余兴龙[1]2000年在《提高猪瘟DNA疫苗免疫保护的探索研究》文中研究指明本实验首先利用以前构建好的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)E2基因疫苗质粒pcDSW免疫CSFV敏感猪，然后用复壮的CSFV石门血毒对免疫猪进行攻击。结果表明：pcDSW免疫猪后可诱导产生CSFV特异性的抗体反应，抵抗强毒的攻击，保护率不低于HCLV所提供的保护水平。pcDSW免疫猪攻毒后，免疫器官无明显病理变化，对照pcDNA3猪攻毒后，发生典型的猪瘟病理特征，免疫器官中可检出病毒抗原，淋巴细胞坏死。可从部分免疫猪血液中检出病毒(3／6)，但免疫猪无猪瘟临床症状和病理变化。为提高免疫效果，探讨了细胞因子对DNA疫苗的免疫促进作用。先构建了猪瘟病毒E2基因与鼠IL-2，IL-3 cDNA的双表达真核载体pIRSTIL-2和pIRSTIL-3。小鼠免疫实验表明IL-2和IL-3对DNA疫苗的免疫应答水平具有明显的提高作用，并且两者间具有一定的协同作用。因此，本实验进一步克隆了猪的IL-2和Il-6的cDNA，并构建了共同表达CSFV E2基因与猪IL-2的双表达质粒pIRE2PIL2。以pIRE2PIL2免疫新生仔猪，然后以CSFV石门血毒进行攻击。虽然结果表明pIRE2PIL2所提供的保护率与不含猪IL-2的E2基因真核表达质粒pIRE2的相似，但实验观察到pIRE2PIL2免疫猪在攻毒后白细胞数不下降，而pIRE2免疫猪白细胞数明显下降，表明IL-2对DNA疫苗可提供一定的免疫增强作用。本实验还尝试了DNA疫苗的应用试验。用CSFV E2基因表达质粒pIRE2肌肉接种免疫小鼠，按常规方法通过融合、筛选、克隆。结果获得了2株分泌抗CSFV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(GE、GB)。兔体中和实验证明2株McAb均可中和猪瘟兔化弱毒(HCLV)的感染性，中和活性不低于1：200。2株McAb可与从全国不同地方收集的9个CSFV野毒株发生反应。GB与BVDV有交叉反应，说明它针对瘟病毒的共同抗原表位，GE与BVDV没有交叉反应，说明它为CSFV特异性McAb。为探讨提高DNA疫苗免疫应答水平的方法，本实验还进行了以下两个方面的工作：(1)．通过提取HCLV感染兔组织总RNA，然后用RT-PCR的方法，最少获得了HCLV基因组12.3kb中5′端9.5kb的序列，它包含了HCLV全部的结构蛋白编码区和大部分非结构蛋白编码区。这为构建CSFV多个抗原基因甚至全基因组的DNA疫苗打下基础(2)．本课题设计了—18氨基酸肽(ACDCRGDCFCGPKKKRKV，命名为RNLS)，该肽含有—RGD基序和来源于SV40大T-Ag的核内化信号序列(NLS)。RNLS与DNA形成的复合物转染细胞时，可借助于广泛存在于各种细胞膜的RGD受体将DNA导入细胞内，然后通过NLS的作用携带DNA穿过核孔进入到细胞核。仞步研究证实，RNLS有较好的转染效果，5：1—20：1比例的肽／DNA(1μg)复合物均可转染成功，与脂质体Lipofectin相比，转染率最高可达70％。
袁晋[2]2014年在《rAdV-SFV-E2免疫后不同时间攻毒及其与HP-PRRSV活疫苗同时免疫的保护效力评价》文中研究说明【目的】嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2是一种极具潜力的具有标记特性的新型猪瘟候选疫苗。本研究从该疫苗能够提供完全攻毒保护的最早时间以及其与HuN4-F112同时免疫时是否相互干扰这两个方面进行评估，为该疫苗能够早日进入临床应用提供科学依据。【方法】对上述两个方面的评估分别设计动物试验。动物试验一：选取5周龄CSFV抗原及抗体均为阴性的健康猪只，随机分成5组，每组5头，以107TCID50rAdV-SFV-E2于不同时间点肌肉注射免疫猪只，以CSFV石门株进行攻击，攻毒后检测猪只抗体应答、临床症状、病毒血症、剖检及组织学变化等；动物试验二：选取5周龄CSFV和PRRSV抗原及抗体均为阴性的健康猪只，随机分成4组，每组5头，分为单独免疫rAdV-SFV-E2组、单独免疫HuN4-F112组、两种疫苗同时免疫组和空白免疫阴性对照组，分别以CSFV或PRRSV进行攻击，攻毒后检测猪只抗体应答、临床症状、病毒血症、剖检及组织学变化。【结果】动物试验一：试验猪只免疫rAdV-SFV-E2后4w和3w攻毒，猪只体内抗CSFV特异性抗体全部转为阳性，无猪瘟典型临床症状出现、无病毒血症、无剖检及组织学变化、且全部存活，rAdV-SFV-E2提供了完全的攻毒保护；试验猪只免疫rAdV-SFV-E2后2w和1w攻毒，猪只体内抗CSFV特异性抗体部分转为阳性，rAdV-SFV-E2分别能够提供不完全保护（存活率为5/5，个别猪只出现短暂的发热及病毒血症，随后恢复）和部分保护（存活率为3/5，猪只全部出现发热及病毒血症，部分随后恢复正常，部分病情加重死亡）；阴性对照组猪只全部死亡。动物试验二：rAdV-SFV-E2和HuN4-F112同时免疫组猪只，针对CSFV或PRRSV的攻毒，抗CSFV特异性抗体及抗PRRSV特异性抗体均转为阳性，表现为无发热、无病毒血症、无剖检及组织学变化，能够得到与单独免疫rAdV-SFV-E2或HuN4-F112疫苗相同的保护效果。【结论】rAdV-SFV-E2最早能于免疫后3w提供完全的攻毒保护；该疫苗与PRRSVHuN4-F112同时使用不影响各自保护效力。进一步证明rAdV-SFV-E2能够成为一种用于临床应用的新型标记猪瘟疫苗。
