赵大鹏[1]2007年在《人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）中试工艺的研究》文中研究表明本研究用改进的RT-PCR法合成人肝脏cDNA,构建出cDNA文库,并从中分离出人胰岛素样生长因子1(human insulin like growth factor 1,hIGF-1)基因。将hIGF-1基因酶切后插入到pGEX-1λT载体中,连接转化大肠杆菌NM522,筛选克隆,酶切鉴定后测序,并进行了表达。将IPTG诱导表达的菌体离心收集,取少量菌体进行SDS-PAGE分析,在分子量34KD处可见明显高表达带(对照菌没有表达),Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。在完成以上研究的基础上,鉴于原核分泌型表达技术的优势,我们根据原核细胞分泌表达机制及需要,重新设计引物,利用PCR法分别分离出碱磷酸酶启动子(phoA),STII信号肽及hIGF-1编码基因,将它们连接到pUC载体,测序后,通过点突变技术对全基因序列进行了校正。分别构建出两套分泌型表达载体,并将其命名为pCSA和pCST,随后将上述基因装入到pCSA和pCST中,转化大肠杆菌W3110,得到工程菌pCSA/IGF-1/W3110,pCST/IGF-1/W3110,并进行了表达。经SDS-PAGE检测,在分子量7.6KD处有明显高表达带,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1的抗原性。根据中国生物制品检定规程的有关要求,我们进行了基因工程大肠杆菌工程菌的筛选和鉴定,得到工程菌株pCSA/IGF-1/W3110 ,pCST/IGF-1/W3110,经传代培养,提质粒酶切鉴定及蛋白表达测定表明,经100次传代后质粒不丢失,酶切鉴定表明为阳性克隆,蛋白表达稳定。根据中试工艺的要求,我们初步建立了分泌型hIGF-1的生产工艺,即为;种子液制备→发酵培养→离心收集菌体深度冷冻→rhIGF-1低渗震荡溶出→层析前处理→疏水层析→分子筛→离子交换→半成品。参照有关文献,以NIH3T3作为靶细胞,用XTT掺入法,初步建立了hIGF-1生物活性检定方法。
吴岚晓[2]2000年在《人胰岛素样生长因子1基因的克隆、表达及产物纯化与检定》文中进行了进一步梳理胰岛素样生长因子1（IGF-1）是一种多功能细胞调控因子，大量实验表明，IGF-1生物学作用广泛，对多种组织器官有生物学作用。目前，人IGF-1（hIGF-1）制剂在临床上已用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合症、侏儒症及神经系统疾病等多种顽疾，取得较好的临床效果，显示出良好的应用前景。 为获得大量纯度高的、具有生物学活性的hIGF-1以满足基础研究与临床应用的需要，本文应用基因工程方法，将hIGF-1基因与原核表达载体pRSET B进行重组，在大肠杆菌中进行了表达，并对其分离纯化及性质检定方法进行了探讨。 首先，根据已知天然hIGF-1编码基因序列，在不改变氨基酸序列的条件下，人工设计合成了适合于在大肠杆菌中表达的hIGF-1基因并克隆于pUC19中，构建了pUCIGF克隆载体。设计引物，导入合适的酶切位点，以pUCIGF为模板，PCR扩增目的基因，经适当酶切后，克隆于原核表达载体pRSET B中，构建了pRSET-IGF表达重组质粒，经PCR筛选、酶切鉴定和核苷酸序列测定，确定重组质粒pRSET-IGF构建完全正确。将重组质粒pRSET-IGF转化宿主菌BL21，工程菌发酵经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳分析表明，可表达分子量约为7.8kDa的重组蛋白，表达量约占菌体蛋白总量的10-20％。 发酵后，菌体采用超声破菌，目的蛋白以可溶性形式存在于裂解液上清中，上清经阴离子交换，疏水层析及分子筛纯化后，经SDS-PAGE电泳检测，纯度达98％以上，HPLC分子筛测定纯度为91.4％。蛋白印迹分析显示，此纯化蛋白能与抗hIGF-1抗体发生特异性反应，表明此表达产物具有hIGF-1抗原活性，重组蛋白良好的促NIH3T_3细胞增殖效应，显示重组hIGFI（rhIGFI）具有一定的生物学活性。 上述结果表明，人工合成hIGF－l基因能在大肠杆菌中以可溶性形式获得高效表达，经纯化后获得有生物学活性的rhIGF纯品，为获得大量基因工程产品以满足进一步研究与临床应用奠定了基础。
