1广西中医药大学第一附属医院 分子生物实验室；2检验科 广西南宁 530023
【摘 要】目的：探讨P16基因（MTS，multiple tumor suppressor 1）CpG岛在广西砷暴露人群中的甲基化状态。方法：用原子荧光分光光度计检测尿砷含量，Real-time PCR方法检测外周血血样中P16基因CpG岛的甲基化水平。结果：接触组尿砷浓度高于对照组，P16基因CpG岛的甲基化水平高于对照组。结论：长期砷暴露人群体内无机砷含量高于正常人，P16基因CpG岛的甲基化水平高于正常人。
【关键词】砷暴露；P16基因
砷（Arsenic）是一种广泛存在并有类金属特性的元素，被认为人类致癌物[1]。有研究表明，砷暴露与健康效应之间存在明显的剂量-反应关系[2]。大量流行病学研究和临床观察表明：iAs及其化合物与人类的皮肤癌、肺癌、肾癌等许多癌症有密切相关[3-4]。慢性砷中毒目前已经成为危害人类健康的一大公共卫生问题。
本研究以广西某冶炼厂员工作为砷暴露研究人群，通过检测受试者血液样品中P16基因CpG岛甲基化水平，以评估其作为砷暴露人群前期预防在临床诊断应用中的可行性。
1 材料和方法
1.1 研究对象和实验材料
1.1.1 研究对象选取
本研究通过典型抽样方法共选取研究对象男性50名，没有明显疾病，在冶炼厂工作一年以上。再选取50名非冶炼厂工人（男性）作为对照。
1.1.2 尿样采集
在研究现场用500 mL一次性聚乙烯管收集空腹晨尿，于4℃下保存，并在一个月之内完成尿砷的检测。
1.1.3 血样采集
在研究现场用5 mL一次性EDTA抗凝管采集外周血，保存在4 ℃。
2 主要仪器和试剂
DNA提取试剂盒（天根公司，中国），Real-time PCR试剂盒（天根公司，中国），荧光定量PCR仪（ABI公司，美国），双通道原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司，中国）。
3 实验方法
3.1 尿砷含量测定
尿样中加入盐酸和高锰酸钾破坏其中的有机物，再加入硫脲-抗坏血酸溶液将5价砷还原成3价砷，在氩氢焰中分解为单质态砷，测定荧光强度。
3.2 基因组DNA抽提及荧光定量PCR
按照Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒步骤操作。接着通过Chemicon公司的CpGGenome DNA Modification Kit将DNA进行亚硫酸氢盐修饰。PCR反应条件：95°C预变性10min，95°C变性15s，60°C 退火/延伸 1 min，共进行40个循环。最后用甲基化率（PMR）来表示甲基化水平。（引物序列见下表1）
4 统计学分析
应用SPSS 13.0软件对所有数据进行统计学处理。实验数据以均数±标准差（mean ±SD）表示，计数资料采用百分率（%）表示，并用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
5结果
1 尿中iAs的测定
尿砷检测结果显示，接触组（职业性砷暴露工人）尿中iAs含量高于对照组（P＜0.01），差异有统计学意义。（见图 1）
讨论
砷一种古老的原生质毒物，对人类健康均可造成严重的影响。砷暴露可引起皮肤癌、膀胱癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤的发病率明显上升。在尿砷测定实验中发现，病例组尿砷含量显著高于对照组（P＜0.01），提示病例组体内有砷及其化合物的积累有引起肿瘤的风险。
P16基因是已知的抑癌基因，P16基因一旦出现甲基化水平升高，或可能引起细胞的恶性增殖。在本次实验中，我们发现砷接触组的P16基因CpG岛的甲基化水平高于正常对照组，这提示我们，长期接触砷及其化合物容易引起该基因甲基化水平最高，进而诱发肿瘤的发生。
参考文献：
[1]World Health Organization.IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans Vol.83[J].Lyon：International Agency for Research on Cancer，Tobacco smoke and involuntary smoking：IARC，2004，：59-94，275-279.
[2]Yin J，Liang D，Vogel U et al.The polymorphism of DNA repair gene ERCC2/XPD Arg156Arg and susceptibility to breast cancer in a Chinese population.[J].Biochemical Genetics，2009，47（7/8）：582-590.
[3]Mei，C.，Hou，M.，Guo，S. et al.Polymorphisms in DNA repair genes of XRCC1，XPA，XPC，XPD and associations with lung cancer risk in Chinese people[J].Thoracic cancer，2014，5（3）：232-242.
[4]郎胜喜.砷及其化合物的职业危害（综述）[J].中国城乡企业卫生，2005，（5）：24-25.
* [基金项目]广西科学研究与技术开发计划课题
论文作者:黄小琪1,林洪升2,陈晶1,林英辉2（通讯作者）
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年6月第12期
论文发表时间:2016/9/29
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