刘黎明 李永丽 官念 吴碧华
【摘 要】 目的 初步探讨高频rTMS对血管性认知大鼠海马srGAPs的表达的影响；方法 采用改良Pulsinelli四血管法大鼠全脑缺血模型建立VCI大鼠模型，并采用高频（10Hz）rTMS干预，Morris水迷宫测试观察行为学，western blot观察srGAPs蛋白的表达。结果 高频rTMS 能提高srGAPs蛋白在VCI大鼠海马组织中的表达水平。结论 srGAPs蛋白可能具有神经保护作用。
【关键词】 高频重复经颅磁刺激； 血管性认知障碍； 机制血管性认知障碍（Vascular Cognitive Impairment,VCI）是由脑血管危险因素、明显或不明显的脑血管病导致的认知功能下降综合征，包括轻微认知损害（MCI）到血管性痴呆（VaD）[1]。近年来众多研究表明高频重复经颅磁刺激（rTMS）对血管性痴呆大鼠的空间学习记忆有改善作用，但其机制目前尚不完全清楚[2]，尚需进一步探索。近年研究表明 Slit-Robo GTPase-activating proteins（srGAPs）与记忆有密切的关系。因此，本文主要初步探讨高频rTMS是否对srGAPs的表达有影响。
材料和方法
1．材料
1.1 动物及分组 正常健康12-14周龄雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重260 ~ 300 g，普通级，由川北医学院动物实验中心提供，适应性饲养1周后随机分为正常组10只、假手术组13只，模型真刺激组36只，模型假刺激组36只。
1.2 主要试剂及仪器 SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（康为世纪），
Spectra? Multicolor High Range Protein Ladder （Fermentas），超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天)，rabbit Anti-SR GAP1（博奥森），rabbit Anti-SR GAP2（EPITMICS），rabbit Anti-SR GAP(博奥森)，Rabbit Anti-Tubulin-alpha 1（博奥森），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），PVDF膜（Millipore ），PMSF(武汉博士德生物工程有限公司)，磁刺激仪（magliter30 型）(Medtronic 公司,丹麦)，环形线圈（MCF-75）（Medtronic 公司,丹麦），Morris 水迷宫(北京吉安得尔科技有限公司,中国)。
2．方法：
2.1模型建立 采用改良Pulsinelli四血管法大鼠全脑缺血模型建立血管性认知功能障碍动物模型，假手术组充分暴露大鼠翼状外孔后不烧灼，游离大鼠颈总动脉后不系线，第二天也不用微创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，其余步骤同真手术组。
2.2 morris水迷宫 于术前、术后7天以及高频重复经颅磁刺激干预后第二天分别进行Morris水迷宫实验，包括定位航行试验（逃避潜伏期）和空间探索实验（在原平台象限游泳时间和跨跃原平台的次数）。
2.3重复经颅磁刺激 最大输出强度 4.2 T ，刺激参数： 10 Hz ，30%的最大输出强度，12串，100个脉冲/串，间隔30秒，每天一次，连续刺激两周。
2.4 western blot 冰上无菌刀片分离切取海马组织，用BCA法测量蛋白浓度，western blot法检测大鼠海马组织srGAP1、srGAP2、srGAP3的表达。
2.5 统计方法 实验数据以 表示，并用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，组间比较，如果满足正态分布和方差齐性条件，采用单因素方差分析；如果不满足正态分布和（或）方差齐性条件，采用Kruskal-Wallis H秩和检验，两两比较用“扩展的t检验法”，双侧尾检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
结 果
1．水迷宫
造模前各实验组大鼠全时程平均逃避潜伏期和大鼠跨跃平台的次数、原平台象限游泳时间与正常对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）；手术后模型组全时程平均逃避潜伏期较正常对照组明显延长，跨跃平台的次数较正常对照组减少，原平台象限游泳时间明显缩短，二者差异有统计学意义（P<0.05），模型假刺激组与模型真刺激组的全时称平均逃避潜伏期和大鼠跨跃平台的次数、原平台象限游泳时间之间差异无统计学意义（P>0.05），rTMS治疗14天后模型真刺激组全时程平均逃避潜伏期较模型假刺激组的缩短（P<0.05）和模型真刺激组的大鼠跨跃平台的次数较模型假刺激组增多以及原平台象限游泳时间较模型假刺激组延长，差异有统计学意义（P<0.05）。
讨 论
重复经颅磁刺激(Repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS ) 是在TMS 基础上发展起来的新的神经电生理技术[3]。根据频率不同，可分为1 Hz 及以下的低频rTMS 和高于1 Hz的高频rTMS。不同频率的rTMS 对运动皮层的调节作用不同: 高频rTMS 使大脑皮层的兴奋性增加，低频rTMS 降低皮层的兴奋性。rTMS不仅可以影响局部和远隔皮层的生理生化和功能改变，而且其产生的生物学效应可持续到刺激停止后一段时间，对神经网络的结构和功能有重新塑造的作用[4]。rTMS通过线圈内电流的瞬变从而形成高强度的交变磁场，可在深部脑区产生感应电流，当其感应电流超过神经细胞兴奋阈值时导致细胞膜去极化，引起各种生理生化反应，从而影响机体的功能[5]。
Slit-Robo GTPase-activating proteins（SrGAPs）是Slit-Robo下游信号通路中的Rho GAP的分子，在哺乳动物中srGAP 家族主要由3个家族成员组成：srGAP1、srGAP2和srGAP3 ，srGAP1、srGAP2 和srGAP3 具有较高的同源性[6]。Madura等[7]研究表明srGAP2在神经元轴突再生中起重要作用，提示srGAP2 mRNA 可能有助于轴突修复；srGAP3 能与WAVE-1 形成复合物，对突触信号的传递以及长时间记忆的维持都起着非常重要的作用[8]。
本实验表明高频rTMS干预后模型真刺激组大鼠空间学习记忆的性能得到明显改善。这与Wang、赵秀秀等[9，10]报道一致。Yassa等[11]研究表明海马CA1区与学习记忆密切相关，海马的学习记忆功能的改变可表现为行为学的证据，如海马依赖的空间学习记忆能力的改变。本Westblot实验结果表明模型真刺激组的srGAP1、srGAP2和srGAP3较模型假刺激组表达增多，表明高频rTMS能提高血管性认知障碍大鼠srGAP1、srGAP2和srGAP3的蛋白表达量。高频刺激则会通过长时程增强来增加皮层的兴奋性，从而激活相应神经递质释放、促进相关基因和蛋白表达以及代谢改变等，促进大脑的可塑性改变，进而达到功能的改善[12]。
综上所述，高频rTMS 可能通过其磁场的生物学效应, 提高了与神经保护及学习记忆有关的物质srGAP1、srGAP2和srGAP3的水平，预示srGAP1、srGAP2和srGAP3具有神经保护作用，但其神经保护机制不明，尚需在以后的研究中进一步探索。
参考文献
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论文作者:刘黎明,李永丽,官念,吴碧华
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期
论文发表时间:2016/7/15
标签：大鼠论文; 模型论文; 血管性论文; 认知论文; 记忆论文; 象限论文; 统计学论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期论文;