湖南中医药大学附属第二医院 湖南长沙 410000
【摘 要】目的 应用分子生物学等最前沿的生物技术研究芍药中的芍药苷成分的检测方法，探究芍药苷批量检测的可行性方案。方法 通过制备芍药苷的单克隆抗体建立完善的酶联免疫测定系统，对芍药中的小分子量活性成分芍药苷进行定量分析。结果 高碘酸钠法可以成功合成人工抗原，聚乙二醇法的细胞融合率较高，通过体外无血清培养以及腹水诱生两种方案获得的MAbs均可用于PF检测与筛选，ELISAF分析法比HPLC分析法的灵敏度以及精确度更高。结论 基于ELISAF分析法的有效成分批量检测符合实际生产要求，ELISAF分析法可以定量测定芍药中的芍药苷成分。
【关键词】芍药苷；单克隆抗体；制备；免疫测定
芍药（Paeoniae Radix）是一种比较常用的中药材，中药学中的芍药并不是植物学中芍药，实质上属于毛莫科植物芍药的干燥根。[1]按中医学理论的界定，芍药属于中品药材，具备滋补虚弱的功效，被广泛应用于治疗阴虚发热、胸肋疼痛等妇科疾病，芍药作为药材的历史较长，已经实现了规模化栽培。改革开发以来，随着西方医学理论的引入，我国的中医学理论获得了新的发展机遇，西方系统的医药研究体系已经广泛地应用于中药研究中，目前，研究检测出的芍药化学成分包括山奈素、山奈酚、芍药苷等，现代医学研究方法在芍药苷成分方面的研究已经发挥了重要作用，色谱学、单细胞检测、微透析等现代医学技术极大地促进了芍药苷的研究，芍药苷的质量控制一直是制约着其批量生产的原因，本文采用芍药苷的单克隆抗体（MAbs）制备与ELISA技术研究芍药苷的标准化检测流程，为我国的芍药苷生产提供参考。
1 一般材料
1.1主要仪器
本次研究涉及的仪器较多，包括各种类型的离心机、倒置显微镜、生物安全柜、可调式恒温检测仪、紫外线可见光分度仪、核酸蛋白检测仪、超声波清洗机、电泳仪、自动多功能酶标仪、净水处理系统、高温烤箱、超低温冰箱、磁力搅拌器、植物粉碎机、高效液相色谱仪、圆周式震荡仪等。
1.2实验试剂与样本
本次实验的主要对象是SFP级实验小鼠，实验的样本包括赤芍、芍药内脂甘、樟脑等，其他试剂包括人体血清蛋白、鸡卵血清蛋白、芥子酸、三氟乙酸、乙睛、显色液、胎牛血清培养基、低分子蛋白等，除上述试剂外，还需要配置其他辅助试剂，包括缓冲液配置、SDS-PAGE蛋白电泳试剂、ELISA适用剂、单克隆抗体筛选培养基溶液等。[2]
1.3实验方法
本次实验主要有以下五个部分，包括人工抗原的合成与鉴定、人工抗原PF-HSA的动物免疫、抗PF单克隆抗体的生产、抗PF单克隆抗体的特征检测以及ELISA/HPLC法检测赤芍的PF含量。人工抗原的合成与鉴定按以下流程进行：高碘酸钠法合成PF-HSA与PF-OVA偶联物 → 紫外光谱鉴定与偶联比测定 → MALDI-TOF MS检测；人工抗原PF-HSA的动物免疫流程：准备免疫原 → 小鼠免疫实验 → 免疫效果检测；抗PF单克隆抗体的生产流程：准备小鼠骨髓瘤细胞 → 免疫脾细胞的制备 → 细胞融合 → 产特异抗体培养孔筛选 → 杂交瘤细胞的克隆 → 单克隆抗体批量制备 → 杂交瘤细胞培养 → 单克隆抗体纯化；抗PF单克隆抗体的特征检测的流程：MAbs的lg类型判断 → 单克隆抗体的质量评定 → 敏感度检测 → MAbs特异性的检测 → MAbs亲和常熟的检测 → 稳定性检测；ELISA/HPLC法检测赤芍的PF含量的流程：赤芍中芍药苷的提取 → ELISA法检测PF含量 → HPLC检测赤芍提取物中的PF含量。
2 结果
2.1PF载体蛋白偶联效果评测，PF载体蛋白偶联效果评测包含了PF-HSA与PF-OVA半抗原检测、PF-HSA偶联物紫外吸收光检测以及PF-HSA人工抗原的合成率检测，详细数据如表1、2所示，由以上数据可以计算出PF-HSA人工抗原的合成率为68.75%。
3 讨论
现代化的医学研究手段已经给中药材研究带来了新的发展机遇，中药的研究必须遵循标准化的流程，通过多种方法分析中药成分的制备与生产方案，分子生物学的技术加快了我国中药研究的发展。本文通过制备芍药苷的单克隆抗体建立完善的酶联免疫测定系统，对芍药中的小分子量活性成分芍药苷进行定量分析。具体的方法包括人工抗原的合成与检测、小白鼠的免疫实验、MAbs性质检测以及芍药苷单克隆抗体制成方法。[3]采用高碘酸钠法将PF与动物血清进行融合，通过紫外线光谱测定偶联物的成分，利用聚乙二醇法将免疫白鼠与敏感小鼠的细胞融合成杂交瘤细胞，对培养筛选的杂交瘤细胞获得可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，之后通过体外无血清培养以及腹水诱生两种方式生产单克隆抗体，分析比较HPLC与ELISA的测定方案。研究表明芍药苷的单克隆抗体检测可以应用ELISA进行批量检测，符合我国中药成分制备的标准，基于ELISA的检测方案相比于传统的HPLC检测法更加灵敏准确，具有巨大的市场潜力，希望本文的实验有利于我国中药研究的发展。
参考文献：
[1]徐金森.芍药苷单克隆抗体的特异性检测[J].厦门大学学报（自然科学版），2008，S2：45-48.
[2]邵幼岩.芍药苷的单克隆抗体制备及其中药材的免疫法测定[D].厦门大学，2008.
[3]黄重发，裴小红，朱清，卜全慧，周怿.芍药苷联合奥沙利铂对肠癌细胞增殖和凋亡的影响[J].现代肿瘤医学，2013，09：1953-1956.
论文作者:郑集元
论文发表刊物:《航空军医》2016年第18期
论文发表时间:2016/10/18
标签：芍药论文; 单克隆抗体论文; 抗原论文; 免疫论文; 杂交瘤论文; 细胞论文; 赤芍论文; 《航空军医》2016年第18期论文;