王虹蛟1 王心童2 孟威宏3（综述） 王强1 颜炜群4 (审校)
（1长春解放军第461医院 吉林长春 130021）
（2吉林大学中日联谊医院 吉林长春 130033）
（3沈阳军区总医院心血管内科 辽宁沈阳 110015）
（4吉林大学再生医学科学研究所 吉林长春 130021）
【中图分类号】R94 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）05-0060-02
牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）具用广泛的蛋白酶抑制活性。但BPTI是一种异源性蛋白质，具有抗原性。淀粉样β蛋白前体（APP）中的Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域（KD/APP）是人Kunitz型蛋白酶抑制剂，具用强烈抑制丝氨酸蛋白酶的活性，是较理想的BPTI替代品。本文对其研究进展的国内外文献作如下综述。
1 APP蛋白的代谢与Aβ的形成及研究进展
β淀粉样肽是阿尔茨海默病患者脑内神经炎斑的主要成分。1984年，Glenner和Wong等发现神经炎斑的主要成分是一种由39～43个氨基酸组成、具有β折叠构型的肽，称之为β-淀粉样肽。1987年，Kang等发现,Aβ来源于一种膜整合糖蛋白的水解产物，并将这种蛋白称为β-淀粉样肽前体蛋白(βAPP或APP)。APP蛋白属于I型膜整合糖蛋白，分子量约110～130kD。APP蛋白呈膜受体样结构特征，即膜外较长的氨基端，较短的跨膜区和胞内羧基端。APP基因定位于人染色体21q21.2，长约300kb，包含l9个外显子。通过选择性剪接，可形成至少8种长度不等的APP异构体，其中APP695、APP714、APP751、APP770较为常见。蛋白质结构上APP751、APP770的胞外区比APP695多出一段，由57个氨基酸组成的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(KPI)同源结构域APP，APP695在神经元特异表达，APP770则主要见于AD患者，其他异构体APP则广泛表达。
基因组学研究表明，AD发病与Aβ分泌过量密切相关，因此与Aβ产生直接和间接相关的3种酶成为理想的研究如何减少Aβ的产生和APP代谢的调控目标。
1999年，Vassar 等鉴定影响Aβ产生的基因时发现了一种酶BACE1（也称作Asp2 或Memapsin2) 。BACE1 显示了β分泌酶的所有特性，在所有组织中均有表达，但在脑神经元中表达量最高。Signrdsson将Aβ前30 个氨基酸的N 端加上6 个赖氨酸产生了可溶性低毒性β淀粉样肽，给Tg2576 鼠接种后产生了高滴度的抗体。连续接种7个月后海马和皮层中均观察到斑块量明显的减少。而且用干扰素-1β标记的脑组织中可溶性Aβ1-42的量也减少。Citron[1]发现AD 小鼠外周给予Aβ抗体后抗体进入脑中,黏附在Aβ沉淀物上并激活周围的小胶质细胞,吞噬清除沉积物。体外实验也证明了这一结果:从AD患者脑中取出Aβ沉积物，与小胶质细胞共同培养，加入Aβ抗体后发现小胶质细胞被激活，吞噬Aβ沉积物。载酯蛋白E(ApoE)主要在晚发性早老性痴呆病中起作用，它是一种调节脂类物质运输、存储和代谢的血清蛋白。免疫学研究证实：在大脑神经细胞中有大量的ApoE。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆在早老性痴呆病的形成过程中，ApoE主要是加速Aβ在大脑中的沉积，调节Aβ42/Aβ40的毒性作用。Small等以转基因鼠为实验对象，研究发现ApoE+ 鼠在出生6个月后Aβ沉积的量远远高于ApoE－鼠，另外在早老性痴呆病人大脑斑点中Aβ沉积的密度也受到ApoE的调节。总的来说，Aβ的形成原因是多方面的，目前正在深入研究。
2 APP中的Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域（KD/APP）的分子结构和生物学活性
2.1 APP基因定位和分子结构
APP基因定位于人第21号染色体长臂近侧区(21q21.2)。翻译修饰后的APP是具有单一跨膜结构的膜整合糖蛋白。其基本结构从细胞外N端开始依次是：信号肽(Signal Peptide,SP)序列由17个氨基酸残基组成，在APP转运进入内质网时发挥作用；富含半胱氨酸(Cys)的区域，由含有12个Cys的170个氨基酸残基组成；酸性氨基酸区域，含有100个氨基酸残基，主要是酸性氨基酸—谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)；KD（Kunitz domain,KD）及OX-2区域，第289氨基酸残基处的可变剪接，在APP分子中插入该区域。KD区域由外显子7编码；含有57个氨基酸残基，与Kunitz型蛋白酶抑制剂有同源性；OX-2区域由外显子8编码，含有19个氨基酸残基、肝素结合区域(HBD-2)及N-糖基化区域；Aβ区域由外显子16和17的邻接部分编码，含42个氨基酸残基；单一跨膜区域，含24个氨基酸残基，主要是一些疏水性氨基酸；胞质内区域，APP同系物均含有一个较短的胞质内区域(CD)。