李洪霞[3]2011年在《基因工程重组家蚕素Ⅱ的表达及其胰岛素样作用的研究》文中研究表明糖尿病是严重威胁人类健康的主要疾病之一,寻找高效抗糖尿病药已成为近年生物医学领域关注的热点问题之一。家蚕素(bombyxin,Bbx)是无脊椎动物中首个被鉴定的昆虫胰岛素,分子量约5KD,家蚕素Ⅱ的A链与B链与人类胰岛素具有高度同源性。在昆虫体内,家蚕素具有调节变态发育、参与糖代谢调控,促进造血器官细胞增殖以及卵巢发育等生理功能,但家蚕素对哺乳动物细胞糖代谢的作用未见报道。我们课题组的前期工作已经证实：从蚕蛾头部提取的胰岛素样生物活性物质ILAS在动物实验显示具有明显的降低糖尿病小鼠血糖的效果,但具体何种物质起降糖作用并不清楚,我们推测蚕蛾ILAS发挥抗糖尿病作用的核心成分很可能是家蚕素。因此本研究在前期实验基础上,应用基因工程重组技术进行家蚕素Ⅱ基因的表达,并体外观察表达的家蚕素Ⅱ蛋白对人肝癌细胞株HepG2细胞葡萄糖摄取和糖原合成作用的影响,从而确认家蚕素Ⅱ的胰岛素样作用。本研究分三部分：(1)家蚕素Ⅱ基因真核表达载体的构建和鉴定。应用基因合成方法先后合成野生型家蚕素Ⅱ基因(BbxⅡ)和突变型家蚕素Ⅱ基因(MBbxⅡ)的cDNA序列,其中在MBbx II序列中插入了Furin酶的识别位点,从而使其在非内分泌细胞中表达有生物学活性的成熟家蚕素；同时在两个基因片段的末端加入了表达六个组氨酸的基因序列,从而有利于表达蛋白的纯化与检测；在基因的前端为信号肽序列,有利于家蚕素在哺乳细胞内的分泌；以真核表达载体pcDNA3.1(+)为骨架,该质粒载体具有SV40病毒复制起点。应用基因工程重组技术分别将BbxⅡ基因与MBbx II基因克隆入pcDNA3.1(+)载体中；应用限制性内切酶与基因测序方法进行载体克隆正确性鉴定。(2)家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞中的表达。应用脂质体介导的基因转移技术分别将BbxⅡ基因与MBbx II基因导入293FT细胞,收集细胞与上清,应用RT-PCR与荧光定量PCR检测BbxⅡ和MBbx II在mRNA水平的表达；针对6个组氨酸标签,对转染后的293FT细胞进行免疫细胞化学检测,对转染后的293FT细胞和上清进行western blot检测,从而间接检测BbxⅡ和MBbxⅡ在蛋白水平的表达。(3)家蚕素Ⅱ胰岛素样作用的确认。以肝癌细胞株HepG2细胞为体外胰岛素样作用研究的靶细胞,将BbxⅡ、MBbxⅡ基因转染上清与人胰岛素分别作用于HepG2细胞,应用GOD-POD法检测葡萄糖消耗情况,应用PAS法检测糖原合成情况,观察家蚕素Ⅱ蛋白对HepG2细胞糖原合成作用的影响；将MBbxⅡ基因转染上清与不同浓度的PI3K特异性抑制剂wortmannin S1952共同作用于HepG2细胞,观察成熟家蚕素Ⅱ蛋白对HepG2细胞糖原合成作用的影响。本研究得出实验结果如下：1.成功构建野生型家蚕素Ⅱ和突变型家蚕素Ⅱ基因真核表达载体。经酶切及DNA测序鉴定,野生型家蚕素Ⅱ基因(BbxⅡ)与突变型家蚕素Ⅱ基因(MBbxⅡ)的cDNA已重组到pcDNA3.1(+)真核表达质粒载体中,且方向、序列完全正确,构建的载体分别简化命名为ZDL-B和ZDL-MB。本研究根据人类胰岛素基因在非内分泌细胞表达成熟胰岛素的原理,首次成功改造了突变型家蚕素Ⅱ基因,使其可以表达成熟的家蚕素Ⅱ蛋白,为后续研究家蚕素Ⅱ对哺乳动物细胞的胰岛素样作用奠定了实验基础。2.成功实现了重组家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞内的表达。BbxⅡ基因和MBbxⅡ基因转染293FT细胞后,RT-PCR与荧光定量PCR检测结果均显示有明显的家蚕素Ⅱ基因mRNA的表达；免疫细胞化学检测结果显示在293FT细胞胞浆内可见染成棕黄色的阳性细胞；Western blot结果显示在293FT的上清和细胞内,均可以见到明显的蛋白条带,大小分别是10KD和5KD左右。上述结果表明BbxⅡ基因和MBbxⅡ基因转染后,在mRNA水平和蛋白水平均可在293FT细胞内获得表达。