朱建中[1]2000年在《对虾白斑综合征病毒在螯虾的增殖与动态分布及其基因组片段的测序、克隆与表达》文中研究指明应用生活于淡水的克氏原螯虾（Cambrus proclakii，简称螯虾）作为动物模型，研究对虾白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV前称无包埋体对虾病毒，NOSV）在动物体内的增殖特性和机理，同时测定分析WSSV基因组片段序列，并将其中的一个阅读框进行了克隆和初步表达。 1．将对虾白斑综合征病毒（WSSV）接种螯虾，研究其感染增殖特性，涉及感染温度、感染途径、继发感染、半数致死量、免疫保护及保存期等。结果显示病毒增殖随温度升高而加快，温度降低对病毒增殖影响较显著。腹节肌肉、腹节皮下注射及口服WSSV均能使螯虾感染发病，而浸泡WSSV不能使螯虾发病。在螯虾感染后期，螯虾肝胰腺和心脏内的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）大量增殖，形成继发感染。WSSV对螯虾的LD_(50)为10~(-6.5)/ml病毒液。灭活病毒免疫螯虾不能使螯虾形成免疫保护。病毒在整体螯虾冻存较匀浆液优越，保存1年后仍有活力。 2．以螯虾为动物模型，检测药物和消毒剂对WSSV的作用，结果显示，用不同浓度的两种抗病毒药物浸泡螯虾后，螯虾死亡时间较对照组平均延长1.2～2d，其中的一种中药制剂较另一种药物略胜一筹。同时将WSSV分别用两类消毒剂37℃作用10min，再感染螯虾，结果表明，两者能抑制病毒活性，但未能有效灭活病毒。 3．制备WSSV单克隆抗体，建立单抗介导ELISA，同时制备WSSV基因探针，用于DOt-blot检测。从WSSV感染螯虾中提纯病毒，纯化病毒免疫BalB/C小鼠，采用细胞融合法获得4株杂交瘤细胞，四株单抗均属IgM。其中一株4E_5在免疫转印中与37.5K左右的病毒条带呈阳性反应，用此株单抗作一抗，建立检测病毒蛋白的间接ELISA法，该方法能检测出感染组织中的病毒，而正常螯虾组织呈阴性。从重组质粒pAFD中回收WSSV 400bp大小基因组片段，用地高辛标记后制备探针，作DOt-blot，能灵敏、特异地检出感染组织中的WSSV。单抗介导ELISA和Dot-blot检测结果具有较好的一致性，后者较前者灵敏。 南京农业大学 博土学位论文 4．苗虾口服、肌注感染WSSV青岛株，斑点杂交与单抗介导ELISA检测体内动态分布。口服和肌注螫虾在感染后12h，病毒首先在血淋巴中出现，然后从血淋巴中消失，但口服组整虾在感染后96h，大量病毒又在血淋巴中出现，并维持到12加；口服36h和肌注24h，病毒在兹虾心脏和肌肉中同时出现，然后呈总体递增分布：此外，病毒在螫虾肠上皮、卵巢、真皮和结缔组织也有不同程度分布。感染死亡螫虾各主要组织器官均可检出病毒，口服组真皮含毒量最高，肌注组肠上皮、鳃、真皮、卵巢含毒量较高，表明此时病毒已形成周身感染。 5．用自行分离的WSSV射阳株感染螫虾，用斑点杂交和单抗ELISA检测其动态分布，并与WSSV青岛株相比较。鳖虾在口服和肌注感染后12h，射阳株首先在血淋巴中检出，36h时在肠上皮、心脏、肌肉中同时出现，井呈总体递增分布。斑点杂交、单抗ELISA和电镜观察均可从死亡袒虾各主要组织器官检出病毒，显示死亡凿虾内病毒已形成周身！4染。椎测WSSV首先进入血淋巴，然后扩散到心脏、肌肉、肠上皮等组织器官并在其内增殖，继而再次释放到血淋巴，最终形成周身感染直至赘虾死亡。与WSSV青岛株在繁虾的体内动态大体相仿。 6．取WSSV基因组随机文库中一个大小约skb的克隆片段测序，DNA序列用 DNA Sfor软件进行分析，共发现 43个 100hp以上开放性阅读框架（Ony），其中一条链31个，互补链12个。用BLAST软件将43个Ony及其推导的氢基酸序列分别与GeneBank中核酸蛋白数据库序列进行同源性比较，结果无显著同源性。在此测序片段中，发现一个 sl obp阅读框架，其编码氢基酸序列与海栖热袍菌外膜蛋白具有24％的同源性，设计一对引物，扩增该阅读框，用T载体克隆，并按正确阅读框架连接到大肠杆菌表达载体pGEX－6P－l上。重组菌经IPTG诱导后，菌体SDS－PAGE显示有一个大小为56K的融合表达蛋白产生。