万超[3]2009年在《抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究》文中进行了进一步梳理猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的、猪的一种高度致死性传染病,在世界许多国家和地区广泛流行,在国际兽医局制定的《国际动物卫生法典》中,猪瘟被列入A类16种法定传染病之一。我国也作为Ⅰ类动物疫病加以重点控制。自50年代以来,我国自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(“C”株)的广泛应用,在控制猪瘟的爆发流行中发挥了重要作用。然而,猪瘟兔化弱毒疫苗五十多年的长期使用,并未能有效控制猪瘟的发生和传播。近年来,我国猪瘟发生呈明显上升态势,并出现诸如散发流行、慢性猪瘟、持续感染和妊娠母猪带毒综合征等新特点。病毒逃避机体的免疫清除和在猪体内局部的持续存留；疫苗制品质量问题；运输和保存不当导致疫苗效力降低或失效；以及疫苗株毒力的回复突变等是其主要原因。因此,在欧美一些国家已明确禁止使用猪瘟弱毒活疫苗接种。我国是养猪大国,猪瘟的发生和流行,是制约农村养猪业发展的瓶颈。为满足对猪瘟预防、控制和最终根除的需要,研制新一代抗猪瘟疫苗制品以替代传统猪瘟兔化弱毒疫苗,势在必行。本研究在对猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns保护性抗原区域结构分析的基础上,利用RT-PCR技术,以猪瘟病毒石门(Shimen)株基因组RNA为模板,扩增E2和Erns抗原编码区序列,与组织纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽cDNA序列融合,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和ptPAs/△E2,以及使用E2信号肽构建pE2s/△E2/△Erns和pE2s/E2。转染PK15细胞,检测目的基因的表达。用所构建的重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周,设pcDNA3.1(+)及PBS阴性对照,第三次免疫2周后采血,分离血清。分别以原核表达并纯化的E2或Erns蛋白为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以纯化的E2或Erns蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-y分泌情况。结果表明,除pcDNA3.1(+)和PBS对照组外,各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与对照组相比差异显著(p<0.05)。融合tPA信号肽DNA疫苗免疫组的血清OD492nm值与E2信号肽DNA疫苗免疫组相比差异显著(P<0.05)。猪瘟病毒Shimen株或E2或Ems蛋白刺激后,嵌合E2和Erns基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y和T细胞增殖效果高于单价DNA疫苗组(p<0.05),含有tPA信号肽组高于E2自然信号肽组,融合E2和Erns的ptPAs/△E2/△Erns和pE2s/△E2/△Erns组要优于只含有E2的单基因组。以上结果表明,在诱导免疫应答方面嵌合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗,tPA信号肽组优于E2信号肽组。在小鼠实验的基础上,选取诱导免疫效果较好的ptPAs/△E2/△Erns免疫CSFV血清抗体阴性猪,pE2s/E2和pcDNA3.1(+)同时免疫作为对照,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFV Shimen强毒株经肌肉注射途径攻击。观察猪体临床症状,记录猪体体温。并分别在攻毒后第0、4、8、12天后采血分离血清,以及采集鼻拭子和频死猪组织样品。中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测猪瘟病毒在组织样品和血清样品中复制情况等。结果表明,嵌合DNA疫苗免疫后产生的血清中和抗体水平、白细胞数量明显高于非融合DNA疫苗,pcDNA3.1(+)对照组攻毒后实验猪全部死亡,pE2s/E2免疫组部分猪死亡,而ptPAs/△E2/△Erns免疫组全部猪存活,说明具有tPA信号肽的嵌合DNA疫苗ptPAs/△E2/△Erns具有针对猪瘟病毒完全的免疫保护效果,而E2信号肽单基因DNA疫苗pE2s/E2只具有针对猪瘟病毒部分的免疫保护。在此研究基础上,以p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)作为分子佐剂和重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2同时免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周。