张友鸿[1]2002年在《人FL基因在大肠杆菌中的表达研究》文中进行了进一步梳理造血细胞生长因子在血细胞生成调节机制中具有重要意义。主要包括：红细胞生成素(Epo)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(Tpo)和flt3配体(FL)等。人FL(flt3 ligand)是近年发现的重要造血生长因子，主要作用于早期原始的干／祖细胞，促进其增殖和分化。FL与其它因子联合作用，可明显刺激树突状细胞(dendritic cell，DC)的增殖。FL的作用较为广泛，与人SCF(stem cell factor)有些不同，没有明显的种属特异性，它在造血系统原发性或继发性损伤疾病的治疗、外周血干／祖细胞的动员和移植以及肿瘤免疫治疗中都有潜在应用价值。本论文主要包括四部分内容： 1．人FL的分泌表达； 2．人FL的融合表达； 3．人FL的非融合非分泌表达； 4．rhFL部分理化性质及生物学活性测定。 1．FL的分泌表达： 根据已报道的人FL序列和大肠杆菌偏爱密码子合成寡核苷酸片段，通过PCR方法成功地合成人FL基因。为了获得正确折迭、可溶性的具有生物学活性的重组人FL(rhFL)，在FL基因的5’端增加stⅡ的信号肽，用于将目的蛋白定位于大肠杆菌间周质，因为间周质含有催化二硫键形成的蛋白酶。当重组的目的蛋白分泌至间周质时，信号肽被信号肽酶切掉，形成N末端不含任何多余氨基酸的重组人FL。然而，已构建的多个分泌表达载体经诱导表达，SDS—PAGE表明没有明显可见的目的蛋白表达区带。碱性磷酸酶的启动子能够在培养基中缺乏磷的情况下启动碱性磷酸酶基因的表达。以碱性磷酸酶的启动子，连接stⅡ信号肽、FL基因、T7终止子为表达单位，插入pBR322，通过无磷培养基诱导表达，得到的表达产物经SDS-PAGE和western blot鉴定显示有rhFL表达，但表达水平比较低。 2．FL的融合表达： 融合表达能获得较高的表达产量，是基因工程表达重组蛋白的有效策略之一。硫氧还原蛋白(Trx)是大肠杆菌的自体蛋白，将其基因插入表达载体pET30a获得pET30a-Trx。将FL基因连接于Trx基因的3’端，构建成融合表达质粒pET30a-Trx-FL，在Trx与FL之间增加FXa酶切点。将该融合表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导，融合蛋白表达量高达菌体总蛋白的60％，并以包涵体形式存在。经Q-Sepharose-Fast Flow。Superdex75柱层析纯化，Trx-FL纯度达90％。经FXa切
郁建锋[2]2004年在《重组人FL在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定》文中进行了进一步梳理Flt3配体(Flt3 ligand,FL)是Ⅰ型跨膜糖蛋白,含有两个N型糖基化位点,广泛地表达于机体的各个组织,部分FL还以可溶性形式存在,且两种形式都具有生物学功能。FL蛋白的前1～134位的氨基酸对于维持其生物学活性是必需的。FL通过与Flt3受体作用,增加进入细胞周期的原始祖细胞,促进造血干/祖细胞的增殖和分化,刺激机体的早期造血。FL还可以与其它一些生长因子(如SCF、G-CSF、GM-CSF和IL-3等)协同作用,促进淋巴细胞和髓系细胞的生长。因而FL有利于机体的造血重建,对于造血动员、辐射损伤救治和肿瘤病人的造血功能的恢复具有潜在的临床应用价值。FL最突出的作用是它能在体内显着地上调产生DCs,通过产生不同的DC群体,可以诱导免疫耐受或刺激免疫应答。FL的这些作用使它有可能成为抗肿瘤免疫、抗感染免疫和移植免疫方面具有潜在应用价值的药物。 虽然FL具有重要的临床应用价值,但迄今为止的报道表明其在大肠杆菌系统的表达尚不完备,受到了表达量的限制以及引入较多外源性蛋白,并且生物学活性低下。而在其它系统中的表达量低下,给下游工程带来困难。因而,本实验选取对FL基因进行改造后的合成基因,在大肠杆菌体系中高效地表达了FL功能片段,通过对包涵体变性和复性,应用HiTrap~(TM)柱一步纯化获得了较高纯度的rhFL134重组蛋白。并用经典的集落形成实验和CD34~+细胞的扩增实验证实了rhFL134重组蛋白具有显着的生物学活性。本实验为具有生物学活性的rhFL的大规模生产提供了有效的方案,为FL的进一步研究和应用奠定了物质基础。 一、fl134表达载体的构建 以本实验室的合成FL胞外段基因和天然的fl基因为模板,应用PCR技术扩增出对FL蛋白生物学活性至关重要的前134个氨基酸的基因序列(fl134),克隆入pET30a表达载体,并且在FL的N端引入了一个Met和C端加了Leu和Glu各一个