秦崇涛[2]2012年在《对虾白斑综合症病毒性质和蛋白激酶wsv083的研究》文中认为对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是一种杆状DNA病毒，具有囊膜和被膜，DNA为双链环状。WSSV是目前对虾的最主要的病害，对对虾养殖业造成了巨大危害。所以对WSSV的性质和感染机制等研究对于对虾养殖业意义重大。本研究的主要内容如下：①测定WSSV粒子的质量和其基本组成；②探讨微生物在感染了WSSV的螯虾死亡过程中所起的作用；③研究了WSSV囊膜表面的蛋白的种类；④对WSSV的一个蛋白激酶wsv083进行了初步研究。结果如下：1、通过先计算出WSSV基因组的质量，再测定WSSV的基因组DNA占整个WSSV粒子质量的比例的思路，计算出了一个完整WSSV粒子的质量。进一步测定得到WSSV悬液的每个OD600相当于3.34×108/l的病毒浓度。另外，WSSV各组分在总重量中的比例经测定如下：基因组DNA占10.17%，核衣壳中的蛋白占43.07%，囊膜中的脂类含量约为22%，囊膜中的蛋白质含量约为24.76%；另外还测定了四种主要膜蛋白的相对比例。2、为了研究微生物在感染了WSSV的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的死亡过程中的作用，对染毒螯虾注射抗生素，发现其死亡率与对照组相比有明显下降。平板计数结果显示染毒螯虾的血淋巴中微生物数量有明显增加。分析表明主要是嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、弗劳地柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）和琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）等条件致病菌。而抗生素对WSSV的增殖没有显著影响。研究结果表明螯虾在感染了WSSV后血细胞的消失导致体内病原微生物的数量大幅增加，从而加速了螯虾的死亡速度。3、利用生物素标记转移技术对牛血清白蛋白（BSA）和凡纳滨对虾的鳃细胞膜蛋白进行标记，研究其与对虾白斑综合症病毒（WSSV）之间的相互作用。发现分子量在50-56KD之间的两种蛋白质位于WSSV的表面，并且与鳃细胞膜蛋白具有特异性的相互作用。根据分子量推测可能是病毒的两种膜蛋白，VP52A和VP56。4、把wsv083在大肠杆菌中进行表达和纯化，与纯化的VP28和VP19置于激酶缓冲液中看能否催化磷酸化。研究结果表明wsv083并不具备这个功能。另外还发现wsv083存在苏氨酸和酪氨酸的磷酸化，但没有丝氨酸的磷酸化。而wsv083的突变体则没有磷酸化。结果表明wsv083可以催化自身磷酸化。但其具体功能还需进一步研究。
许雅香[3]2003年在《对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白基因克隆、表达及表达产物抗病效果的研究》文中研究说明本研究以中国对虾为材料，从病虾组织中分离出白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，简称WSSV)野生毒株(暂时命名为浙江株，WSSV-ZJ)，以该病毒基因组为模板，采用PCR技术扩增了WSSV-ZJ的囊膜蛋白VP28和VP19的基因，分别采用大肠杆菌和杆状病毒-昆虫表达系统进行了这两个基因的表达研究，并初步试验了蚕蛹表达产物在螯虾抗对虾白斑综合征(WSS)的效果。主要研究结果如下： 1．