第三次免疫2周后采血分离血清,分别以原核表达E2或Erns为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-γ分泌情况。结果表明,重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2与TRIF同时免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,但与非佐剂组相比差异不显著(P>0.05)。猪瘟病毒Shimen株刺激后,TRIF和DNA疫苗共免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ数量明显高于非佐剂DNA疫苗组(p<0.05)。以上结果表明,TRIF共免疫可显著增强DNA疫苗诱导细胞免疫水平。以重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF免疫CSFV血清抗体阴性猪,免疫3次,每次间隔2周,第三次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFVShimen强毒株经肌肉注射途径攻击。分别于攻毒后第0、4、8、12天采血分离血清,中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测组织样品中CSFV分布、计算白细胞数量,观察猪体临床症状并记录猪体体温变化情况等。结果表明,ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF共免疫DNA疫苗猪强毒攻毒后,白细胞数量明显高于非佐剂DNA疫苗,血清中和抗体水平与非佐剂组无明显差异,但DNA疫苗共免疫TRIF佐剂组猪只全部存活,说明TRIF能提高DNA疫苗的免疫效果,并诱导具有针对CSFV强毒株攻击的完全免疫保护。综上所述,本文首次构建了由CSFV主要抗原E2和Erns编码基因融合组成的抗猪瘟嵌合DNA疫苗,并对其在机体内诱导免疫效力进行了研究。在此基础上,研究了细胞通路信号分子TRIF共免疫对DNA疫苗免疫保护效果的影响。初步证实了抗猪瘟嵌合DNA疫苗可以诱导猪体增强的抵抗CSFV强毒株致死攻击的免疫保护,TRIF可显著提高DNA疫苗的细胞免疫应答和抗病毒作用,这些工作为新型抗猪瘟DNA疫苗的研制奠定了坚实的基础。
白华[4]2007年在《猪瘟病毒囊膜蛋白基因重组质粒pcDNA4.0-E的构建及免疫学研究》文中认为猪瘟(classical swine fever, CSF)是一种严重威胁养猪业的疾病,目前,防治猪瘟最主要的方式为注射弱毒疫苗的免疫接种,但由于传统弱毒疫苗存在着许多不足,使得研制高效而更具特异性的新型猪瘟疫苗成为当务之急,而猪瘟病毒DNA疫苗无疑是可能的途径之一。猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)属于黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus),其病毒基因组RNA只有一个大的开放阅读框(ORF),编码11个结构蛋白和非结构蛋白,其中结构蛋白E0、E1、E2为病毒囊膜糖蛋白。E2可诱导中和抗体的产生,是猪瘟病毒主要抗原蛋白,E0也能诱导产生中和抗体,且其编码序列较E2保守,因此在猪瘟的防治和诊断方面也有巨大的应用潜力,E1虽然没有抗原性,但对E0和E2的加工成熟有重要作用。本研究以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR技术首次构建了包含猪瘟病毒全部囊膜蛋白(E0、E1、E2)基因序列的真核表达重组质粒pcDNA4.0-E,并作为疫苗免疫小鼠和仔猪,以检验所构建DNA疫苗的免疫保护作用。本研究由3部分构成:1.采用RT-PCR方法克隆得到猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E0-E1-E2的基因序列,并将其定向插入真核表达质粒pcDNA4.0多克隆位点,琼脂糖电泳和测序表明,成功地构建了包含猪瘟病毒全部囊膜蛋白基因序列的重组质粒pcDNA4.0-E,从而为动物免疫试验奠定了基础。2. pcDNA4.0-E重组质粒转化E.coli JM109后,经过提取和纯化,小鼠后肢胫前肌注射100μg/只(50μg/腿),共2次,间隔15 d。第2次免疫后第10 d、20 d、30 d分别采血并捕杀小鼠,间接ELISA法检测血清抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾脏和外周血中淋巴细胞转化增殖。结果显示,血清抗体水平从第2次免疫后的第10 d开始逐渐升高,且极显著高于空白对照组(p<0.01=;对淋巴细胞转化增殖试验的数据进行统计分析结果显示,与空白对照组相比,所得重组质粒也能够显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞增殖(p<0.05)。这些说明所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生特异性抗体和增强细胞免疫。3. pcDNA4.0-E重组质粒转化E.coli JM109后,经过提取和纯化,仔猪四肢肌肉注射,共注射2次,第1次免疫完成后第15 d进行第2次免疫,每猪每次注射4 mg(1 mg/腿)。1免后第0 d开始,每隔5 d以ELISA试剂盒检测抗体水平,结果表明1免后第20 d开始,pcDNA4.0-E免疫组抗体水平均显著高于空白对照组(p<0.05),说明pcDNA4.0-E可以诱导产生特异性抗体。1免后第40 d以猪瘟病毒石门株强毒进行攻毒试验,结果显示与空白对照组猪相比,免疫组猪体温升高时间普遍推迟,在临床症状和大体剖检变化方面也较轻微,病理组织学检查也显示免疫组试验猪组织病变程度较空白对照组猪轻微。空白对照组猪全部死亡而免疫组猪2头存活,这说明pcDNA4.0-E对试验猪具有一定的保护作用。如何提高重组质粒的保护效力尚需进一步研究。
