龚圆渊[1]2012年在《六味地黄丸联合bFGF诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究》文中研究指明目的：通过细胞生物学技术,探讨分离、培养、纯化和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的方法,观察滋补肝肾中药六味地黄丸联合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞的作用,探索获得较高比例神经元样细胞的诱导方法。方法：采用全骨髓贴壁分离法分离、培养SD大鼠BMSCs,以纯化的BMSCs为研究对象,观察细胞形态变化、生长增殖状态,MTT法检测绘制细胞生长曲线,对第3代细胞进行表面标志物CD44、CD34免疫细胞化学染色法检测,鉴定BMSCs。鉴定后,第3代细胞经bFGF预诱导24小时后按空白组、bFGF组、六味地黄丸组、bFGF+六味地黄丸组分别加入相应诱导液进行诱导,观察细胞形态变化；诱导培养7天,采用免疫细胞化学染色法检测相关标志物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果：1.采用全骨髓贴壁分离法获得原代BMSCs,随多次换液弃悬浮细胞传代弃其它贴壁细胞后得到纯化的BMSCs.经分离培养的第3代细胞增殖旺盛,具有较好的活力,利于诱导进行。免疫细胞化学染色结果显示CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。2.生长良好的第3代BMSCs经bFGF预诱导24小时后与空白组相比,细胞数量增多,立体感增强；各组BMSCs分别以不同诱导液进行诱导,2-3天细胞胞体收缩,形成圆形、不规整的锥形或叁角形；4-5天,部分细胞逐渐伸出突起,多为2-3极,呈现较典型的神经元样细胞形态；6-7天,神经元样细胞数量增多,bFGF+六味地黄丸组更为明显。空白组细胞形态1-3天未出现明显改变,但生长速度明显减慢,其后出现老化、死亡脱落。3. bFGF组、六味地黄丸组和bFGF+六味地黄丸组均有Nestin、NSE、GFAP阳性表达,bFGF+六味地黄丸组各指标阳性率高于bFGF组、六味地黄丸组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.经全骨髓贴壁分离法分离、培养的骨髓间充质干细胞能逐渐纯化,细胞活性较高、生物学性状稳定,适于做进一步研究。2.六味地黄丸能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,六味地黄丸和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导可获得较高比例的神经元样细胞。
段祥[2]2007年在《骨髓间充质干细胞向神经细胞、成骨细胞诱导分化的研究》文中研究表明骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的非造血干细胞，具有自我复制能力和多向分化潜能。在不同的条件下可以诱导分化为多个细胞系，包括成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞及神经细胞等。骨髓间充质干细胞还具有取材方便，对机体损伤小，体外培养增殖能力强等优点，选用自体骨髓间充质干细胞进行组织再生或移植，不仅没有移植排异反应，还避免了伦理纷争。因此，对骨髓间充质干细胞的研究成为当今生物医学的热点，骨髓间充质干细胞也被认为是最有前途的组织工程的种子细胞。1 BMSCs的分离培养和生物学特性为了建立一个有效的分离培养，体外扩增的方法，本实验比较了叁种常用的分离培养方法，结果显示用Percoll淋巴细胞分离液进行不连续密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞能够在较短的时间内实现BMSCs的体外扩增和纯化。将得到的BMSCs在倒置相差显微镜下观察其形态，发现90％以上的细胞表现为BMSCs典型形态。用MTT法描绘细胞生长曲线证实细胞生长状况良好，且增殖状况与接种密度有关。用流式细胞仪鉴定第5和20代细胞表型，CD29、CD90、CD44、CD106、CD71表现为阳性，CD34、CD45为阴性，证明BMSCs稳定传至20代，表型没有变化。2 BMSCs向神经样细胞的诱导分化常用的诱导BMSCs向神经细胞分化的诱导方案是将成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、丁羟基茴香醚(butyl hydroxy anisol，BHA)联用。本实验BMSCs分别用(1)bFGF+DMSO+BHA；(2)bFGF+DMSO；(3)DMSO+BHA；(4)DMSO四种不同的诱导方案诱导，发现用(1)诱导的BMSCs在29小时内有80％左右变成神经样细胞，而其他叁组则需更长的时间。同时使用方案(1)时，细胞形态变化较其他叁组变化更快，更明显。这四组诱导得到神经样细胞均可以表达神经特异性标志neuron-specific enolase(NSE)。