2001年5月从浙江省象山县某对虾养殖塘采集患白斑病的中国对虾，用WSSV的实验模式动物克氏原螯虾(Cambarus proclarkii)作了动物回归试验，试验虾在3～10天内几乎全部死亡；用蔗糖密度梯度法纯化的病毒在电镜下的大小、形态特征与WSSV极为相似(完整的病毒粒子大小约100×400nm，核衣壳大小约60×350nm)；以该病毒基因组DNA为模板，应用PCR技术，扩增出了WSSV的特异性条带，从而从病毒的致病性、形态特征和特异性DNA片段等方面证实了分离获得的病毒是对虾白斑综合征病毒。 2．利用PCR技术，扩增获得了病毒的两个囊膜蛋白基因，基因序列全长分别为615bp和366bp，编码的氨基酸残基数分别为204和121，它们与GenBank中登录的WSSV囊膜蛋白VP28和VP19基因的同源性均在99％以上，而与其它病毒DNA片段的同源性则很低。 3．将克隆到的vp28、vp19基因通过适当的酶切后插入到表达载体pET30a的多克隆位点中，获得重组质粒pET30a-vp28和pET30a-vp19。将它们导入E.coli.BL21中，在37℃下，经IPTG诱导表达4小时后，用SDS-PAGE和Western blotting进行检测，发现vp28基因的表达产物均出现了明显的特异性条带，其融合表达产物的大小与预测的一致，而在vp19基因均未见表达产物的特异性条带。 4．为了获得与天然VP28、VP19结构与活性较一致的表达产物，本研究采用了表达产物后加工较完善的杆状病毒一家蚕表达系统。将克隆到的vp28、vp19基因通过适当的酶切后插入到转移质粒pBlueBacHisC的多克隆位点中，获得重组质粒pBlueBacHisC-vp28和pBlueBacHisC-vp19。将重组质粒分别与新型杂交病毒HyNPV(具有BmNPV和AcNPV双重优点)共转染Sf9细胞(秋粘虫细胞株)，通过蓝白斑筛选分别获得了重组病毒HyNPV-vp28和HyNPV-vp19(滴度分别为：0.69×10~(7.7)和0.69×10~(7.6))。将这两种重组病毒分别感染Sf9细胞，三天后细胞均发生了严重的病变；将它们分别穿刺接种家蚕五龄起蚕，3～4天后家蚕出现了明显的发病症状(蚕体体壁半透明，环节肿胀等)。接种后4-5天，取病蚕的血淋巴进行SDS-PAGE和Western blot检测，均出现了明显的特异性条带。融合表达产物的分子量比根据核苷酸序列预测的分别要大4KD左右，与天 浙江人学博士学位论文；中文摘要然的VP28、VP19分子量较一致，证明在该表达系统中表达产物得到了较完善的后加工。 5．将含重组WSSV囊膜蛋白的蚕蛹加入饵料，用克氏原螫虾（WSSV的实验模式动物）进行了抗 WSS的初步试验。以 0O、l0、50和 20O的比例在基础饵料中分别添加含重组蛋白VP28、VP19和VP28＋VP19的蚕蛹。结果显示：（l）在试验最初的 15天中，试验组平均死亡率为 18．5％，其中组 14（含20％VP28＋VP19的蚕蛹）死亡率高达50％，而作为对照的组1（不加蚕蛹）为3．3％，组2、3、4（加 1O、5O、20O无病毒感染蚕蛹）平均为 6．7O，组 5、6、7（加 1O。5o、20OH州PV病毒感染的蚕蛹）平均为7．8O，组14死亡率比三个对照组分别高 46．7O（PMO．of）、43．3O（PMO．of）和 42．2O（PMO．01），其它试验组与对照均无显著差异（P＞队05）；（2）在试验第16一3O天期间，试验组平均死亡率为3．5％，三个对照平均死亡率为3．3％，二者无明显差异（P＞O．05人 门）在试验的第 31、32天攻毒M天（饲喂含 WSSV的病虾肉），于第 34天开始发病，在第37—40天期间出现死亡高峰，在第45天试验结束时，试验组平均死亡率为7．7O，三个对照平均为97．lO，前者比后者低89．4O（PMO．of）。