3.首次证实了突变型家蚕素Ⅱ对哺乳动物细胞具有胰岛素样作用。对家蚕素Ⅱ胰岛素样作用的研究结果表明：MBbxⅡ基因转染非内分泌细胞293FT细胞后,表达了成熟的家蚕素Ⅱ蛋白,该成熟蛋白促进了肝癌细胞株HepG2细胞的葡萄糖摄取与糖原合成作用。本研究中成熟家蚕素Ⅱ蛋白对HepG2细胞的葡萄糖摄取能力与10nM的人胰岛素能力相当。由于多年来一直未能证实家蚕素对哺乳动物细胞是否具有胰岛素样作用,因此本研究中成熟家蚕素Ⅱ蛋白对哺乳动物细胞糖代谢作用的影响,展示了开发抗糖尿病新药的前景。4.突变型家蚕素Ⅱ基因转染上清与PI3K特异性抑制剂wortmannin S1952共同作用于HepG2细胞后,HepG2细胞糖原合成减少,表明HepG2细胞糖原合成受到抑制,且随着I3K抑制剂浓度的增加,HepG2细胞糖原染色阳性细胞数减少,染色强度降低,这与人胰岛素对HepG2细胞合成糖原的影响一致。上述结果表明突变型家蚕素Ⅱ是通过PI3K信号传导途径发挥促进HepG2细胞糖原合成作用的,从而初步判断成熟家蚕素Ⅱ蛋白可能通过胰岛素受体发挥其胰岛素样作用,需要进一步实验证明。总之,通过上述研究结果阐明：通过基因重组技术将突变型家蚕素Ⅱ基因导入非内分泌细胞293FT细胞,表达的成熟家蚕素Ⅱ蛋白具有胰岛素样作用,促进了肝癌细胞株HepG2细胞葡萄糖摄取能力,与人胰岛素(10nM)对HepG2细胞葡萄糖摄取能力相当；促进了HepG2细胞糖原合成能力,初步判断其对糖原合成作用的影响是通过PI3K信号传导途径发挥作用的。本实验研究结果为深入探讨家蚕素Ⅱ对哺乳细胞的糖代谢调节作用,从而为开发新型的抗糖尿病药物奠定实验与理论基础。
段宇, 汪承亚, 赵红, 陈家伟, 张志芳[4]2001年在《利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-1的研究》文中指出目的利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子 1(rhIGF 1)。方法将 15kD人IGF 1(hIGF 1)前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)转移载体pBak PAK8中 ,经与野生型病毒DNA共转染家蚕细胞后 ,通过体内同源重组的方式获得重组病毒BmNPV/IGF 1。以Bm NPV/IGF 1感染 5龄家蚕幼虫 ,分别在感染后 2 4、48、72、96、10 8、12 0h提取家蚕血淋巴液 ,以ELISA法测定不同时象家蚕血中IGF 1浓度 ,采用Western blot分析鉴定IGF 1免疫学活性 ,MTT法观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。结果ELISA测定显示 ,BmNPV/IGF 1感染家蚕幼虫后 ,72h起蚕血中IGF 1浓度随感染时间延长而逐渐增高 (19.0 9～ 2 3.36 μg/ml) ,12 0hIGF 1含量达到最高值 (2 3 .36 μg/ml) ,Western blot分析发现表达产物在蚕体内被加工成 7.5kD成熟hIGF 1,并对NIH3T3细胞具有良好促增殖效应 ,其促细胞增殖能力明显优于来源于E .coli的IGF 1标准品。结论具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF 1能够在家蚕幼虫虫体中获得高效表达
参考文献：
[1]. 人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）中试工艺的研究[D]. 赵大鹏. 吉林大学. 2007
[2]. 人胰岛素样生长因子1基因的克隆、表达及产物纯化与检定[D]. 吴岚晓. 第一军医大学. 2000
[3]. 基因工程重组家蚕素Ⅱ的表达及其胰岛素样作用的研究[D]. 李洪霞. 吉林大学. 2011
[4]. 利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-1的研究[J]. 段宇, 汪承亚, 赵红, 陈家伟, 张志芳. 中国生化药物杂志. 2001
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