用方案(1)29h可以得到80％细胞阳性，而此时其他各组基本为阴性表达。使用方案(2)(3)(4)需要32h左右可以观察到BMSCs形态变化成神经元样，免疫荧光染色约80％阳性。将各组诱导后的细胞继续用无血清L-DMEM培养24 h，发现用(3)(4)两种方案诱导得到的细胞出现老化死亡现象。为了检测这些神经特异标志在BMSCs向神经样细胞分化过程中的表达，将BMSCs用含血清和bFGF的L-DMEM预诱导24 h，然后用含有DMSO和BHA的无血清L-DMEM继续诱导。在这个过程中发现nestin的表达要早于NSE和β-tubulin的表达，因为nestin是神经干细胞的标志，而后两者是神经元的标志。最后，将BMSCs和用其诱导分化成的神经样细胞预先用BrdU标记，然后局部移植入脊髓横断的动物模型体内，用BBB评分来评价术后1-12 w动物的行为表现及功能恢复情况。结果显示移植细胞的动物整体功能恢复情况要好于对照组。用免疫组化法对横断部位脊髓切片染色也发现许多BrdU阳性的细胞。3 BMSCs向成骨细胞的诱导分化为了检测不同诱导起始时间对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响，开展了如下工作。分别在(1)BMSCs接种当时，(2)50-60％融合时，(3)85-95％融合时加入成骨诱导剂开始诱导。倒置相差显微镜下观察增殖分化情况，分别进行碱性磷酸酶染色(钙钴染色)和钙结节染色(von kossa染色)。诱导过程中可以观察到BMSCs逐渐向成骨细胞形态转变，碱性磷酸酶染色和钙结节染色呈现阳性。结果显示在BMSCs 85-95％融合时开始诱导的细胞碱性磷酸酶和钙结节染色阳性率更高而碱性磷酸酶活性增强更明显。为了评估不同传代倍数的BMSCs成骨诱导分化能力的高低，将5、10、15、20四代细胞同时开始向成骨细胞诱导，发现这四代细胞分化成成骨细胞的能力没有明显不同。本实验为进一步研究BMSCs向神经、成骨细胞分化的机制提供实验依据。
胡亮[3]2006年在《小鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞》文中指出近年来的研究发现,在骨髓中除了造血干细胞外还存在一种间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs具有多向分化潜能,在特定的条件下能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。由于MSCs具有取材方便、易于分离培养和扩增、可自体移植、适合于外源基因的导入和表达等优点,因此成为医学界的研究热点。本研究探讨了小鼠骨髓MSCs体外分离培养的方法及其向神经元样细胞分化的潜能。本试验采用全骨髓法和梯度密度离心法分离、纯化小鼠骨髓间充质干细胞;研究RPMI-1640和L-DMEM培养基以及马血清和胎牛血清对骨髓MSCs生长的影响;并采用两种诱导剂(β-巯基乙醇和BHA)诱导小鼠骨髓MSCs分化为神经元样细胞;结果表明:1密度梯度离心法比全骨髓法分离的小鼠骨髓MSCs纯度高,但是细胞生长速度相对较慢。刚接种时,两种方法分离的骨髓细胞悬液中的细胞呈圆形,大小不一,细胞核比较模糊,但是全骨髓法比密度梯度离心法分离的细胞数量大;1d～3 d密度梯度离心法分离的细胞处于潜伏期,可见形态相对均一、折光性较强的纺锤形细胞,以及少量成纤维细胞样的细胞,而全骨髓法的细胞已经进入了对数生长期,细胞生长速度较快;4 d～5 d密度梯度离心法分离的细胞进入对数生长期,而全骨髓法分离的细胞进入平台期;8 d～10 d密度梯度离心法的细胞生长进入平台期,并逐渐出现融合,而全骨髓法的细胞已经融合,细胞间存在接触抑制,传代培养的细胞呈集落样生长并融合成片。密度梯度离心法分离的细胞在第叁、四代的细胞纯度高达98 %,培养12 d后发生融合,呈水纹状分布或平行生长。2 L-DMEM培养基培养小鼠骨髓MSCs比RPMI-1640好。马血清和氢化可的松在前叁周的培养是至关重要的,但是以后的培养过程中要更换为胎牛血清,否则会加速细胞的脂肪分化。3两种诱导剂(β-巯基乙醇和BHA)诱导的小鼠骨髓MSCs均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出轴突样和树突样突起且有分支。免疫细胞化学鉴定显示,诱导分化后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶和神经纤维丝蛋白,β-巯基乙醇诱导的细胞表达NSE的阳性率为(86.8±2.7) %,表达Neurofilament 200KD的阳性率为(75.2±2.3) %;BHA诱导分化细胞表达NSE的阳性率为(80.5±2.2) %,表达Neurofilament 200KD的阳性率为(73.2±1.6 %)。