郭抗抗[5]2010年在《猪瘟病毒的shRNA干扰、强弱毒鉴别及基因工程疫苗研究》文中研究说明猪瘟(Classical swine fever ,CSF)是严重危害养猪业的传染性疾病,病原为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)。CSFV为单股正链RNA病毒,研究发现其3′非翻译区(3′-non-translation region,3′-NTR)在病毒的复制中有重要作用,为了研究CSFV Shimen株3′-NTR的不同位点在病毒复制中的作用,筛选3个靶位点设计了短发夹RNA(shRNA),构建了针对shimen株CSFV 3′-NTR 3个靶位点的shRNA表达质粒;将重组质粒转染PK-15细胞,获得3株稳定靶向CSFV Shimen株3′-NTR 3个靶位点的干扰细胞株,接种CSFV后,检测干扰细胞株对病毒复制的影响。目前CSF防控上采取的是以疫苗免疫接种为主的策略,弱毒疫苗的大范围使用,使病毒变异、毒力返强的风险增高,当前临床上“非典型”CSF的大量出现,被怀疑与弱毒疫苗的大量使用有关,新型CSF疫苗的研制是防控CSF的需要;在分析国内外有关猪瘟基因工程疫苗研究进展的基础上,构建了表达CSFV Shimen株E2基因的“自杀性”DNA疫苗和同时表达CSFV Shimen株E0和E2基因的重组鸡痘病毒,对构建的疫苗进行了初步评价。CSF弱毒疫苗的大量使用,使在生产中难以有效地用血清学方法区分野毒感染猪和疫苗免疫猪,对生猪及其产品的贸易造成严重影响;针对这个问题,在借鉴已有研究的基础上,建立了区分CSFV强/弱毒株的RT-PCR方法,通过对临床病料的检测表明,该方法的特异性较强,可用于临床上对CSFV野毒感染和弱毒疫苗免疫猪的鉴别检测。本研究取得以下结果:1.通过对CSFV Shimen株3′-NTR核苷酸序列的分析,分别设计了靶向CSFV Shimen株3′-NTR 115～132位、137～154位和210～228位mRNA的短发夹RNA(shRNA)的单链核苷酸,经退火后形成双链shRNA,将其分别与siRNA表达质粒载体连接,构建了编码CSFV Shimen株3′-NTR 3个位点shRNA的表达质粒载体;转染细胞后筛选获得了稳定转录靶向CSFV Shimen株3′-NTR shRNA PK-15细胞株(P-1、P-2和P-3);接毒试验表明,细胞株P-1、P-2及P-3在转录水平和蛋白表达水平上均可干扰CSFV Shimen株在感染细胞中的增殖(P<0.05)。2.建立了可鉴别CSFV强毒和弱毒的RT-PCR方法。在CSFV强毒中可扩增得到187 bp的片段,弱毒可获得492 bp的片段;在对PCV2、TGEV、PRRSV等猪源病毒的检测,均未有PCR产物出现,说明方法的特异性较高。对临床疑是CSF病料的检测证明,建立的方法可有效地区分CSFV野毒感染猪和弱毒疫苗免疫猪,本方法可用于临床上对CSFV强弱毒的鉴别检测。3.构建了CSFV E2基因“自杀性”DNA疫苗表达质粒载体PSCA1-E2。在转染细胞中可检测到E2蛋白的表达;免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)在二免后10d与对照组差异显著(p<0.05),20d和30d差异极显著(p<0.01);试验猪二免后21d能检测到抗CSFV特异性血清抗体,说明构建的表达CSFV E2基因的“自杀性”DNA疫苗能诱导试验动物的免疫反应。4.将CSFV E0和E2基因及报告基因LacZ插入到鸡痘病毒FV282的复制非必需区,经同源重组构建了一株含CSFV E0和E2基因的重组鸡痘病毒(FV282-E0-E2)。用重组鸡痘病毒免疫接种试验小鼠和试验猪,检测发现,免疫动物均能产生特异性抗体,说明E0和E2基因在机体细胞内得以有效表达,并能激发机体产生免疫反应;对免疫猪的攻毒试验表明,重组鸡痘病毒免疫猪能获得部分的免疫保护,抵抗CSFV强毒的攻击,免疫保护率为75%(6/8)。
邹伟斌, 林梓栋, 齐冬梅[6]2018年在《猪瘟疫苗的研究进展》文中指出猪瘟(classical swine fever,CSF)是一种高度传染性猪病,对动物健康和养猪业的发展影响巨大,至今仍然是全球重要的猪病毒性疾病之一。目前,疫苗接种仍然是防控猪瘟的主要有效手段。随着分子生物学的发展,猪瘟疫苗的研究取得了显著进展。本文综述了猪瘟疫苗的最新研究进展,为猪瘟疫苗的设计研发和猪瘟的控制和根除提供参考。
