郑振雨 黄艳芬 朱明明 李静（新乡医学院第三附属医院 河南新乡 453003）
【摘要】目的 探讨氯诺昔康对趋势大鼠骨质疏松性骨折愈合过程中转化生长因子（TGF-β1）的影响。方法 选用8月龄雌性SD大鼠60只，去卵巢方法 建立骨质疏松模型，将大鼠制成左股骨骨折模型，随机分为对照组和实验组，术后给予实验组氯诺西康肌注，对照组给予同体积0.9%氯化钠注射液肌注，共10 d。术后在不同时间段处死，骨痂进行HE染色、TGF-β1免疫组织化学染色及图像分析。结果 HE 染色：实验组软骨生成及软骨内成骨过程较对照组延迟；TGF-β1免疫组织化学染色：实验组在各时间段TGF-β1的吸光度（IA）值均弱于对照组，差异有统计学意义。结论 氯诺昔康有可能通过抑制TGF-β1的表达，进而干扰骨质疏松性骨折的愈合过程。
【关键词】骨质疏松性骨折愈合 氯诺昔康 转化生长因子-β1
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）40-0037-02
Effects of lornoxicam on expression of TGF-β1 during the healing process of osteoporotic fracture in rats
ZHENG Zhengyu*，LI Chunjuan，ZHU mingming，LI Jing
(* The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang，453003，China)
【Abstract】Objective To investigate the effects of Lornoxicam on expression of TGF-β1 during the healing process of osteoporotic fracture in rats. Methods 8-month-old female SD rats were ovariectomized to establish osteoporosis model,Fracture healing model was established by osteotomy on left femur. Sixty model rats were randomized into two groups: 30 for control group, and 30 for Lornoxicam group. Lornoxicam group was given daily by intramuscular injection at dose of 0.2 mg/kg per day for 10 days, while control group was given an equivalent volume of saline. The rats were sacrificed in batches at 1, 4, 8 weeks after operation, and the callus formation was examined with histological and immunohistochemistry assessment. Results Our analysis revealed delayed bone formation in Lornoxicam group. The Lornoxicam group showed lower integral optical density of TGF-β1 protein expression. Conclusion Lornoxicam may delay the osteoporotic fracture healing by inhibiting TGF-β1 expression.
【Key words】Osteoporosis；Fracture healing；Lornoxicam；Transforming growth factor beta
骨质疏松症是一种全身性系统性骨病，其特征是骨量下降和骨细微结构的破坏，使骨的脆性增加，轻微的创伤即容易发生骨折。骨质疏松性骨折是OP 的最严重后果，延迟恢复时间，影响手术效果。氯诺昔康目前术后应用最多的止痛药物之一。已有研究表明，氯诺昔康通过抑制环氧化酶活性进而抑制前列腺素合成，该药的COX1:COX2抑制率为0.6，现有研究显示COX-2不仅具有促进组织修复的作用，还具有促进骨折愈合的功能。本实验拟通过动物研究，探讨氯诺昔对骨质疏松性骨折愈合的影响，为骨质疏松性骨折镇痛治疗提供临床指导。
1 材料与方法
1.1 动物模型建立：取8月龄清洁级雌性SD大鼠60只（新乡医学院实验动物中心提供），体重（245±18）g，去卵巢后制作骨质疏松模型，12周后经随机抽取10只，采用双能X线吸收仪测量BMD，与同龄10 只雌性SD大鼠的骨密度对比，确立大鼠骨质疏松模型建立成功。随机分为对照组和实验组，每组30只。用10%水合氯醛将两组大鼠以3 ml/kg 体质量腹腔注射麻醉、剃毛、橡皮筋固定、消毒，取左大腿外侧纵行切口，线锯造成股骨中段横行骨折，复位骨折端，克氏针固定，冲洗后关闭切口，复苏后饲养。所有大鼠术后均给予青霉素8 万U 腹腔注射，连续3d。实验组于术后即刻给予氯诺昔康0.2mg·kg-1·d-1肌注，连10d；对照组肌注同体积的生理盐水。
1.2 组织处理：在于饲养后第1、4、8周各随机选取10只大鼠处死，取出左股骨，去除克氏针，以骨折处为中心，切取长约1cm股骨，冲洗后用4%多聚甲醛固定24h，20%乙二胺四乙酸脱钙，每5-7d更换脱钙液，共5周，手术刀纵向剖开所取骨块，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片，厚度4μ米，行苏木素-伊红（HE）染色，倒置相差光学显微镜下观察。
1.3 免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育，SP法免疫组织化学染色。采用抗原高压热修复，滴加1:100 稀释的一抗，保湿盒内4℃过夜，滴加二抗，PBS冲洗，保湿盒内37℃下孵育30min，二氨基联苯胺显色，阳性表达为组织内出现棕黄色颗粒，空白对照以PBS 代替一抗。每张切片随机选取5个不同的视野，图像分析仪行图像分析，计算TGF-β1阳性表达积分吸光度值（IA）。