马琳琳[4]2010年在《视黄酸诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究》文中研究表明骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有取材方便、来源广泛、自体移植无免疫排斥性等优点而成为理想的移植细胞。成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,对临床上治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤修复具有重要意义。本研究探讨体外分离培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞的方法,对视黄酸(Retinoic Acid, RA)抑制骨髓间充质干细胞增殖,促进其向神经细胞分化及作用机制进行初步研究。通过密度梯度离心培养法和完全贴壁培养法,分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,证实通过离体培养,可使体内环境下低丰度的BMSCs实现数目扩增,发现密度梯度离心法有利于BMSCs的纯化。不同浓度RA诱导BMSCs,加入碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)优化诱导条件,对其进行形态学观察,MTT法测定细胞存活率,确定RA最佳诱导浓度。RT-PCR及免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定,证实视黄酸诱导BMSCs分化为神经细胞,细胞表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GAFP)和微管相关蛋白-2(MAP-2),同时发现bFGF可以明显提高BMSCs存活率和保护分化后的神经细胞,但是对于BMSCs的分化率无明显作用。RT-PCR检测RA诱导BMSCs过程中,RA受体RXRa的表达上调,证明RXRa参与RA诱导的BMSCs向神经细胞分化的过程。同时检测到在mRNA水平上转录因子Myocardin和MRTFA的表达升高,证明Myocardin和MRTFA也参与RA诱导的BMSCs向神经细胞分化的过程。利用Myocardin缺失转录激活域的真核表达质粒Myocardin△C,通过竞争性的抑制内源Myocardin的功能,研究Myocardin在RA诱导BMSCs分化为神经细胞中的作用。结果发现,Myocardin功能缺失时,RA诱导效率显着降低,证明RA诱导BMSCs向神经细胞分化过程部分依赖转录因子Myocardin.RT-PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin-El和P21的表达情况。结果显示,在mRNA水平上,细胞周期蛋白cyclin-El的表达下降,P21的表达升高。证明在一定浓度范围内,RA能通过下调细胞周期蛋白Cyclin-El的表达,上调细胞周期抑制蛋白P21的表达,抑制BMSCs的增殖,促进其分化。
陈文超[5]2011年在《大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响》文中研究表明目的:骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类具有向神经细胞分化能力的多潜能干细胞,可应用于神经功能缺损的细胞移植治疗。本实验研究骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增的特点,旨在培养出高纯度的骨髓间充质干细胞。探讨大鼠脑组织匀浆上清液对BMSCs向神经元样细胞分化的影响,在以碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为基础的诱导液中分别加入正常和损伤大鼠脑组织匀浆上清液,观察各组神元样细胞的诱导率及诱导后细胞活力的差异。方法:无菌条件下取大鼠股骨和胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法对骨髓间充质干细胞进行体外培养和传代,选取第3代、第5代和第7代骨髓间充质干细胞接种于96孔板,连续10天每天同一时间计数各代的细胞数,绘制细胞生长曲线图。采用流式细胞仪检测第4代骨髓间充质干细胞表面的CD29,CD44和CD45抗原的表达。取第4代的BMSCs,按105/ml浓度接种于6孔板和96孔板内,以1mmol /L浓度BME和含20%血清的DMEM培养基预诱导24 h后,分别加入bFGF 20ng/ml、bFGF 20ng/ml+正常大鼠脑匀浆上清100ul/ml、bFGF 20ng/ml+损伤大鼠脑匀浆上清100ul/ml,诱导至细胞分化,另留取空白对照组不加任何诱导剂。细胞培养及诱导过程中每天在倒置显微镜下连续观察其形态变化。取6孔板内各组诱导后48h的细胞进行爬片,采用免疫细胞化学染色的方法分别检测各组诱导分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(Neural-specific enolase, NSE)、微管相关蛋白-2(Microtubule associated protein 2, MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达,计算出诱导阳性率。