祝怀平, 孙自敏, 汪健, 戴海明, 吴竞生[3]2001年在《FL基因的克隆及在大肠杆菌中表达》文中指出目的获得人FLcDNA膜外序列 ,构建表达人FL蛋白的重组体并实现其有效表达 ,更深入地探讨FL的生物学功能。方法提取胎肝细胞总RNA经RT PCR扩增目的cDNA片段 ,并将其克隆至pUC 18T载体中 ,测定其DNA序列 ,将该基因重组于GST融合蛋白表达载体pEGX 4T 1并进行表达。结果从胎肝细胞总RNA中扩增得到 5 46bp片段 ,序列测定结果与文献报道一致 ,表达的FL蛋白占菌体总蛋白的 10 %左右。结论人FL基因在大肠杆菌DH5α中获得了有效表达 ,为进一步的基础研究和临床应用奠定基础。
张艳丽[4]2004年在《人FL的甲醇酵母表达及腺病毒介导的免疫基因治疗》文中提出人FL(flt3 ligand)是近年发现的重要造血细胞因子，其功能类似于hSCF，主要作用于早期原始的干／祖细胞，促进其增殖和分化，与其它细胞因子联合应用，可产生明显的协同作用。与hSCF不同的是，hFL对肥大细胞没有作用，没有种属特异性，并且可显着刺激树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NK)的增殖。这些功能使FL在造血系统原发性或继发性损伤疾病的治疗、造血干细胞移植，特别是在肿瘤免疫基因治疗和免疫疫苗制备等方面具有重要的潜在应用价值。DCs细胞作为功能最强的抗原提呈细胞(APC)，在免疫应答反应中起着关键作用，能诱导非特异性先天免疫反应和特异性获得免疫反应。利用FL扩增DCs的抗肿瘤免疫治疗效果，在动物模型中已得到验证。本研究利用hFL能显着刺激体内DCs增殖的生物学特性，用基因工程方法表达重组hFL，对小鼠种植瘤进行抑瘤效果试验，为进一步研究hFL在肿瘤免疫治疗中的有效作用提供实验依据。本论文主要包括两部分内容： 一、应用酵母表达系统，表达分泌性人FL(hFL)的K84E／Q122R突变体。hFL第84位和122位氨基酸的密码子分别改造为E和R的密码子，并在N端采用甲醇酵母偏爱密码子，以提高hFL的活性和表达量。将该突变体的基因克隆入酵母穿梭质粒，得到重组表达载体pPIC9K-hFL，电转入甲醇酵母，用原位双膜筛选法筛选获得Mut~+及Mut~s高表达转化子，分别进行了表达条件的优选并基本建立了分离纯化rhFL的工艺，两者最佳表达条件为：Mut~+转化子用BMMY培养基(pH6.0)，Mut~s转化子用BMM(pH6.0)，经2％甲醇诱导96h。与Mut~+型相比，Mut~s转化子在含营养和色素较少的BMM培养基中即有高表达，且表达产物杂蛋白少，易于纯化。重组hFL表达量达30mg／L。采用Q-FF分离→浓缩→Sephacryl S-200分离纯化，步骤简单有效。回收率约为20mg／L。用内糖苷酶EndoH切除hFL N-糖链后，结果显示hFL中除N-糖基化外，可能还有其他形式的糖基化。纯化的hFL经Western印迹和N端前10个氨基酸序列分析验证，结果与预期一致，质谱法测定其分子量为20～22kD。 生物学活性实验结果表明，单用hFL可以显着刺激小鼠骨髓有核细胞扩增，与mGM-CSF联用可以协同增强刺激小鼠骨髓GM-CFU集落形成。 rhFL对鼠EL4淋巴瘤的抗肿瘤结果表明：小鼠皮下移植EL4淋巴瘤，连续注射14天hFL后，肿瘤比对照组减小，抑瘤率为25％左右。P＜0.001，差别具有显着统计学意义。
刘小林, 段秀梅, 方艳秋, 谭岩, 史宏博[5]2007年在《Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定》文中指出目的:获得人Flt3配体(FL)cDNA胞外段序列,构建表达人FL蛋白的原核重组表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。方法:提取K562细胞总RNA,利用巢式PCR技术扩增出目的cDNA序列,构建重组质粒pGEM-FL,经酶切、PCR和测序鉴定后,将rhFL基因亚克隆到原核表达质粒PQE30,构建重组表达质粒PQE30-rhFL,在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析方法纯化目的蛋白,Westren blotting杂交鉴定纯化蛋白,并用造血集落形成实验检测生物学活性。