曹煜[4]2010年在《抗重组VP28囊膜蛋白单克隆抗体的制备及在对虾白斑综合征病毒检测中的应用》文中研究表明对虾白斑综合征(WSS)是全球对虾养殖业所面临的危害最大,传播最广的病害之一,至今已席卷了整个世界的对虾养殖地区,造成了巨大的经济损失。但目前尚无良好有效的防治手段,因此早期检测和预防WSS成为近年来的研究热点。本研究主要克隆、表达了其病原对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了单克隆抗体(单抗),同时对制备的单抗在wssv检测中的应用进行了初步探索,研究结果将为对虾自然感染WSSV状况检测和监测提供技术支撑,对了解病毒的感染与传播,进而控制该病毒的继续蔓延有重要的意义,研究内容和结果如下：1)采用改良的差速离心法从人工感染WSS的克氏原螯虾中分离纯化了WSSV。完整的病毒外包被着囊膜,长约300～400nm,直径约100～120 nm。失去囊膜剩下的核衣壳呈螺旋圆柱体形,长约300～450 nm,直径约80～90 nm。纯化的病毒形态和大小与先前报道的结果相似。2)以纯化病毒基因组为模板,通过特定引物的设计,利用PCR扩增技术,克隆得到了完整的WSSV囊膜蛋白VP28基因,把该VP28基因在大肠杆菌中进行表达并用Ni-NTA柱纯化后,分别用SDS-PAGE和Western Blot进行蛋白鉴定。结果显示表达产物均出现了与预测大小一致特异性条带,表明VP28基因成功在大肠杆菌中进行了有效表达。3)利用纯化的重组VP28蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞,并克隆了能稳定分泌强阳性单克隆抗体的一株杂交瘤细胞株anti-rVP28 MAb。通过ELISA和免疫电镜对单抗的特异性进行了分析,结果表明所制得的单抗可以特异性地与WSSV上的VP28蛋白结合,说明用重组VP28蛋白抗原刺激筛选得到的单抗能识别天然的VP28蛋白表位,可用于WSSV的检测。4)通过Dot-blotting对WSSV进行快速的检测试验,发现anti-rVP28 MAb能有效地检测WSSV。竞争性PCR结果表明anti-rVP28 MAb检测WSSV的极限为病毒量104拷贝,这为WSSV感染的早期检测提供了可能。
罗展[5]2006年在《重组表达的基因改造粘附蛋白（rVAP1）对白斑综合征病毒（WSSV）感染的阻断作用》文中指出对虾白斑综合征病毒(WSSV)是危害全球对虾养殖业的主要病原微生物之一。至今己造成了巨大的经济损失,同时也给海洋生态平衡带来了一定的威胁。自1992年以来,已经对该病毒及对虾白斑综合征进行了大量的研究。目前,还未弄清WSSV致病的分子机理,没有找到有效的措施防治白斑综合征。通过在平板上贴NC膜的方法,快速筛选高表达克隆。筛选并成功的表达了WSSV重组基因改造粘附蛋白(rVAP1)毕赤酵母高表达菌株。通过SDS-PAGE及与膜蛋白结合活性鉴定表达产物。将筛选出的高表达菌株A-27进行实验室小规模发酵并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。以克氏原螯虾为模式动物,将WSSV注射螯虾,测定病毒液的滴度(LD50)。研究了小规模发酵rVAP1高表达菌株的表达产物对WSSV对螯虾感染的阻断作用。螯虾感染实验证明注射rVAP1 1.6μg/尾对病毒滴度小于6.81 LD50以下剂量的WSSV感染具有较好的阻断效果并能延迟螯虾的死亡时间。本研究为阐明WSSV致病机理提供了理论基础。为进一步开发抗WSSV药物和饵料,更加有效的防治WSSV及相关科研提供了新思路。
康桦华[6]2005年在《克氏原螯虾免疫相关因子的功能研究及对虾白斑综合征病毒易变区的比较》文中研究说明人工感染对虾白斑综合征病毒(WSSV),克氏原螯虾在感染的2,4,8,16,32h后测定螯虾血淋巴中的酚氧化酶活力,通过交叉吸附实验及红细胞凝集实验测定凝集素的凝集活性。结果显示,在感染的最初8h酚氧化酶活力呈上升趋势,随后的16h和32h则出现下降现象;而血淋巴上清对鸡红细胞的凝集效价没有发生阶段性变化。说明WSSV在螯虾体内的增殖对酚氧化酶活力有影响,而对其凝集素的凝集活性没有影响。 