取96孔板内诱导后的细胞用MTT法检测各组诱导后5h、24h、48h、3d、5d诱导后细胞的生长状况。结果:倒置显微镜下观察可见培养24h后部分细胞贴壁呈多角形,72h后贴壁细胞增大、分裂增殖,2周左右细胞汇合至70%～80%,此时可传代。传代24 h后BMSCs即可贴壁生长,约5 d～7 d可铺满瓶。此后随着换液、传代,细胞逐渐表现为排列旋涡状、菊花状的均一梭形。第3、5、7代细胞生长曲线测定显示这3代细胞具有相同的生长特性,表现为传代后约两天为潜伏期,细胞生长缓慢,第3天进入指数生长期,这一时期持续到第8天,此后进入平台期;随着传代次数的增多,细胞增殖速度有减弱趋势。流式细胞术检测第4代BMSCs结果为CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、99.7 %和2.2%。BMSCs预诱导24h,可见少量细胞逐渐向胞核方向收缩,加入各诱导剂后上述变化增多,有突起形成并随时间增长,部分视野可见突起交织成网状,对照组细胞形态无变化。免疫细胞化学染色可见各诱导组细胞均有部分细胞NSE和MAP-2阳性,GFAP阴性。对照组均不表达NSE、MAP-2和GFAP。计算各组细胞的诱导阳性率为:bFGF诱导组NSE的表达率为44.50%,MAP-2的表达率为45.70%;正常大鼠脑组织匀浆上清诱导组NSE的表达率为63.10%,MAP-2的表达率为65.30%;损伤大鼠脑组织匀浆上清诱导组NSE的表达率为73.30%,MAP-2的表达率为75.60%。MTT结果显示加入脑组织匀浆上清的细胞生长状况好于对照组,其中损伤匀浆组的细胞活力更好。结论采用全骨髓贴壁培养法可以培养出高纯度的骨髓间充质干细胞,第3、5、7代细胞的生长特性基本相同,传代后均经历潜伏期、指数生长期和平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖有减弱的趋势。大鼠脑组织匀浆上清液能提高其骨髓间充质干细胞向神经细胞方向的分化的阳性率和诱导后细胞的活力。相比于正常脑组织匀浆,损伤匀浆的作用更强。
蒋军健[6]2010年在《大鼠骨髓间充质干细胞体内外表达神经营养因子与体内移植延缓失神经骨骼肌萎缩及其机制的实验研究》文中进行了进一步梳理摘要目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞(Rat mesenchymal stem cells, rMSCs)以及经诱导分化为神经元样细胞后脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT3)、睫状神经营养因子(CNTF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的表达情况。方法：取Wistar大鼠骨髓,提取、分离、培养骨髓间充质干细胞,用免疫荧光染色及流式细胞仪行CD44、CD45和CD90鉴定。取传第3代的骨髓间充质干细胞用DMEM、0.1 mmol/L2-巯基乙醇和2%二甲基亚砜,预诱导5小时后更换含10%FBS的DMEM、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、10μg/L表皮生长因子(EGF)共1ml,置入37℃,5%CO2培养箱中诱导维持7天和14天,荧光相差显微镜观察细胞形态,行神经元标志物Nestin、NF、MAP-2、β-tubulinⅢ、Chat和GFAP免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定。分别在细胞传1、3、5代及诱导7天和14天时采用RT-PCR及ELISA测定骨髓间充质干细胞和神经元样细胞表达BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF的情况。结果：骨髓间充质干细胞经诱导后大约有80%的细胞呈神经元样改变,免疫荧光染色显示神经元标志物Nestin阳性率40.17%±2.95%、NF阳性率16.00%±1.23%、MAP-2阳性率36.30%±1.78%、tubulinβⅢ阳性率19.00%±1.58%、Chat阳性率19.30%±1.38%和GFAP阳性率39.17%±1.95%。RT-PCR显示骨髓间充质干细胞能够表达BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF;而ELISA分析证明在骨髓间充质干细胞传第3代时上述神经营养因子处于高峰,CNTF表达量最高,比NT3高15倍；从传第1代到第5代CNTF表达变化小于1倍,但是BDNF表达变化则多于8倍；分化为神经元样细胞后表达上述神经营养因子的能力下降,特别是CNTF及BDNF下降至一半；在诱导7天时NGF、BDNF、GDNF表达略高于诱导14天,而CNTF、NT3的表达则比诱导14天时稍减少。结论：1.骨髓间充质干细胞能够表达BDNG, NGF, CNTF, GDNF和NT3,且在细胞传第叁代时处于高峰,以CNTF的表达量最高。