结果:经测序证实,获得的目的基因与GenBank公布的FL基因序列100%一致。构建的原核表达载体PQE30-rhFL在大肠杆菌M15中经1 mmol.L-1IPTG诱导后表达出相对分子质量为25000的蛋白,镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Westren blotting,在相对分子质量为25000处可见特异性着色带。结论:构建了原核表达载体PQE30-rhFL,并成功诱导了rhFL蛋白的表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的rhFL蛋白。
贾佳[6]2010年在《蛋白折迭液相色谱法复性与同时纯化重组人Flt3配体的研究》文中研究说明近年来,蛋白折迭液相色谱(Protein folding liquid chromatography, PFLC)法越来越多地被应用于包涵体蛋白复性与同时纯化中,PFLC的特点是能在色谱过程将目标蛋白与其它组分分开的同时,还能在色谱柱上进行变性蛋白折迭。本论文①对在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3 ligand, rhFL)进行了摇瓶中菌种培养条件的优化,获得了高表达的rhFL包涵体蛋白；②经超声破碎、离心并多次洗涤沉淀获得纯化的包涵体,并将其溶解于8 mol／L脲中得到变性蛋白的抽提液；③利用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)法,包括一个分析型HPHIC柱、半制备型HPHIC饼和新型单柱二维液相色谱(A novel two-dimensional liquid chromatography using a single column,2DLC-1C)柱进行rhFL包涵体复性与同时纯化的保留特征和复性规律的研究,为大规模制备rhFL蛋白和将其用于临床研究奠定基础。本论文共有四个部分：1.文献综述：对近年来不同机理的PFLC法在蛋白质折迭与同时纯化中的进展和应用,以及FL的结构、生物学功能及临床应用的重要性进行了综述。2.摇瓶中rhFL菌种培养条件的优化：研究了摇瓶中培养基、培养条件(温度、诱导时间、pH、接种量)对rhFL表达的影响。实验结果表明,在培养温度为35℃、选用初始pH值为6.6的SOB培养基、甘油做为碳源、诱导4 h、接种量为4%的条件下,rhFL蛋白的表达量可占菌体总蛋白的47.4%。3. HPHIC法对E.coli表达的rhFL包涵体复性与同时纯化：分别选用不同规格的色谱柱(分析型色谱柱、半制备型色谱饼),通过色谱流动相(小分子添加剂、流速)和进样量对rhFL复性与纯化过程中质量回收率的影响,筛选出rhFL包涵体蛋白在HPHIC柱上复性与纯化的最佳条件和保留规律,初步用荧光光谱法考察了rhFL在色谱柱上复性前后荧光强度变化,并用HPHIC饼对rhFL进行规模化制备。结果分别在固定相配基为苯基的分析型色谱柱、半制备色谱饼上复性与同时纯化rhFL包涵体的质量回收率可达45.9%、67.0%,纯度分别为93.5%、92.1%。对G-CSF依赖株NFS-60的细胞增殖作用的活性结果表明,当与G-CSF协同作用时,平均比活为7.42×108IU／mg。4.新型单柱二维色谱柱对rhFL包涵体复性与同时纯化：新型2DLC-1C柱是在一根色谱柱上兼具有了HIC和IEC两种保留模式,已被用于活性蛋白的快速分离。本工作选用了2DLC-1C柱的HIC模式与和以苯基为配基的HPHIC柱,比较两种色谱柱对rhFL复性与同时纯化过程中流动相的洗脱的盐浓度变化对目标蛋白质量回收率的影响。实验结果显示,在以苯基为配基的色谱柱上,当流动相(NH4)2SO4盐浓度为3.0 mol／L时,rhFL的质量回收率可达到48.7%。而新型的2DLC一1C柱,当流动相为2.0 mol／L(NH4)2SO4时,即可获得的质量回收率为48.5%。从而证实新型填料的2DLC-1C柱在较低盐浓度下可达到较高的质量回收率。此结果也提示这种新型的双保留模式色谱柱,有可能降低规模化制备rhFL蛋白的成本。