乔红伟[7]2003年在《猪霍乱沙门菌疫苗株介导的猪瘟基因疫苗及实验免疫研究》文中提出以减毒胞内寄生菌作重组质粒的载体，已成为DNA疫苗的第三种免疫接种方式，为DNA疫苗的研制开辟了更新、更广阔的应用前景。猪霍乱沙门菌弱毒株是预防仔猪副伤寒的高效、安全的疫苗株。用其作载体，将含猪瘟病毒E2抗原蛋白基因的真核表达质粒携带到宿主体内并表达抗原蛋白，激活免疫系统，引起免疫反应。其独特的优点体现在既可作为针对猪霍乱沙门菌抗原的活疫苗，也可作为猪瘟病毒DNA疫苗的活载体，并以其菌体成份的佐剂属性，增强DNA疫苗的免疫应答反应。本实验利用重组PCR技术扩增猪瘟病毒主要保护性抗原基因E2，克隆到T-载体并测序，然后将该基因亚克隆到真核表达载体pVAX1上，构建得到CSFV E2基因的表达质粒pVAXE2。用pVAXE2转染BHK-21细胞并检测表达的抗原蛋白，直接ELISA结果表明pVAXE2能表达具有抗原活性的CSFV E2蛋白。利用重组转化技术将pVAXE2转化猪霍乱沙门菌，构建得到携带CSFV E2基因的重组菌。重组菌经口服和肌肉注射不同免疫途径免疫小鼠，同时用司本-甘油包裹的质粒pVAXE2和空载体pVAX1作对照。免疫3次，每次间隔2周。用间接ELISA检测4组（每组5只）免疫小鼠的血清抗体水平。检测结果表明重组菌免疫组小鼠的血清抗体水平最高（平均OD值在1左右），司苯甘油包裹质粒pVAXE2组小鼠的血清抗体水平较低（平均OD值在0.6左右）。用不同剂量（106、108、109CFU/只）的重组菌免疫小鼠检测重组菌的安全性，结果证明重组菌免疫小鼠的安全剂量在106～109CFU/只之间。在此基础上分别免疫4组家兔，每组4只，免疫三次，每次间隔两周，每次免疫前采血。间接ELISA检测免疫家兔特异性抗体水平，并在第3次免疫后2周用20ID50HCLV静脉注射进行攻毒，第3次免疫3周后用1×108CFU/只的猪霍乱沙门菌强毒株攻击。实验结果证明，用猪霍乱沙门菌弱毒株为载体的猪瘟DNA疫苗免疫动物，均可诱机体产生抗猪瘟E2和抗猪霍乱沙门菌的两种特异性抗体，且以重组菌免疫组抗体水平最高。这表明猪瘟E2 DNA疫苗可被猪霍乱沙门菌载体携带到动物细胞内，表达E2抗原并刺激机体的免疫系统，引起免疫应答，产生抗猪瘟E2和抗猪霍乱沙菌的两种特异性抗体。攻毒实验结果表明，pVAXE2重组沙门菌疫苗能部分保护家兔抵抗HCLV（40%）和猪霍乱沙门菌强毒株（80%）的攻击。在上述实验结果的基础上，以肌注途径免疫一月龄断奶仔猪，免疫三次，每次间隔两周。采血后检测血清抗体水平，并在第三次免疫后28天用猪瘟强毒株攻毒。抗体检测结果表明重组菌疫苗能有效的诱导猪产生抗CSFV E2的高水平特异性抗体，在对猪霍乱沙门菌弱毒CSFV DNA疫苗途径的比较时发现两种免疫途径均能诱发动物一定水平的特异性免疫应答，肌肉注射途径诱导的抗体水平稍高于口服途径。猪霍乱沙门菌弱毒CSFV DNA疫苗与对照组的司苯甘油包裹质粒pVAXE2比较，前者两种免疫途径产生的抗体水平均明显高于对照组。用CSFV强毒株攻毒后，对免疫接种的猪达到部分免疫保护，如何提高免疫保护有待于进一步研究。因此，猪霍乱沙门菌弱毒株是一个值得进一步探索的真核表达质粒的载体，为猪瘟病毒DNA活载体疫苗的候选菌株提供参考。
秦华洋[8]2014年在《腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2不同免疫途径的免疫效力比较》文中研究指明猪瘟是一种具有重要经济意义的猪传染病，对养猪业危害极大。安全、高效且具有标记特性的猪瘟疫苗及配套的鉴别诊断方法，将有助于猪瘟的防控乃至根除。我们业已证实，前期构建的表达猪瘟病毒E2基因的腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体病毒rAdV-SFV-E2在猪体上可诱导高水平的猪瘟特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，免疫攻毒保护效力与猪瘟兔化弱毒疫苗C株相当；系统评价显示，该疫苗初步具备了理想猪瘟疫苗的特征。除免疫剂量外，疫苗的免疫途径对免疫效果具有重要影响。本研究对rAdV-SFV-E2不同免疫途径（肌肉、皮下和滴鼻）在猪体上的免疫效果进行了比较。选取21头5周龄左右的健康仔猪（猪瘟抗体及抗原均为阴性），随机分成A、B、C、D四组，其中A、B、C三组（n=5头）分别经肌肉、皮下和滴鼻方式注射5106TCID50rAdV-SFV-E2，D组经上述三种途径（各2头）免疫5106TCID50rAdV-SFV-empty。免疫后3w，对所有猪以同种疫苗、同样途径和剂量进行加强免疫。加强免疫后4w，对所有猪用致死剂量的猪瘟病毒强毒石门株进行攻击。结果显示，皮下免疫组诱导的体液免疫水平高于其他途径免疫组，在攻毒前，A、B和C组免疫猪的平均抗体阻断率分别为46.28%、51.66%和31.94%，皮下免疫组与滴鼻免疫组在攻毒前的抗体水平比较上差异显著（p <0.05）；攻毒后3d，A、B和C组免疫猪的平均抗体阻断率分别为54.28%、62.39%和39.35%，皮下免疫组与肌肉免疫组、滴鼻免疫组间存在显著差异（p <0.05）。在细胞免疫方面，皮下免疫组诱导了高水平的特异性淋巴细胞增殖和IFN-γ的分泌，与rAdV-SFV-empty免疫组及肌肉和滴鼻免疫组之间差异显著（p <0.05）。本研究证实，皮下免疫途径对于腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗更为有效，并进一步表明了该疫苗作为一种理想猪瘟标记疫苗的潜力。