据本课题组从克氏原螯虾中新发现的丝氨酸蛋白酶抑制物的基因序列(GenBank登录号CD644775)设计一对引物,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从克氏原螯虾血淋巴细胞中扩增出丝氨酸蛋白酶抑制物基因PCI188,将其连入原核表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌Rosetta菌株和BL21菌株中进行蛋白表达,结果该蛋白只在前者表达。表达产物用免疫转印检测,出现50kD的特异性条带,与已知的与螯虾免疫相关的PCI188基因编码的蛋白大小相符。 组氨酸亲和层析柱纯化丝氨酸蛋白酶抑制物融合蛋白后免疫新西兰兔,经琼脂双向扩散实验测定抗体水平合格,用免疫血清与克氏原螯虾血淋巴作用后测定酚氧化酶活力,结果显示,酚氧化酶活力有所升高,从而首次证实螯虾PCI188编码的蛋白对丝氨酸蛋白酶有抑制作用。 此外,比较了对虾白斑综合征病毒(WSSV)的泰国株(TH株)、中国株(CN株)、中国台湾株(TW株)易变区的差异,根据GenBank中这些毒株的两端外延保守序列设计一对特异性引物,分别用PCR方法扩增并克隆2004年中山株(ZHSH株)、2002年湛江株(ZHJ株)、2002年海南株(HN株)、1996年青岛株1(QD1)和传代后的青岛2株(QD2)5株毒株的易变区基因,采用DNAStar软件对序列进行比对、同源性计算和基因进化树的绘制,分析了不同毒株间易变区的特点,推测易变区与WSSV的进化有密切的关系。
林颖博[7]2009年在《中国对虾血细胞发生、功能及其白斑综合征病毒受体蛋白研究》文中指出本论文在研制的抗中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞单克隆抗体的基础上,通过间接免疫荧光技术首次检测到中国对虾血细胞最早出现于肢芽期,大颗粒细胞最早出现于膜内无节幼体期;通过流式细胞技术研究发现,中国对虾血细胞对荧光微球的吞噬率在注射后迅速升高并在6h后达到最高值,被吞噬的荧光微球在淋巴器官中积累,血细胞吞噬率在白斑综合征病毒(WSSV)感染后虽在短时间内升高但随后迅速降低;论文建立了差速离心法提取的中国对虾血细胞膜与地高辛标记WSSV的Dot-Blot和ELISA体外结合体系作为筛选体系,从制备的中国对虾血细胞膜单克隆抗体中筛选到一株对WSSV具有阻断作用的单克隆抗体R2H1,为进一步研究WSSV与宿主的相互作用机理提供了基础。(1)利用杂交瘤技术,论文制备了特异性识别中国对虾所有三类血细胞的单抗2A3和特异性识别中国对虾大颗粒血细胞中细胞质颗粒的单抗1H11。通过对包括囊胚期、原肠胚期、肢芽期、膜内无节幼体期和无节幼体Ⅰ期在内的中国对虾胚胎的间接免疫荧光检测,最早在肢芽期胚胎中检测到2A3阳性信号;在膜内无节幼体期,2A3阳性血细胞平均直径约7μm,聚集成簇;在无节幼体Ⅰ期,血细胞形态更加完整清晰,平均直径已与成体对虾血细胞相似。1H11阳性大颗粒细胞最早在膜内无节幼体期胚胎中出现,这些细胞同样成簇存在,在其细胞质外围可见点状荧光。在无节幼体Ⅰ期样品中,血细胞总数和大颗粒细胞数量较胚胎期都显著增加,反映了对虾免疫系统随着胚胎发育的进行而加强。(2)流式细胞术分析显示,健康中国对虾血细胞对注射入体内的荧光微球的吞噬在注射后迅速升高并在6h后达到最高点12.58%;随后该比率逐渐下降,至注射后16h实验结束时,血细胞吞噬率已下降到4.02%,反映了血细胞对血淋巴中异物的清除过程。显微镜观察注射微球6h后中国对虾的外周血细胞和淋巴器官,发现主要是半颗粒细胞执行对微球的吞噬,吞噬后的荧光微球在淋巴器官中积累。WSSV感染后第一天,血细胞吞噬率(14.42%)由于应激作用而略高于对照值;随后,该比率迅速降低并维持在对照值的50%左右(6.12%);在感染后第六天,血细胞吞噬率再次上升至11.23%,随后感染对虾大量死亡。