郁建锋, 李大为, 马弘冰, 吴明媛, 周璇[7]2005年在《重组人Flt3配体在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定》文中认为根据天然的人Flt3配体(Flt3ligand,FL)基因和遵循适合大肠杆菌BL21(DE3)表达体系表达条件及不改变FL天然蛋白氨基酸序列的原则,对其进行改造,所获得的FL功能片段(FL134)克隆入PET30a表达载体,在C端融合了6个His,继而在大肠杆菌中诱导表达。结果表明重组蛋白rhFL134以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中可得到较高水平的表达。通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达92%以上的rhFL134重组蛋白。体外的活性实验显示,重组蛋白rhFL134具有显着的促小鼠骨髓细胞的集落形成和扩增人脐带血中的CD34+细胞的生物学活性。
黄河[8]2006年在《Flt3配体基因的克隆、表达及生物学活性鉴定》文中研究说明早期造血生长因子FL是酪氨酸激酶Ⅲ受体(Flt3)的配体,与受体结合后能够调节最原始的造血干/祖细胞的增殖和分化,动员和刺激髓系及淋巴祖细胞、DCs和NK细胞增殖和分化,是树突状细胞(DC)最为重要的生长因子;可与多种细胞因子协同,提高造血功能,与IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ等抗肿瘤因子有协同效应,从而在机体抵抗肿瘤的免疫过程中起重要作用。本文从K562细胞中分离出人FL的胞外段基因(hsFL),与pcDNA3表达载体相连,构建了pcDNA3/hsFL真核表达质粒,脂质体转染Hela细胞后进行RT-PCR、Western blot、ELISA及一系列生物学活性鉴定的检测;同时还将hsFL与原核表达载体pQE30相连构建了原核表达质粒,并进行了表达和纯化。结果表明:本实验获得的hsFL cDNA序列与Genbank的登录结果一致,有两处点突变,但所表达的氨基酸未变;发现了两种hsFL的剪变体,对这两种剪变体的研究目前正在进行中。pcDNA3/hsFL真核表达质粒转染Hela细胞后,经RT-PCR验证细胞内有目的基因的mRNA存在,说明能够有效地转录hsFL基因;Western blot有特异条带出现,与预期位置一致;ELISA法测得72h后培养上清中的hsFL含量为56.8ng/ml/1×106cells,并且分泌的hFL能促HL-60细胞增殖,在无血清培养的条件下还能促进Raji细胞的生存和抑制细胞凋亡的发生。说明通过该真核表达系统表达出的蛋白质具有良好的生物学活性。构建了原核表达质粒pQE30/hsFL,表达出可溶型FL蛋白,并进行了纯化。原核表达蛋白Western blot在预期位置出现条带,造血集落形成实验证实原核系统表达的hsFL蛋白与SCF、GM-CSF、IL-3有协同作用,表现出良好的生物学活性。
吴成利, 师建国, 颜真, 韩苇, 石继红[9]2002年在《人FLT3配体的克隆、表达与纯化》文中研究说明目的 克隆人 FL T3配体 (Flt3L igand,FL)基因 ,并在大肠杆菌中对 FL进行表达、纯化 .方法 分离人外周血单个核细胞 ,提取总 RNA,采用 RT-巢式 PCR扩增人 FL T3配体胞外段基因 ,以双脱氧终止法进行 DNA序列分析 ;将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体 p RSET- B;重组质粒 p RSET- B- FL 转化大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,用 IPTG进行诱导后 ,收集细菌 ,菌体裂解后 ,利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进行纯化 ,并进行 SDS- PAGE及 Western-blot检测 .结果 从人外周血单个核细胞中克隆得到长 4 6 2bp的 FL基因 ,测序正确 ;经 Eco R 和 H ind 酶切鉴定证实 ,FL 成功地克隆到表达载体 p RSET- B;构建的表达载体p RSET- B- FL在大肠杆菌中表达出 Mr 2 4 0 0 0的融合蛋白 ,经常压离子交换色谱化后的融合蛋白的纯度达到 90 % ,该融合蛋白具有 FL 抗原特性 .结论 成功地克隆并表达了 FL基因 ,并对融合蛋白进行了初步纯化 ,为大规模获得 FL创造了条件 .
