.0%。结果表明,华中地区所含的抗病类型最丰富,其次为西南和华东地区,尤以湖北和四川两省的抗性种质较多。2.完全抗性的遗传分析及分子标记作图根据大方六月早对10个菌株的反应型,基因推导结果显示该品种可能含有新的抗病基因。利用大豆疫霉菌株AH对大方六月早×矮脚早的F2：3群体进行抗性鉴定,遗传分析结果表明大方六月早对AH的完全抗性是由一对显性单基因控制的,该基因暂定名为RpsAH。用SSR和BSA的方法,将抗性基因RpsAH定位在N连锁群上。3.抗病相关基因的表达分析用下胚轴创伤接种法,探讨在抗源筛选过程中具有抗感差异的品种邳县四粒糙和绿草豆中的活性氧清除基因、PR基因、转录因子、信号转导相关基因、次生代谢物质基因等在接种大豆疫霉后7个时间点的表达模式,结果表明,它们在接种后或接种前、抗病感病两品种中的表达量是有差异的,说明它们参与了大豆与大豆疫霉菌亲和互作和非亲和互作过程。
王辉[7]2008年在《应用外源物质诱导大豆对疫霉根腐病抗性的研究》文中认为由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是一种世界性大豆病害。利用生物的或者物理、化学的因子处理植株,改变植物对病害的反应,产生局部或系统抗性的现象称为诱导抗病性。能够诱导植物产生抗性的物质叫诱导因子,由于它有着抗病谱广、安全无污染等特点,因此利用诱导因子诱导植物提高抗病性作为一种新的防治病害途径,在国、内外开展了较多的研究,而对大豆疫霉根腐病的诱导抗性尚未见报导。为此,本试验从4种不同的诱导剂中筛选出对大豆抗疫霉根腐病效果较好的诱导剂(壳聚糖),并对其诱导抗病性生理生化机制进行研究,旨在为防治大豆疫霉根腐病提供新的方法。测定了4种供试诱导剂对大豆疫霉菌的直接作用,包括对菌丝生长、孢子囊产生、游动孢子释放及孢子萌发的作用。结果表明4种诱导剂在其供试浓度范围内对疫霉菌无抑制作用。供试诱导剂在大豆苗期喷雾处理结果表明,4种供试诱导剂均能诱导大豆对疫霉根腐病的抗性,1.0 mL·L-1的壳聚糖和200 mg·L-1的水杨酸诱导大豆幼苗抗疫霉根腐病的效果最好,分别达到51.6%和48.4%。对1.0 mL·L-1的壳聚糖和200 mg·L-1的水杨酸处理后不同时间接种疫霉菌的死苗率和防治效果进行了测定,结果表明,用1.0 mL·L-1的壳聚糖处理后5 d接种,防治效果达最大值50.4%,此后随着接种时间的延长,防治效果缓慢减弱,至15 d时防治效果仍达27.4%;而200 mg·L-1的水杨酸处理后3 d接种,防治效果就达最大值46.9%,至15 d时防治效果仅有9.6%。因此综合考虑最佳诱导剂为1.0 mL·L-1的壳聚糖。系统抗性试验说明,诱导大豆植株真叶,可使大豆复叶产生抗病性,说明这种诱导抗病性是系统诱导抗性。同时,在诱导浓度和诱导间隔期一定的条件下,增加诱导次数,使诱导效果增强。用浓度为1.0 ml·L-1的壳聚糖诱导处理并接种疫霉菌后,测定大豆叶片中防御相关酶活性及PR蛋白,结果发现供试大豆叶片SOD、POD、CAT、PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶活性都表现出不同程度的提高,说明SOD、POD、CAT、PPO、PAL、β-1,3-葡聚糖酶活性的变化与大豆抗疫霉根腐病密切相关。
芮海英[8]2008年在《几丁质酶活性与大豆抗疫霉根腐病的关系》文中研究指明植物在受到病原菌侵染或外界胁迫作用下,可产生许多病程相关蛋白(Pathogenesis-Related Protein,PR蛋白),PR蛋白中的PR蛋白家族3(PR-3蛋白)具有几丁质酶活性,几丁质酶与植物防卫反应机制密切相关。为了明确几丁质酶活性与大豆抗疫霉根腐病的相关性以及大豆几丁质酶的部分酶学特性,测定了不同抗性大豆品种接种大豆疫霉菌后的几丁质酶活性的变化情况,几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和两种酶混合液分别对大豆疫霉菌的抑制作用和几丁质酶的部分酶学性质。取得以下研究结果。未接种的不同大豆品种中的几丁质酶活性无显着性差别。大豆疫霉菌侵染后不同抗性的大豆品种的几丁质酶的含量和活性均有不同程度的提高。抗病品种酶活性上升的速度比感病品种快,酶的高活性维持的时间较长。抗病品种在接种后24 h酶活性达到峰值,中感和感病品种在接种后48 h达到峰值。说明大豆疫霉菌可诱导几丁质酶产生,大豆品种的抗病性与几丁质酶的活性呈正相关关系。酶反应的最适温度为45℃,该酶在45℃以下比较稳定,超过60℃酶活性快速丧失;最适pH值为5,pH值在4~6之间时酶活性稳定,超过7时酶活性丧失较快。