2.骨髓间充质干细胞诱导分化后为神经元样细胞后表达上述神经营养因子含量下降,以CNTF及BDNF下降最明显。3.在诱导7天和14天时,上述神经营养因子表达量相当。目的：研究骨髓间充质干细胞移植于切断胫神经远端观察表达上述神经营养因子以及向神经元样细胞分化的情况；进一步观察骨髓间充质干细胞延缓失神经支配的骨骼肌萎缩作用和沉默骨髓间充质干细胞表达CNTF对延缓失神经骨骼肌萎缩的影响。方法：取成年Wistar雄性大鼠,分为4组：Ⅰ,对照组(n=24)；Ⅱ,CNTF注射组(n=24)；Ⅲ,RNA干扰沉默CNTF表达的骨髓间充质干细胞移植组(n=24)；Ⅳ,骨髓间充质干细胞移植组(n=24)。每组大鼠的远端胫神经分别被注射5ulDMEM, 5ulCNTF,2.5×105RNA干扰沉默CNTF表达的骨髓间充质干细胞和2.5×105骨髓间充质干细胞。分别于术后4、8和12周获取标本行腓肠肌张力、腓肠肌湿重比率、腓肠肌纤维横截面积维持率及叁色染色观察肌萎缩情况；同时行在12周时行骨髓基质干细胞标志物CD44、CD90；神经元标志物NF、GFAP及神经营养因子BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF免疫荧光染色观察骨髓间充质干细胞表达神经营养因子与分化情况以及扫描电镜观察神经肌肉接头处突触后膜变化情况。结果：在移植后4、8和12周腓肠肌肌张力测试发现,在所有各组肌张力呈持续下降趋势,特别是Ⅰ组；而且腓肠肌湿重比率、腓肠肌纤维横截面积维持率下降趋势与肌张力变化相似；各组间两两比较,结果显示腓肠肌湿重比率、腓肠肌纤维横截面积维持率,Ⅳ组与Ⅰ组、Ⅱ组比较差异有显着性(P<0.05)；Ⅲ组与Ⅰ组、Ⅱ组比较差异有显着性(P＜0.05)；Ⅱ组与Ⅰ组比较差异有显着性(P<0.05)；然而,Ⅲ组与Ⅳ组比较差异无显着性(P＞0.05)。腓肠肌叁色染色发现,Ⅰ组肌纤维大部分被胶原纤维组织替代,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组尚有肌纤维组织得以保持,其中,Ⅳ组优于Ⅲ组优于Ⅱ组。在细胞移植后12周取远侧胫神经标本行免疫荧光染色,发现骨髓基质干细胞标志物CD90呈阳性,同时行神经营养因子BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF染色呈阳性,而神经元标志物NF、GFAP呈阴性。进行描电镜显示,Ⅳ组神经肌肉接头处突触后膜皱襞深度与密度优于Ⅲ组优于Ⅱ组优于Ⅰ组。结论：1.骨髓基质干细胞具有延缓失神经骨骼肌肌萎缩的作用；；2.骨髓基质干细胞在缺少某种神经营养因子--CNTF的情况下延缓失神经骨骼肌肌萎缩的作用未发生改变；3.骨髓基质干细胞之所以能够延缓失神经骨骼肌肌萎缩可能因为在周围神经中存活并分泌神经营养因子,而不是分化为神经元样细胞；4.突触后膜的变化与腓肠肌形态与功能的变化一致,我们推猜骨髓基质干细胞表达的神经营养因子是通过神经肌肉接头处的突触后膜发挥延缓失神经骨骼肌肌萎缩。摘要目的：研究骨髓间充质干细胞对突触后膜AchR表达的影响及引起其变化的细胞信号转导通路情况。方法：将Sol8肌管细胞培养于含10%FBS的高糖DMEM中待其达到60%融合时,通过构建慢病毒载体(LVTHM)将AchR和ERBB3共转染Sol8肌管细胞,通过RT-PCR验证转染效率；将共转染后的Sol8肌管细胞与传第叁代的骨髓基质干细胞共培养48小时；实验分两组：A：Sol8肌管细胞组；B：共培养组；通过Western blot测定Sol8肌管细胞AchR表达情况以及细胞信号转导通路ERBB3(细胞膜)→Ras→Raf→MAPK(细胞质)的变化情况。结果：经RT-PCR测定发现Erbb3转染率为84.3%,AChRδ转染率为83.3%Western blot结果发现,骨髓间充质干细胞与共转染后的Sol8肌管细胞共培养48hr后观察发现,AChRδ表达增加,细胞膜ErbB3表达上调,同时发现Sol8肌管细胞内Ras、Raf、MAPK细胞信号蛋白表达增加。结论：1.骨髓间充质干细胞能使突触后膜AchR表达上调；2.其机制是通过ERBB3(细胞膜)→Ras→Raf→MAPK(细胞质)信号转导通路。
陈兵, 尹延庆, 柯俊龙, 邹新辉, 彭浩[7]2010年在《川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞:最佳诱导剂量筛选》文中研究指明背景:目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体。目的:观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的最佳浓度。方法:SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50g/L3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。结果与结论:①原代细胞接种3d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25g/L为最适诱导剂量。