周斌[9]2010年在《假型猪瘟病毒体系构建及衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究》文中研究表明猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是一种由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus, CSFV)引起的急性、热性和高度接触性的传染病,流行广泛,发病率高、死亡率高,危害极大,给世界和我国的养猪业造成严重经济损失。其特征为发病急,高热稽留和微血管壁变性、引起全身泛发性小点出血、脾梗死等。世界动物卫生组织(OIE)将本病列入A类法定的传染病,并规定为国际重点检疫对象。在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中也被列为一类传染病。在进行对于猪瘟等致病性和传染性很强的病毒,操作活毒都会面临着高风险,假病毒技术是一种非常有效的研究手段。假病毒是指一种反转录病毒的囊膜糖蛋白被另外一种病毒的囊膜蛋白所置换,而基因组仍保持反转录病毒本身的特性。因为其仅能引起单循环感染(复制缺陷型),作为研究病毒的侵入模型是非常安全的,便于研究病毒的侵入机制、组织嗜性、中和抗体分析以及受体的鉴定等。另外,虽然世界上多采用疫苗免疫来控制猪瘟的流行,但是免疫失败或免疫无效现象常有发生,因此探索新的行之有效的抗病毒策略已经成为当务之急。衣壳蛋白靶向性抗病毒灭活(capsid-targeted antiviral inactivation; CTVI)是近年来兴起的基于胞内免疫的抗病毒策略,其基本原理是在病毒的组装过程中将特定的核酸酶引入到病毒颗粒内部,破坏病毒基因组,从而达到灭活子代病毒的目的。因此本研究构建了猪瘟病毒囊膜糖蛋白的假病毒体系,应用该体系研究了囊膜蛋白对猪瘟病毒侵入细胞的重要性,鉴定了病毒感染的宿主细胞谱；并建立了可替代活病毒在操作上更安全的猪瘟病毒中和试验技术平台,利用该技术平台对临床免疫囊膜糖蛋白E2的B细胞表位亚单位疫苗免疫猪群进行了中和抗体检测。同时,利用CTVI原理,构建了猪瘟病毒衣壳蛋白(Cap)与葡萄球菌核酸酶(SNase)的融合蛋白的PK-15细胞系,通过IFA、Q-PCR和ELISA证明稳定表达融合蛋白的细胞系可以抑制猪瘟病毒的增殖。论文的主要研究内容如下：1.猪瘟病毒囊膜糖蛋白的克隆及其在293T中的表达通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV) Shimen株囊膜糖蛋白E0、E2和E012三个完整的阅读框基因并进行了克隆与序列鉴定,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.0,构建了重组真核表达质粒pcDNA-E0, pcDNA-E2和pcDNA-E012。将此3个质粒经大量提取并纯化后,经磷酸钙转染人胚肾细胞(293T)。采用兔抗猪瘟高免血清为一抗,FITC-SPA为二抗,分别应用流式细胞术(FACS)和免疫转印(Western blot)鉴定真核质粒在293T细胞中的表达。结果表明3个质粒均可在293T细胞中表达,Western blot检测分析到了25.7、41.5和90kDa的3个条带,FACS检测到荧光细胞比例分别为60.2%、55.2%和56.5%。说明囊膜糖蛋白E0、E2和E012均能表达在细胞膜上,为后续假病毒颗粒的形成奠定了基础。2.构建整合囊膜糖蛋白的假型猪瘟病毒体系及其鉴定将上述已经鉴定的重组真核表达质粒pcDNA-E0, pcDNA-E2和pcDNA-E012分别与MuLv假型病毒构建体系的两种骨架载体pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)经磷酸钙瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后纯化假病毒颗粒。用抗CSFV的多抗为一抗,通过Western blot证明了整个囊膜糖蛋白E012能够在假病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到MuLv病毒粒子表面,该假型猪瘟病毒感染SK6、PK-15、ST、BHK21、Vero、COS7、293T和CEF等8种细胞,48h后检测发现只有在猪源细胞SK6、PK-15和ST中标记基因Lac Z能有效表达,表明所构建的假病毒具有感染性,但只能够感染猪源细胞。因此通过该假型猪瘟病毒进一步证实了猪瘟病毒对猪的单一嗜性。另外,纯化后的病毒经Reed-Muench计算其TCID50为104.58。加入各种浓度的NH4Cl(0～30 mmol/L)预先处理PK-15细胞,37℃温育1h,而后加入MuLV-E012作用,48h后,检测Lac Z.表达量；同时设pH依赖性的MuLV-VSV-G为阳性对照。实验结果表明MuLV-E012感染性与NH4Cl浓度存在极显著的线性负相关性,即随着pH值的升高,假型病毒MuLV-E012对PK-15细胞感染能力逐渐降低,而当NH4Cl浓度达到30 mmol/L时MuLV-E012进入宿主细胞几乎被完全抑制。因此通过假型猪瘟病毒证实了猪瘟病毒侵入细胞是受到pH影响的,即是pH值依赖型囊膜病毒。为避免操作活的病毒带来的搞危险性,本研究利用假型猪瘟病毒建立了微量中和试验。