Mn~(2+)、Zn~(2+)、Ba~(2+)、Fe~(3+)、Ca~(2+)对酶活性有激活作用,Al~(3+)、Ag+、Fe~(2+)、K+、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)对酶活性有抑制作用。几丁质酶对大豆疫霉菌的抑制作用最弱,其次是β-1,3-葡聚糖酶,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶混合液对大豆疫霉菌的菌丝生长、孢子囊形成和孢子萌发的抑制作用最强。说明几丁质酶虽然对大豆疫霉菌的抑制作用较弱,但与β-1,3-葡聚糖酶协同作用可增强对大豆疫霉菌的抑制作用。
郭玉双[9]2007年在《转chi+rip双价基因大豆的抗病性检测及其中间试验研究》文中研究指明大豆(Glycine max L．)是世界上重要的粮食和油料作物，是植物蛋白质的主要来源。真菌性病害是导致大豆品质和产量下降的重要原因，其中大豆灰斑病、疫霉根腐病、霜霉病等最为严重，每年都会造成不同程度损失，在病害大流行年份可造成严重损失甚至绝产。为了提高大豆的产量和品质，培育抗病品种是目前生产上亟待解决的重要问题。然而传统的抗病育种手段工作量大、周期长、效率低，不能满足农业生产的需要。因此，将传统育种和生物技术结合起来进行分子育种势在必行。近年来，随着分子生物学与基因工程的迅猛发展，利用基因工程方法将抗真菌病基因，如几丁质酶基因(chitinase gene，chi)、β-1，3葡聚糖酶基因(β-1，3-glucan，β-Glu)和核糖体失活蛋白基因(ribosome inactivating protein gene，rip)导入有重要价值的植物，来培育抗病品种，已经成为一条有效的植物抗病分子育种新途径，并展现出美好的应用前景。对转基因植物进行环境安全评价是转基因植物产业化的重要过程，转基因植物的安全性评价要经过合理的试验设计和严密科学的试验程序，以获得足够的真实的数据。根据这些数据可以判断转基因植物的田间释放或大规模商品化生产是否安全，对试验证明安全的转基因植物可以正式应用于农业生产。本研究以本研究室获得的转chi+rip双价抗真菌病基因大豆株系G0431、G0433的T_3代植株为试材，在温室条件下对其进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗病性检测，并对其主要的农艺性状进行了调查与分析，T_3代植株收获后形成T_4代植株种子。经农业部审批(农基安办字2006-T002)，对上述2个株系的T_4代植株在黑龙江省进行了中间试验的环境安全评价，系统研究了转基因大豆的遗传稳定性、农艺性状、环境适应能力及生存竞争能力、外源基因表达及其功能性状的有效性等，完成了转基因大豆中间试验的全部研究内容，为转基因大豆的中间试验的环境安全作出了科学评价，也为转基因大豆的环境释放和生产性试验的环境安全性评价提供了重要理论依据。本研究的主要研究结果如下：1．转chi+rip双价基因大豆T_3代植株的抗病性检测与农艺性状调查(1)株系G0431和G0433的T_3代植株的分子生物学检测对株系G0431和G0433的T_3代植株进行了PCR及real-time PCR检测，PCR检测结果表明，株系G0431和G0433的T_3代植株均能同时扩增出2个外源目的基因；Real-time PCR检测表明，2个外源目的基因在转基因大豆基因组DNA中的起始浓度均为其在未转化植株中的约2~(15)倍，证明转基因大豆T_3代植株中同时含有2个外源目的基因。(2)株系G0431和G0433的T_3代植株中外源基因表达的检测以G0431和G0433的T_3代植株的cDNA为模板为模板，以未转化株cDNA为阴性对照，无菌水代替模板cDNA为负对照进行real-time PCR检测。结果表明，2个外源目的基因在G0431和G0433的T_3代植株cDNA中的起始浓度分别为其在未转化植株中的约2~(11)和2~(15)倍，证明2个外源基因在转基因大豆植株中均同时进行表达。(3)株系G0431和G0433的T_3代植株的抗病性检测对转基因大豆株系G0431和G0433的T_3代植株进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗性检测，结果表明，2个株系对大豆疫霉根腐病的抗病性均由原来的高感提高到高抗，对大豆灰斑病的抗病性由原来的中抗提高到高抗水平。