徐小霞[8]2009年在《人胎盘绒毛层间充质干细胞体外培养的优化及生物学特性的初步分析》文中认为间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一种具有自我更新和多向分化能力的干细胞,有着良好的临床应用价值。以往研究主要集中在人骨髓来源的间充质干细胞,但由于人骨髓来源的间充质干细胞的获得需要通过骨髓穿刺,而且其数量随年龄的增长而急剧下降,限制了人骨髓源间充质干细胞的应用。因此,越来越多的研究者开始寻找间充质干细胞的其他来源,例如外周血、脐带血、脐带、乳牙以及胎盘。胎盘作为孕妇妊娠后的废弃物,易于获得且对其研究和应用无伦理道德的争论,成为间充质干细胞来源的新的研究热点。2007年人胎盘源间充质干细胞研究国际会议对人胎盘源间充质干细胞的临床应用潜能给予了充分肯定。但是MSCs在胎盘组织中的分布以及如何有效地在体外获得和扩增是亟待解决的问题。为此,本研究采用常规方法获取人胎盘绒毛层间充质干细胞(Human placenta chorion derived MSCs,hCMSCs),在此基础上,对hCMSCs体外扩增的条件及生物学特性作初步分析,从而为实验研究和临床应用快速有效提供种子细胞奠定基础。第一部分hCMSCs的组织定位及体外分离培养与鉴定目的:确定hCMSCs的组织定位,从胎盘绒毛层组织体外分离培养hCMSCs,在此基础上诱导其向神经元样细胞和脂肪细胞分化,为体外优化培养hCMSCs提供实验参数。方法:采用免疫组织化学染色确定hCMSCs在胎盘绒毛层中的组织定位;选择性剪取胎盘绒毛层组织,经IV型胶原酶消化、贴壁和传代培养获得hCMSCs;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测其表面标志;倒置显微镜观察细胞形态;采用多种诱导条件分别将其向脂肪细胞、神经元样细胞方向诱导以观察细胞的分化潜能。结果:(1)免疫组织化学染色结果显示,胎盘绒毛层中轴血管周围富有CD105、CD90阳性的间充质干细胞;(2)采用机械分离和IV型胶原酶消化法体外分离培养能有效获得hCMSCs;(3)倒置显微镜观察hCMSCs呈典型的成纤维样贴壁生长,流式细胞仪分析显示,hCMSCs高表达CD73、CD90和CD105,不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(4)hCMSCs向神经元样细胞诱导后,诱导细胞呈神经元样细胞形态,NSE免疫荧光染色呈阳性;(5)hCMSCs经成脂诱导2周后,胞内有明显的脂滴出现,油红染色呈阳性。结论:从人胎盘绒毛层组织富集hCMSCs,经机械分离和酶消化法结合,能有效地获得hCMSCs,流式细胞术及诱导分化结果提示获得的hCMSCs具有间充质干细胞标志及诱导分化能力,可以成为体外优化培养的种子细胞。第二部分细胞因子对hCMSCs体外促增殖作用及其生物学特性的影响目的:优化hCMSCs的体外培养条件,并对优化培养条件培养的hCMSCs生物学特性进行初步分析,为实验研究和临床应用快速有效地提供种子细胞奠定基础。方法:选择性剪取人胎盘绒毛层组织,通过0.1%IV型胶原酶消化,按常规培养方法培养两代后用于细胞增殖实验,MTT法检测下列不同浓度不同细胞因子:人白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、激发型鼠抗人IL-6信号传导链GP130(glycoprotein130 , GP130)、人巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)、人干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)、人Flt3配体(flt3 ligand,FL)、人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对hCMSCs的增殖作用;光学显微镜观察优化培养条件下培养的hCMSCs的细胞形态;流式细胞仪检测优化培养条件下培养的hCMSCs的细胞表型;油红染色及免疫荧光分别鉴定优化培养条件下培养的hCMSCs向脂肪细胞及神经元样细胞诱导分化的潜能;RT-PCR分析FL的受体flt3的基因表达。结果:(1)MTT法检测及细胞计数结果表明,比较不同浓度的不同细胞因子对hCMSCs体外增殖作用的影响,含bFGF、FL的培养条件均能有效地促进细胞的体外增殖,而FL的促增殖作用更强;(2)光学显微镜观察发现含bFGF、FL的培养条件培养的细胞呈典型的成纤维样贴壁生长;(3)流式细胞仪检测结果显示含bFGF、FL的培养条件培养的hCMSCs高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(4)含bFGF、FL的培养条件培养的细胞经神经元样细胞诱导分化后NSE免疫荧光染色呈阳性;向脂肪细胞诱导后有脂滴的出现;(5)RT-PCR结果显示hCMSCs表达flt3的mRNA。结论:诸多生物因子中bFGF和FL具有较强的促hCMSCs体外增殖作用而FL作用更为明显,同时其能保持hCMSCs的细胞形态、细胞表型及多向分化潜能,因此FL可以作为体外培养hCMSCs的良好生长因子。本研究明确了人胎盘源间充质干细胞在胎盘绒毛层的组织定位,建立了有效分离、体外扩增hCMSCs的实验体系,在此基础上,证明了FL具有有效地促hCMSCs体外增殖的作用,而且hCMSCs表达FL的受体flt3,为下一步研究FL对hCMSCs促增殖作用的作用机制研究提供实验依据。