标准阴阳性血清和倍比稀释的待检血清56℃灭活30min后,对每份血清进行2倍梯度稀释,分别与假病毒MuLV-E012按1：1混合,4℃过夜。分别取100-tL上述病毒血清混合物一式3份加到96孔板PK15细胞中,建立了微量中和试验,与全病毒微量中和试验进行了比较,实验结果表明所建立的方法能够代替全病毒进行血清中和抗体滴度的测定,能够检测临床血清的猪瘟抗体中和效价。3.假病毒微量中和试验评价CSFV E2 B细胞表位亚单位疫苗免疫效果本研究目的是将E2的B细胞表位a(aa844-865)和b(aa693-716)串联和单独原核表达后研制亚单位疫苗,通过上述建立的假病毒微量中和试验评价亚单位疫苗的免疫效果,鉴定联合表位的优越性。实验优化了含有重组质粒(pET-rE2-a、pET-rE2-b和pET-rE2-ba)的BL21 (DE3)大肠杆菌的表达条件,将重组工程菌(BL21-rE2-a、BL21-rE2-b和BL21-rE2-ba)大量诱导表达,通过His-Bind螯合层析柱纯化融合蛋白,经SDS-PAGE和薄层扫描分析,结果表明：融合蛋白rE2-a, rE2-b和rE2-ba获得了较好的纯化。用猪抗CSFV阳性血清为一抗,HRP-SPA为二抗,DAB显色表明分别在22、22和25 kDa处出现明显条带,与预期大小相符,证实表达纯化的蛋白rE2-a、rE2-b和rE2-ba有良好的抗原性。将此3个重组蛋白分别与SEPPIC 206 VG白油佐剂进行乳化后免疫6周龄猪瘟抗体阴性的三元商品仔猪,间隔2周再疫1次。2免后3周所有实验组用200TCID50的猪瘟石门株进行动物攻毒实验。各组仔猪在初免后间隔7d采血,应用假病毒微量中和试验检测血清中和抗体水平。实验期间,观察攻毒后各组临床症状、发病率、死淘率和保护率,每天测量实验猪的肛温。动物实验结果表明：3个重组蛋白rE2-a (A组)、rE2-b (B组)和rE2-ba (C组)均能诱导仔猪产生中和抗体水平,在攻毒后4周,中和抗体分别达到64、128和256；而疫苗组(D组)为128。重组蛋白组的保护率分别达到80%、100%和100%,D组也达到100%,因此说明B或C组产生的中和抗体达到或超过D组,免疫保护率可以与D组相当。攻毒后,A-C组的仔猪仅出现轻微的发热,但是持续时间不长,几乎全部健活；仅A组1头仔猪在发热过程中因为受到细菌继发感染,其死亡剖检发现有轻微的猪瘟病变,说明A组保护率欠缺。空白对照组(E组)的仔猪没有中和抗体产生,出现明显的猪瘟临床症状,攻毒后3周全部死亡。该结果为猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2 B细胞表位亚单位疫苗的临床应用奠定了基础。4.构建稳定表达CSFV Cap蛋白和SNase融合蛋白的细胞系猪瘟病毒为有包膜的RNA病毒,位于病毒颗粒内部的衣壳蛋白与病毒的RNA结合构成病毒的核衣壳,因此我们可以考虑利用CTVI的原理,构建猪瘟病毒衣壳蛋白(cap)与葡萄球菌核酸酶(SNase)的融合蛋白,用于抗猪瘟病毒感染的研究。根据猪瘟病毒核衣壳蛋白(cap)基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增获得编码Cap基因的完整阅读框,将其插入到含有金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因的真核表达载体pcDNA-SNase中,筛选获得重组质粒pcDNA-Cap-SNase.测序鉴定后,脂质体转染猪肾细胞(PK-15),经终浓度1000μg/mL的G418稳定筛选,建立稳定表达Cap-SNase融合蛋白的细胞系(PK-15/Cap-SNase)。通过RT-PCR、蛋白免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(IFA)鉴定Cap-SNase融合蛋白的表达,通过体外消化线性阳性质粒DNA对核酸酶活性进行检测。实验结果表明：建立的PK-15/Cap-SNase细胞系可以稳定表达融合蛋白Cap-SNase,该融合蛋白能够被兔抗核衣壳蛋白抗体所识别,并且具有良好的核酸酶活性,能够对线性阳性质粒DNA进行切割。因此,该细胞系的建立为CTVI策略抑制猪瘟病毒的增殖和感染奠定了基础。5.应用衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究将猪瘟病毒Shimen株感染PK-15/Cap-SNase细胞系后,应用间接免疫荧光(IFA)、荧光定量PCR和ELISA方法鉴定CTVI系统抑制猪瘟强毒的增殖效果。实验结果表明,CTVI能有效抑制病毒的繁殖。IFA鉴定病毒感染5d后PK-15/Cap-SNase细胞中产生的子代病毒滴度与正常PK-15细胞相比较下降了102倍,6d后产生的子代病毒滴度与正常PK-15细胞相比较下降了103倍；real-time PCR分析表明,阴性对照正常PK-15细胞无明显的抑制作用,与而稳定表达融合蛋白Cap-SNase的细胞株在病毒进入的3天出现明显的抑制,接种后6天抑制趋向平稳,在第8天抑制率达到78%,差异显著。应用美国IDEXX CSFV Ag ELISA Kit的检测结果：PK-15对照细胞呈现强阳性,而PK-15/Cap-SNase细胞系的ELISA光吸收度数值明显低,呈现弱阳性。因此本研究表明PK-15/Cap-SNase细胞在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于抵抗猪瘟病毒感染奠定了基础。