(4)株系G0431和G0433的T_3代植株主要农艺性状的调查与分析对转基因大豆主要的产量性状、形态性状以及品质性状进行了调查与分析，结果表明，在产量性状上，株系G0431和G0433与对照相比均无明显差异；在形态性状上，株系G0431结荚习性由亚有限结荚习性变成了无限结荚习性，株系G0433株高低于对照、生育期短于对照、结荚习性由亚有限结荚习性交成了无限结荚习性：在品质性状上，与对照相比，2个转基因大豆株系蛋白含量有所下降而油分含量有所上升，达到显着水平。2．转chi+rip，双价基因大豆T_4代植株中间试验的环境安全评价(1)转基因大豆的遗传稳定性对转基因大豆株系G0431和G0433的T_4代植株进行了real-time PCR检测，结果表明，2个外源基因在转基因大豆中的起始浓度分别为其在未转化植株中起始浓度的约2~(15)倍，充分证明转基因大豆T_4代植株中同时含有2个外源基因，外源基因已稳定遗传至T_4代。(2)转基因大豆的农艺性状对转基因大豆T_4代植株主要的产量性状、形态性状以及品质性状进行了调查与分析，在产量性状上，2个转基因大豆株系与对照相比均无明显差异：在形态性状上，株系G0431结荚习性由亚有限结荚习性变成了无限结荚习性，株系G0433株高低于对照、生育期短于对照、结荚习性由亚有限结荚习性变成了无限结荚习性；在品质性状上，与对照相比，2个转基因大豆株系蛋白含量有所下降而油分含量有所上升，达到显着水平。(3)转基因大豆的生存竞争能力与环境适应能力①竞争性无论是在大豆适宜生长季节还是非适宜生长季节，在各种播种条件下，2个转基因大豆株系与对照在田间杂草种类、数目及覆盖度方面均无明显差别；2个株系转基因大豆的覆盖度均低于对照，达到5％显着水平；2个株系转基因大豆的出苗率与成苗率低于对照，达到5％显着水平：在株高方面，株系G0431与对照相比无差别，株系G0433显着低于对照，达到5％显着水平。②自生苗产生率转基因大豆与对照的自生苗产生率均为0，无明显差别。③繁育系数株系G0431与对照相比，在始花期、盛花期、成熟期及单株粒数与对照相比无明显差异，在单株粒数方面与对照相比无明显差异；株系G0433与对照相比，在始花期、盛花期、成熟期均明显早于对照，达到1％显着水平；在单株粒数方面与对照相比无明显差异。④种子落粒性在大豆适合生长季节播种，转基因大豆与对照在种子落粒性方面无明显差别，在大豆非生长季节播种由于大豆不能正常成熟不能进行种子落粒性实验。⑤种子的自然延续能力无论是地表处理还是地下20cm处理，转基因大豆与对照相比，在正常幼苗、不正常幼苗、未发芽种子和新鲜不发芽种子方面均无明显差异，转基因大豆与对照的种子延续能力相同。(4)转基因大豆中外源基因表达及其功能性状的有效性对株系G0431和G0433的T_4代植株中2个基因进行了real-time PCR检测，结果表明2个外源基因均进行了转录表达；对株系G0431和G0433的T_4代植株进行大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗病性检测，与对照相比，2个转基因大豆株系对大豆疫霉根腐病的抗性有明显提高，对大豆灰斑病的抗性与对照相同，均为中抗，无明显差别。
张吉清[10]2013年在《大豆对疫病的抗性评价、抗病基因挖掘及候选基因分析》文中进行了进一步梳理由大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdermann）引起的大豆疫病（Phytophthora rootrot，PRR）是毁灭性大豆病害之一，严重影响大豆产量和品质。因此，发掘和作图大豆抗疫病新基因对防治该病害和抗病育种具有重要的意义。本研究通过接种不同毒力的大豆疫霉菌株对34个大豆品种（系）可能携带的抗病基因分析，利用与Rps1座位连锁的分子标记进行标记基因鉴定，并利用TRAP标记分析了这些品种（系）的多样性；作图和精细定位了2个广谱抗性大豆品种豫豆29和皖豆15抗疫病基因。主要结果如下：1.利用下胚轴创伤接种法鉴定了30个豫豆系列品种（系）及其4个原始亲本对26个不同毒力的大豆疫霉菌株的抗性，应用基因对基因理论对品种（系）进行了抗疫病基因推导。结果表明，34个大豆品种（系）分别抗3个或3个以上大豆疫霉菌株，并产生34种不同的反应型。通过与一套含有单个已知抗病基因大豆品种（系）反应型比较发现，品种周豆17的反应型与含有Rps5品系L85–3059的反应型一致，可能携带抗病基因Rps5；郑77249可能携带抗病基因Rps3a或Rps3a+5抗病基因组合。其它32个大豆品种（系）反应型与已知的抗病基因或抗病基因组合反应型不同。