1.4 所有数据通过SPSS13.0 软件进行分析，各组间数据以x-±s 表示，检验方法采用两组独立样本比较t检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨痂观察：骨折内固定术后术后第1周，可见大量细胞聚集在骨折断端，骨外膜膜细胞转变为成骨细胞，可见骨小梁出现，纤维骨痂形成，断端的肉芽组织中软骨前体细胞增殖，有少量新生的软骨细胞形成。术后第2周，有软骨岛出现，对照组的软骨细胞数比实验组多，且软骨岛面积大。术后第4 周，对照组新生的软骨明显增加，可见网织骨，实验组可见大量新生软骨，但网织骨形成不明显。术后8周，对照组大量骨小梁开始形成，间隙清楚，有肥大的软骨细胞；氯诺昔康组骨小梁较少，间隙较细小。
2.2 TGF-β1免疫组织化学染色观察：骨折内固定术后第1周，骨外膜细胞，周围成纤维样细胞、软骨细胞和成骨细胞染色阳性，实验组比对照组阳性细胞数少，且染色较浅。术后第4周，组织中阳性细胞数减少着色较前变浅，实验组软骨细胞阳性表达弱于对照组。术后第8 周，对照组的软骨细胞变大，然色阴性，成骨细胞和类骨质为阳性然色；实验组类似，但其软骨细胞数量较多，然色浅。见表1
表1 骨折端TGF-β1免疫组织化学染色图像分析
注：*与对照组比较，P＜0.05；
3 讨论
3.1 在骨质疏松骨愈合研究中，现在应用最广泛的动物模型为雌性大鼠。1969年Savile就已经开始用大鼠建立绝经后骨质疏松动物模型，现在去势雌鼠骨质疏松模型模型已被认为“经典病理模型”[1]。雌性大鼠出生后6-9个月进入骨生长静止期，与人类代谢稳定阶段相似，此时期多可制作出符合临床要求的动物模型[2]。本实验通过测定BMD，证实模型大鼠的全身BMD 显著降低（P<0.05），符合绝经后骨质疏松模型的要求。骨折模型的建立分为闭合性方法和开放性方法，但闭合折骨类型较多，可比性较差。我们之所以使用切开锯断的方法获得骨折模型，是因为该方法可以获得统一的骨折类型，可以确保数据的可比性。
3.2 TGF-β与骨折愈合：转化生长因子-β是新近发现具有调节细胞生长和分化的蛋白多肽超家族，TGF-β在骨骼生长和修复的过程中，起着重要作用[3]。其前体经过酸化蛋和蛋白质本身的裂解作用可以形成具有活性的TGF-β，而在体内，骨折附近就处于酸性环境， TGF-β 能够对促进成骨细胞前体细胞以及破骨细胞前体细胞的分化[4]。TGF-β有5 种异构体，现在研究最多的是TGF-β1。有研究报道[5]大鼠胫骨骨折后3～21d 时，骨折部位会可检测到TGF-β1，在软骨形成和骨痂成骨过程中TGF-β1表达最高，表明TGF-β1在骨折愈合过程中有重要作用，不仅如此，现有研究表明在骨折修复的各个时期均可产生TGF-β1[6]。我们用HE 染色和免疫组织化学方法，研究氯诺昔康对大鼠骨质疏松性骨折愈合过程的影响，发现氯诺昔康组TGF-β1阳性表达比对照组低，有可能是抑制了成骨细胞和骨折部位其他细胞TGF-β1的表达，进而延缓了骨形成过程。另外，目前有研究发现，COX-2也具有促进骨折愈合的作用[7]，并且在间充质细胞分化为成骨细胞的过程中COX-2起着重要作用[8]，Simon等的实验认为COX-2骨折愈合过程中其重要作用，COX-2基因敲除鼠中骨折愈合过程受到破坏[9]。有研究表明10，抑制COX-2可以减弱骨形态发生蛋白（BMP）-6的蛋白质合成。骨折愈合过程的多种因子所起的调控作用是非常复杂的，TGF-β1和COX-2还不能解释其全部内容，目前为止，还没有人体数据证明氯诺昔康对骨折愈合有负面影响，术后镇痛应和其临床利益综合衡量，不宜将实验动物模型中得到的结果直接推导到人体。
参考文献
[1] 张月峰，韩景献．骨质疏松动物模型研究进展[J]．动物医学进展，2005，26(3)：8-11．
[2] 贾经汉，邱新建，陈志坚，等．常用骨质疏松动物模型特点的综述[J]．广西中医学院学报，2006，9(4)：76-79．
[3] 张德胜.TGF-β家族及其受体组成[J].生命科学,2005,7(2):32-35.
[4] 徐卫东,张春才,孟济明.细胞因子与软骨损伤修复[J].中华风湿病学杂志,2009,3(1):57-59.
[5] Boseh P, et al. The spatiotemporal expression of TGF- beta1 and its receptors during periostealchondrogenesis in vitro[J].Orthop Res,2002,20(3):562- 574.
[6] 李伟，赵光锋，喻任.转化生长因子-β1、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白-2在大鼠骨质疏松骨折愈合骨痂中的表达[J].中华急诊医学杂志，2003，12（8）：530-532.
[7] 叶任高，陆再英.内科学.6 版.北京:人民卫生出版社，2004.
[8] Zhang X，et al. Cyclooxygenase -2 regulates mesenchymal cell differentiation into the osteoblast lineage and is critically involved in bone repair [J]. Clin Inves，2002，109(11)：1405-1415.
[9] Simon A，et al.Cyclo-oxygenase2 function isessential for bone fracture healing[J]. Bone Miner Res2002;17:963-967
[10] Damrongsri D，et al. Cyclooxygenase-2 inhibition selectively attenuates bone morphogenetic protein -6 synthesis and bone formation during guided tissue regeneration in a rat model[J]. Clin Oral Implants Res，2006，17（1）:38-47.
论文作者:郑振雨,黄艳芬, 朱明明,李静
论文发表刊物:《中外健康文摘》2013年第40期供稿
论文发表时间:2014-4-24
标签：软骨论文; 实验组论文; 细胞论文; 骨质疏松论文; 术后论文; 模型论文; 大鼠论文; 《中外健康文摘》2013年第40期供稿论文;