张玲楷[10]2017年在《表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建和鉴定》文中认为猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度传染性、致死性疾病,具有较高的发病率和致死率。猪瘟在我国呈散发或地方性流行,严重危害我国养猪业。目前疫苗接种仍是防控猪瘟的主要方式。20世纪50年代,我国研制出的猪瘟兔化弱毒株(C株或HCLV株)是一株非常安全、有效的减毒活疫苗,该疫苗接种猪体后可以抵抗不同基因型CSFV的感染。猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)引起的多种病症的总称。该病遍及全世界,给各个国家的养猪业造成极大的经济损失。该病导致感染猪产生严重的免疫抑制,降低猪体的抵抗力,常与CSF等其它疾病混合感染,加重对养猪业的危害。PCV2是引起PCVAD的病原体,其可感染各种年龄的猪,尤其严重危害仔猪的生长。其编码多个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF1和ORF2为两个较大的开放性阅读框,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白是PCV2的唯一结构蛋白,并且是主要的免疫原性蛋白。本研究旨在以C株为载体,采用多种策略表达PCV2 Cap蛋白,并且评价重组病毒的生物学特性和免疫原性,为研制同时抵抗CSFV和PCV2感染的二价疫苗奠定基础。本研究利用CSFV反向遗传学,采用不同策略拯救了以C株为骨架、包含PCV2 Cap基因的4株重组病毒。首先,以融合或单独表达形式表达Cap基因,分别成功获得重组病毒为rHCLV-Cap和rHCLV-2ACap。其次,我们又构建了单独表达去除核定位信号,并在氨基端引入不同分泌信号肽Cap基因的重组病毒rHCLV-usp Cap(带有泛素特异性肽酶基因的信号肽)和rHCLV-pspCap(带有催乳素基因的信号肽)。然后,用免疫荧光试验检测重组病毒Cap蛋白的表达;将拯救的重组病毒连续传代至第20代,用RT-PCR扩增插入的外源Cap基因,分析重组病毒的遗传稳定性;通过绘制生长曲线分析重组病毒在SK6细胞上的生长能力。最后,将4株重组病毒分别以耳缘静脉途径接种家兔后,评价重组病毒的生物学特性。结果表明,rHCLV-Cap和rHCLV-2ACap在细胞核中表达外源Cap蛋白,而rHCLV-uspCap和rHCLV-pspCap在细胞质中表达Cap蛋白;重组病毒连续传代20次后,插入的基因在其基因组中稳定存在并且不存在任何突变;重组病毒在SK6细胞上的生长能力与亲本病毒没有显著的差异;在接种后36 h,重组病毒引起家兔的体温升高至40.8℃并维持18 h;在接种后3 d,能够在接种重组病毒的所有家兔脾脏中检测到病毒基因组,并且可以从家兔脾脏中分离到接种的重组病毒,在分离的重组病毒基因组中可以扩增到插入的外源Cap基因,并且未发生任何突变;在接种后第10 d,接种重组病毒的所有家兔都可以产生抗CSFV中和抗体,然而只有r HCLV-uspCap和rHCLV-pspCap在加强免疫后3 w可以诱导家兔产生针对抗PCV2 Cap的特异性抗体。总之,我们采用多种策略成功构建了表达Cap基因的重组C株,进一步的研究证实,Cap基因在重组病毒基因组中具有遗传稳定性,4株重组病毒均可引起家兔产生定型热反应并在家兔脾脏中复制,并保持了C株在家兔体内的免疫原性,值得注意的是,2株表达不带核定位信号的Cap蛋白的重组病毒可以诱导抗Cap特异性抗体的产生。本研究创建了C株作为载体表达外源基因的平台,为研制能够同时预防猪瘟和猪圆环病毒病的二价疫苗奠定了基础。
参考文献：
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[4]. 猪瘟病毒囊膜蛋白基因重组质粒pcDNA4.0-E的构建及免疫学研究[D]. 白华. 西北农林科技大学. 2007
[5]. 猪瘟病毒的shRNA干扰、强弱毒鉴别及基因工程疫苗研究[D]. 郭抗抗. 西北农林科技大学. 2010
[6]. 猪瘟疫苗的研究进展[J]. 邹伟斌, 林梓栋, 齐冬梅. 广东畜牧兽医科技. 2018
[7]. 猪霍乱沙门菌疫苗株介导的猪瘟基因疫苗及实验免疫研究[D]. 乔红伟. 新疆农业大学. 2003
[8]. 腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2不同免疫途径的免疫效力比较[D]. 秦华洋. 山东农业大学. 2014
[9]. 假型猪瘟病毒体系构建及衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究[D]. 周斌. 南京农业大学. 2010
[10]. 表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建和鉴定[D]. 张玲楷. 中国农业科学院. 2017
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