(3)论文通过差速离心法提取海捕中国对虾血细胞膜,分别利用Dot-Blot和ELISA技术,使地高辛(DIG)标记的WSSV与之4°C结合4h并以抗DIG抗体作为探针检测,实验结果皆为阳性,证明体外环境下WSSV能稳定地与血细胞膜结合。以抗中国对虾血细胞膜多克隆抗体37°C孵育血细胞膜1h,能够阻断WSSV-DIG与血细胞膜的结合,证明该体外结合体系可以应用于WSSV阻断剂的筛选。应用ELISA体外结合技术,从制备的中国对虾血细胞膜单克隆抗体中筛选具有阻断效果的阳性孔,克隆获得一株单抗R2H1可以显著(P<0.05)削弱WSSV与对虾血细胞膜的体外结合。以Dot-Blot验证,R2H1阻断组发色明显浅于未阻断组。可以推断,R2H1与中国对虾血细胞膜上的受体蛋白结合,从而抑制了WSSV与血细胞膜的体外结合。
李微[8]2014年在《中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析》文中研究指明病毒感染会激发宿主的免疫应答反应，宿主细胞内的一些因子在这一过程中起着重要的作用，其表达量通常会发生上调或下调的表达变化。白斑症病毒（WSSV）病是危害对虾养殖业健康发展的最重要疾病之一，中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)对其极其易感，为寻找在中国对虾应答WSSV感染反应中起关键作用的蛋白，本文利用蛋白质组学技术鉴定了中国对虾感染WSSV后血细胞中发生差异表达的蛋白质，并对其中的2种蛋白—小泛素相关修饰物（SUMO）和蛋白磷酸酶进行了深入分析，为揭示对虾抗WSSV反应的分子机制提供了重要数据，具体研究内容和结果如下：（1）中国对虾感染WSSV后血细胞差异表达蛋白质的鉴定。双向（2D）电泳分离感染组和对照组对虾血细胞样品，并用PDQuest软件分析2D凝胶。结果成功获得了中国对虾血细胞总蛋白2D图谱，每张凝胶上有约580个蛋白质点被检测出；WSSV感染24后，共有26个蛋白质点呈显著性上调表达（P﹤0.05），19个蛋白质点呈显著性下调表达。随后，对差异表达蛋白质进行质谱分析，共有33种蛋白质得到了成功的鉴定，包括SUMO1、细胞质MnSOD、微管蛋白α1链、微管-肌动蛋白交联因子1、磷酸丙糖异构酶、核受体E75蛋白、空泡ATP合酶亚基BL、肌醇1,4,5-三磷酸受体和精氨酸激酶等；利用生物信息学方法将鉴定的蛋白进行GO功能分类，结果将其分为9个类群，分别为：免疫相关蛋白、刺激应答蛋白、细胞骨架蛋白、DNA或蛋白质结合蛋白、葡萄糖代谢相关蛋白、甾类激素介导的信号转导蛋白、ATP合酶、跨膜转运蛋白和未分组蛋白。此外，利用实时荧光定量PCR检测WSSV感染后对虾血细胞中3种上调表达蛋白（细胞质MnSOD、热休克蛋白70和精氨酸激酶）和1种下调表达蛋白（酚氧化酶原）对应基因的表达变化情况，结果显示，这些因子在mRNA水平的变化与蛋白质组学结果较为一致。（2）中国对虾SUMO及其E2结合酶UBC9的基因克隆与表达分析。从鉴定出的差异表达蛋白质中选取SUMO进行深入分析，首先，采用RACE技术对中国对虾SUMO和UBC9进行基因克隆，结果显示，中国对虾SUMO cDNA全长1128bp，包含一个282bp的开放阅读框（ORF），编码93个氨基酸，其理论分子量为10.6kDa；UBC9cDNA全长1170bp，包含一个483bp的ORF，编码160个氨基酸，其理论分子量为18.4kDa;同源性比对发现，中国对虾的SUMO和UBC9均高度保守。随后，利用实时荧光定量PCR分别检测了SUMO和UBC9mRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，SUMO和UBC9基因在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，二者均在血细胞和性腺中呈高丰度表达；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中这2种基因均呈显著性上调表达，且血细胞中的上调表达更为显著。