因此，推测这32个大豆品种（系）可能携带新的抗病基因或抗病基因组合。聚类分析表明，当相似系数为0.65时，34个大豆品种（系）、17个鉴别寄主和感病品种Williams共聚为10组。本研究结果表明，河南地区培育的豫豆系列品种（系）对大豆疫霉的抗性具有极其丰富的多样性。这些具有广谱抗性的大豆品种（系）为有效地控制大豆疫病提供了新的抗源。2.利用靶位区域扩增多态性（Target Region Amplified Polymorphism, TRAP）标记对34个品种（系）、17个鉴别寄主和感病品种Williams的遗传多样性进行了分析。32对TRAP标记扩增34个品种（系）共产生251个位点，平均每对引物产生7.84个位点，每个位点均具有多态性，多态性位点比例占100%。基于TRAP标记分析，这34个品种（系）间的遗传相似性位于0.20-0.94，平均相似性为0.57。UPGMA聚类分析，在相似系数为0.57时，52个大豆品种（系）分为9个组。通过与抗性鉴定聚类结果分析表明，大豆对疫病的抗性与TRAP标记聚类结果无关。3.豫豆29是一个对大豆疫霉具有广谱抗性的大豆品种。接种25个不同毒力的大豆疫霉菌株进行抗性分析表明，豫豆29产生的反应型不同于携带已知单个抗病基因的鉴别寄主的反应型。以豫豆29为父本，感病品种吉科豆2号为母本，杂交产生的214个F2:3家系作为作图群体对豫豆29进行抗大豆疫病基因分析。抗性遗传分析表明，F2:3群体中纯合抗病、杂合和纯合感病家系分离比符合1：2：1的分离比，表明豫豆29对大豆疫霉的抗性由一个显性单基因控制，暂时命名为RpsYD29。利用SSR标记，基因RpsYD29被定位在了大豆基因组第3号染色体上（Molecularlinkage group N, MLG N），位于引物SattWM82–50和Satt1k4b之间，与两个标记的遗传距离分别为0.5和0.2cM。对定位区域内的基因序列分析表明，具有NBS-LRR结构的基因Glyma03g04030.1和Glyma03g04080.1可能是RpsYD29基因的参照候选基因。经候选基因克隆测序和序列分析表明，豫豆29和吉科豆2号的两个候选基因在核苷酸和编码的预测氨基酸序列上均存在差异。这些差异可能是造成豫豆29和吉科豆2号抗、感差异的原因。根据抗性鉴定和分子鉴定结果，可知RpsYD29基因可能是Rps1座位上一个新的等位基因或与Rps1座位紧密连锁的基因。4.利用与Rps1座位紧密连锁的分子标记Satt530和Sat_186，和与RpsYD29基因紧密连锁的分子标记SattWM82–50和Satt1k4b，对34份大豆品种（系）进行了分子标记基因型分析。发现这4对引物共产生31种标记基因型。这34份大豆品种（系）在这4个位点具有丰富多样性。分子标记基因型分析表明，豫豆23、豫豆24和周豆11可能携带RpsYD25基因；郑77249、郑84285、郑120、郑90007和郑92116可能携带RpsYD29基因；豫豆12、豫豆22和赤黄豆可能携带Rps1a/1d基因；豫豆15可能携带Rps1b基因；齐黄1号、郑7104、山东四角齐、郑135、豫豆13和郑85558可能携带Rps1c/1k基因。5.以大豆品种皖豆15为父本，感病品种Williams为母本杂交产生的102个F2:3家系作为作图群体对皖豆15的抗大豆疫病基因进行分析。抗性遗传分析表明，F2:3群体中纯合抗病、杂合和纯合感病家系分离比符合1：2：1的分离比，表明皖豆15对大豆疫霉菌株PsMC1的抗性由一个显性单基因控制。连锁分析表明，皖豆15携带的抗病基因被定位在了大豆第17号染色体上（MLGD2），位于引物Sattwd15–24/25和Sattwd15–47之间，与这两个引物之间的遗传距离分别为0.5和0.8cM。同时还获得与抗病基因共分离的两对引物Sattwd15–28和Sattwd15–32。这是首次在该染色体上发现和定位的大豆抗病基因，因此将该基因命名为Rps10。对定位区域内的基因序列分析表明，具有丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶结构的基因Gly17g28950.1和Gly17g28970.1可能是Rps10的参照候选基因。经侯选基因克隆测序分析，皖豆15和Williams的两个候选基因在核苷酸和编码的氨基酸序列上均存在差异。这些差异可能是造成皖豆15和Williams对大豆疫霉菌株抗、感差异的原因。
参考文献：
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