邢小丽[9]2008年在《大鼠视网膜匀浆上清液体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞实验研究》文中研究说明目的随着眼科临床和基础研究的进步,白内障、角膜病等可得到有效控制和治疗,但一些致盲性视网膜疾患如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼视神经视网膜病变等采用目前的方法无法逆转。目前青光眼视神经保护的策略是在有效降低眼压的基础上,针对视神经损害的不同环节,利用不同的药物,保护患者视功能。此外,通过移植细胞使视网膜细胞更新是治疗神经变性疾病的另一种方法,逐渐受到关注。用于移植的细胞有脑源性神经干细胞、视网膜祖细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)等。本课题旨在探讨体外诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化的可能性和条件,为青光眼视神经视网膜损害及其它视网膜退行性疾病的治疗提供种子细胞奠定实验基础。方法本课题选用大鼠骨髓间充质干细胞,根据其取材方便,便于体外扩增,可自身取材,来源丰富,免疫源性低等特性,对BMSCs进行体外诱导为神经元细胞进行研究。本研究包括2部分:1.大鼠BMSCs的培养和鉴定采用贴壁筛选法获得BMSCs,体外增殖纯化,获得纯化干细胞。流式细胞仪细胞鉴定。2.BMSCs经bFGF预诱导后,以β-巯基乙醇(β-BM)和视网膜匀浆上清液为诱导剂进行诱导。用倒置相差显微镜观察细胞形态,细胞免疫组织化学法检测诱导后各组细胞巢蛋白(Nestin),神经丝蛋白(NF),神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等特异性标志物的表达。结果1.大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定(1)细胞分离培养通过贴壁法能获得纯度较高的BMSCs,原代培养3天后细胞呈纺锤形。7天后细胞呈团簇、集落状生长。细胞传代后,24h细胞大部分贴壁,传代后细胞增殖旺盛,仍呈梭形。传代过多细胞增殖减慢,可见到一些扁平,宽大的细胞。(2)流式细胞仪检测细胞表面标志表达CD90、CD29、CD44,不表达CD34、CD45、CD31。(3)多向分化潜能在含有诱导剂的培养基中,BMSCs可在体外分化成为成骨细胞、脂肪细胞。(4)10%血清浓度为BMSCs生长最佳浓度。(5)不同传代细胞增殖能力不同,P_1和P_3代细胞强于P_8代细胞。2.体外神经分化(1)β-BM体外诱导BMSCs分化加入5 mmol/Lβ-BM1h左右开始细胞质向核收缩,胞体变小,变圆,透亮,并出现细胞突起,随时间延长部分细胞胞体收缩,细胞突起变细、变长,呈双极及多极,但数量不多。5h后更多细胞出现类神经细胞改变,细胞突起相互交织。少数细胞悬浮。诱导1h后Nestin阳性率高于NSE和NF,差异有显着性(P＜0.01);诱导5h后Nestin阳性率低于NSE和NF,差异有显着性(P＜0.01)。NSE阳性率1h和5h,差异无显着性(P＞0.05)。Nestin:1h高于5h,差异有显着性(P＜0.01)。NF:1h低于5h,差异有显着性(P＜0.01)加入10 mmol/Lβ-BM诱导30 min左右细胞开始出现神经元细胞样形态,但较多细胞悬浮。诱导1h后阳性率NSE＞NF＞Nestin,差异有显着性(P＜0.001),诱导5h后Nestin阳性率低于NSE和NF,差异有显着性(P＜0.01)。NSE和NF:阳性率1h低于5h(P＜0.01),Nestin则相反。各组GFAP和对照组抗体染色阳性率在任何时间较其它抗体明显低,差异有显着性(P＜0.01)。(2)视网膜匀浆上清液诱导BMSCs向神经元细胞分化两组不同浓度视网膜匀浆上清液均能诱导BMSCs向神经细胞分化,与β-BM相比作用比较缓和,3天为分化高峰。诱导细胞存活时间1周以上。大鼠视网膜匀浆上清液诱导24h后,不同浓度组Nestin阳性率均明显高于NSE和NF,差异有显着性(P＜0.01)。诱导3d后Nestin抗体染色阳性细胞数量减少,大部分神经元样细胞NSE和NF染色阳性,差异有显着性(P＜0.01)。诱导7d后,Nestin抗体染色阳性细胞明显减少,大部分神经元样细胞NSE和NF染色阳性,差异有显着性(P＜0.01)。NSE与NF:诱导24h比3d和7d阳性细胞率低,差异有显着性(P＜0.01)。3d和7d差异无显着性(P＞0.05)。高浓度组阳性细胞率高,差异有显着性(P＜0.01)。Nestin:随诱导时间延长阳性率逐渐降低,各组差异均有显着性(P＜0.01)。高浓度组阳性细胞率高,差异有显着性(P＜0.01)。各组GFAP和对照组抗体染色阳性率在任何时间较其它抗体明显低,差异有显着性(P＜0.01)。结论1.β-BM在体外可诱导BMSCs分化为神经元样细胞,5mmol/L浓度为最佳浓度。诱导细胞早期表达神经干细胞标志物Nestin,以后表达成熟神经元标志物NF,NSE,不表达胶质细胞标志物GFAP。诱导细胞存活时间短。2.视网膜匀浆上清液可在体外诱导BMSCs分化为神经元样细胞;诱导细胞表达标志物与β-BM诱导细胞相似。匀浆液作用缓和,细胞存活时间长,但分化率较低。