（3）中国对虾SUMO ORF和UBC9ORF的原核表达及多克隆抗体制备及应用。利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾SUMO ORF和UBC9ORF的重组表达质粒，pET-28a-SUMO和pET-28a-UBC9，诱导表达后得到分子量分别为19.7kDa和25.6kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化；用纯化蛋白免疫小鼠，分别获得了抗SUMO和UBC9的多克隆抗体（PAb）。应用PAb分析中国对虾血细胞中SUMO和UBC9的特性，western blotting结果显示，SUMO的PAb可以特异性识别血细胞中13.5kDa的蛋白，而UBC9的Pab可以识别18.7kDa的蛋白；间接免疫荧光实验结果表明，SUMO分布于血细胞的细胞核和细胞质中，而UBC9主要分布于细胞核中。（4）RNA干扰实验分析SUMO和UBC9在病毒感染中的作用。利用体外转录法，分别合成了SUMO和UBC9的双链RNA（dsRNA），dsSUMO和dsUBC9。随后，将dsRNA注射到对虾体内以研究SUMO或UBC9基因沉默对WSSV感染的影响。结果显示，病毒感染后，RNA干扰组对虾血细胞中的WSSV拷贝数和病毒基因的表达量均较阳性对照组低；累计死亡率曲线显示，SUMO或UBC9的沉默均在一定程度上降低了WSSV感染引起的对虾的死亡。（5）中国对虾蛋白磷酸酶1催化亚基β（PP1β）的基因克隆及原核表达。首先，采用RACE技术对中国对虾PP1β进行基因克隆和生物信息学分析，结果显示，PP1β cDNA全长1214bp，包含一个987bp的ORF，编码328个氨基酸，其理论分子量为37.6kDa；同源性比对发现，中国对虾的PP1β氨基酸序列表现出高度保守性。随后，利用实时荧光定量PCR检测了PP1β mRNA的组织分布情况和在WSSV感染后的表达变化情况，结果显示，PP1β在健康中国对虾各组织中均有表达，但表达水平不同，其中在性腺中表达最高，血细胞次之；WSSV感染后，对虾血细胞和性腺中PP1β基因均呈上调表达，并在12h达到峰值，且血细胞中的上调表达更为显著。此外，利用大肠杆菌系统成功地构建了中国对虾PP1β ORF的重组质粒pET-28a-PP1β，诱导表达后得到分子量为41kDa的重组蛋白，并对目的蛋白进行了纯化。
参考文献：
[1]. 对虾白斑综合征病毒在螯虾的增殖与动态分布及其基因组片段的测序、克隆与表达[D]. 朱建中. 南京农业大学. 2000
[2]. 对虾白斑综合症病毒性质和蛋白激酶wsv083的研究[D]. 秦崇涛. 福建农林大学. 2012
[3]. 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白基因克隆、表达及表达产物抗病效果的研究[D]. 许雅香. 浙江大学. 2003
[4]. 抗重组VP28囊膜蛋白单克隆抗体的制备及在对虾白斑综合征病毒检测中的应用[D]. 曹煜. 浙江大学. 2010
[5]. 重组表达的基因改造粘附蛋白（rVAP1）对白斑综合征病毒（WSSV）感染的阻断作用[D]. 罗展. 中国海洋大学. 2006
[6]. 克氏原螯虾免疫相关因子的功能研究及对虾白斑综合征病毒易变区的比较[D]. 康桦华. 南京农业大学. 2005
[7]. 中国对虾血细胞发生、功能及其白斑综合征病毒受体蛋白研究[D]. 林颖博. 中国海洋大学. 2009
[8]. 中国对虾感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞差异表达蛋白质的鉴定及其特性分析[D]. 李微. 中国海洋大学. 2014
标签：水产和渔业论文; 对虾论文; 中国对虾论文; 血细胞论文; 蛋白质结构论文; 螯虾论文; 重组蛋白论文; 基因合成论文; 死亡基因论文; 蛋白质合成论文; 蛋白质纯化论文; 特异性论文;