APP的mRNA经过可变性剪切可产生不同的APPs同系物，其中APP751、APP770 和APP695是三种主要的剪切产物，APP751、APP770包含一段Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域（KD/APP）[2]。KD/APP是在APP第288氨基酸的羧基端插入的一片段，插入后APP第289缬氨酸变为异亮氨酸。氨基酸序列与Kunitz 型蛋白酶抑制剂家族的BPTI有43％同源性；经X-Ray衍射分析，分子内有六个半胱氨酸连接成保守的3对二硫键，其活性中性为Arg15-Ala16-Met17（精氨酸-丙氨酸-蛋氨酸，RAM）。而BPTI的活性中心是(KAR)。
KD/APP的21位氨基酸是色氨酸Trp，BPTI是酪氨酸Tyr。较大体积的Trp侧链残基正好充填蛋白表面的疏水沟槽，与溶剂暴露的空间相适应。KD/APP在loop区末端的Met-17和Phe-34在抑制剂表面形成较大的疏水区，这造成了KD/APP对带有疏水基团的糜蛋白酶有抑制活性，而对激肽释放酶A的抑制特性比BPTI降低4倍,而对胰酶的抑制特性升高8倍。
2.2 KD/APP的生物学活性
(1）丝氨酸蛋白酶抑制活性：KD/APP及包含Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域的APPI都具有广谱的丝氨酸蛋白酶抑制活性，通过KD/APP与BPTI对不同丝氨酸蛋白酶抑制的Ki值比较，可以更好的发现KD/APP特异性的靶酶。由于KD/APP对因子XIa、XIIa抑制作用可以直接抑制外源性的凝血系统。
(2）KD/APP的变异体抑制多种丝氨酸蛋白酶[3]：KD/APP的各种变异体可以特异性的抑制不同丝氨酸蛋白酶，能预防和治疗临床上与丝氨酸蛋白酶升高相关的疾病。
(3）抑制Ca2+激活的K＋离子通道的作用：Ca2+激活的K＋离子通道在真核细胞的细胞膜上起到很重要的生理作用，细胞内的Ca2+浓度升高导致选择性的K＋通道的开放[4]，该通道蛋白是由slowpoke基因编码的α亚基和β亚基组成的复合物。
(4）含有KD的APPI还具有细胞表面受体样作用；调节细胞粘附，APPI能够和某些细胞外基质结合而促进神经元的附着[5]。
(5）KD/APP等电点偏酸性，pI为4.3。
参考文献
[1] Citron M.Alzheimer’s disease :treatments in discovery and development．Nature Neuro science ,2002；56(12)：1055-1057．
[2］Vassar MR ，Harrell L．B-Secretase Cleavage of Atzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE．Science，2000；286(8)：735-744．
[3］ White R. Tyler Damm, Deborah, L, et al. McFadden, Kathleen Garrick, Brett L. United States Patent，2003；6,613,890．
[4］Hinrichsen H, Kirch W. Cardiovascular adverse effects of H2-receptor antagonists．Dtsch Med Wochenschr, 1994；119(14)：525-530．
[5］Schubert D, Klier FG. Substratum regulation of neurite fasciculation．Brain Res,1991；549(2)：305-310．
基金项目：国家自然基金课题（课题编号30300153）
论文作者:王虹蛟1,王心童2,孟威宏3（综述） 王强1,,颜炜
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第5期供稿
论文发表时间:2014-5-5
标签：蛋白论文; 氨基酸论文; 丝氨酸论文; 蛋白酶论文; 抑制论文; 区域论文; 疏水论文; 《医药前沿》2014年第5期供稿论文;