林砚铭[10]2013年在《中药复方诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究》文中研究说明目的：本研究旨在通过补肾填精的中药复方(左归丸)诱导骨髓间充质干细胞分化,并通过免疫组化鉴定诱导分化后的细胞为神经元样细胞,从而为“肾藏精、生髓”的传统中医理论提供相应的实验依据。方法：实验一利用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,并在体外扩增、纯化,倒置显微镜下观察其形态,利用左归丸药液对分离后的细胞进行诱导分化,通过阿利新蓝染色、改良钙钴法碱性磷酸酶染色、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色以鉴定分化后的细胞是否为成骨细胞、软骨细胞、神经元样细胞。实验二利用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,利用左归丸拆药后的各组药液分别对获得的细胞进行诱导分化,并进行神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色,计其阳性表达的细胞。结果：实验一显示,分离纯化后的细胞,经倒置显微镜观察其形态,再左归丸药液诱导分化后,经阿利新蓝染色、改良钙钴法磷酸酶染色、神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学染色,证明获得的细胞向软骨细胞、成骨细胞、神经元样细胞进行了分化,获得的细胞的形态符合骨髓间充质干细胞的形态表现。实验二将获得的骨髓间充质干细胞,用左归丸拆药后的各组药液对其进行诱导分化,经NSE染色后计阳性表达细胞,结果显示撤出熟地NSE表达明显增高；撤除枸杞后阳性表达率下降最多,其次是山茱萸、山药、牛膝；撤出菟丝子不影响该酶的表达。结论：实验一：采用全骨髓贴壁法获得的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞；中药复方左归丸对大鼠骨髓间充质干细胞有多向诱导分化作用。实验二：撤出熟地神经元烯醇化酶表达增高,提示熟地可能对BMSC向神经元样细胞方向分化有一定抑制作用(或调控作用)；枸杞对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导作用最强,其次是山茱萸、山药、牛膝：菟丝子对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化无明显的促进作用。
参考文献：
[1]. 六味地黄丸联合bFGF诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究[D]. 龚圆渊. 成都中医药大学. 2012
[2]. 骨髓间充质干细胞向神经细胞、成骨细胞诱导分化的研究[D]. 段祥. 苏州大学. 2007
[3]. 小鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞[D]. 胡亮. 西北农林科技大学. 2006
[4]. 视黄酸诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究[D]. 马琳琳. 天津科技大学. 2010
[5]. 大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响[D]. 陈文超. 山西医科大学. 2011
[6]. 大鼠骨髓间充质干细胞体内外表达神经营养因子与体内移植延缓失神经骨骼肌萎缩及其机制的实验研究[D]. 蒋军健. 复旦大学. 2010
[7]. 川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞:最佳诱导剂量筛选[J]. 陈兵, 尹延庆, 柯俊龙, 邹新辉, 彭浩. 中国组织工程研究与临床康复. 2010
[8]. 人胎盘绒毛层间充质干细胞体外培养的优化及生物学特性的初步分析[D]. 徐小霞. 苏州大学. 2009
[9]. 大鼠视网膜匀浆上清液体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞实验研究[D]. 邢小丽. 天津医科大学. 2008
[10]. 中药复方诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究[D]. 林砚铭. 成都中医药大学. 2013