王宁[10]2002年在《精原干细胞途径建立hFIX转基因小鼠及Flt3配基乳腺生物反应器研究》文中研究指明（一）精原干细胞是精子的前体细胞，是雄性成体动物中唯一可以自我增殖、更新并向下一代传递遗传信息的细胞类型。对精原干细胞的操作和修饰在建立转基因动物模型、男性不孕症的治疗等方面有重要意义，对于生殖细胞途径的基因治疗也有重要的参考价值。我们研究EffecteneTM转染试剂介导下，将基因在体外条件下导入小鼠精原干细胞及移植的可能性，并与其他一些方法的效率进行了比较。同时探讨了活体中转染精原干细胞的可能性，并在此基础上建立了hFIX转基因小鼠模型。1. 在离体条件下探讨和比较了不同转染方法EffecteneTM、电击、脂质体对精原干细胞的转染可能性和效率。结果表明EffecteneTM可以介导精原干细胞的转染。尽管其转染效率还低于其他二倍体细胞及电击方法，但要比其他途径的转染方法效率高且无明显的细胞损伤。2. 将EffecteneTM转染后的精原干细胞移植到Busulfan处理过的小鼠睾丸中，发现转染了外源基因的精原干细胞可以重新增殖、分化， 并表达外源基因。附睾总DNA的PCR结果验证了所观察到的结果3. 不同时间进行移植对阳性细胞克隆的数量有影响，最佳的移植时间应为转染后12小时以内。结合EffecteneTM转染方法及精原干细胞移植技术并进行优化可以应用于建立转基因动物模型。4. 活体中曲精细管注射方法的效果要比睾丸细胞间质直接注射方法效果好，精原干细胞的转染效率更高。5. 通过玻璃针将EffecteneTM包裹的人凝血因子IX表达载体注入小鼠的曲精细管。通过PCR和Southern对子代41只小鼠进行鉴定，有2只仔鼠的基因组中整合有人凝血因子IX基因表达框架，整合率为4％（2/41）。通过ELISA在其中一只小鼠的血浆中检测到hFIX的表达，表达量为4.6ng/ml。<WP=7>（二）FLT-3 配基（fms like tyrosine-3 ligand，FL）是继干细胞因子（SCF）、巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）后发现的又一种膜结合型早期造血生长因子，它以多种同源异型蛋白形式存在、广泛分布于造血基质细胞以及肾、肝、胎盘等组织中，具有很强的协同刺激造血干、祖细胞增殖分化的能力。FL不仅对造血干细胞（HSC）和造血祖细胞（HPC）的增生、分化、动员、维持及长期重建具有重要作用，还能明显的促进淋巴细胞特别是树突状细胞（DC）、NK细胞等免疫系统组成细胞的增生。FL在某些感染性疾病、器官移植、肿瘤的基因治疗等方面有重要、广阔的临床应用前景。为了实现乳腺反应器转基因动物方式生产人Flt3配基，我们在克隆人FL基因胞外区片段，在离体、活体条件下表达了有功能活性的人FL。在此基础上构建了人FL乳腺特异性表达载体，并在人乳腺癌细胞中验证了载体表达人FL的有效性。1． 从人外周血单核细胞中用RT－PCR方法克隆了人573bp的FL基因胞外区片段，在此基础上构建了真核表达载体pCDNA3K3，并在BHK细胞中进行了表达检测。ELISA结果表明表达载体pCDNA3K3在体外BHK细胞中的表达量为：5.7ng/mL。Western检测结果表明所构建的pCDNA3K3在真核细胞中可以表达人FL基因。2． 将pCDNA3K3质粒通过大剂量稀释后注射小鼠尾静脉后，对小鼠血浆中人FL蛋白的含量进行了连续的检测，并用流式细胞仪对小鼠外周血中CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD34＋细胞亚群的变化进行了检测。结果表明人FL基因可在小鼠中高效表达，其最高值为33.7ug/mL，表达持续2周左右。小鼠外周血中CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD34＋细胞亚群的数量均有明显的增高。3． 为了探讨建立FL乳腺生物反应器的可能性，以人FL胞外区0.6kb cDNA片段分别构建了小鼠MAR元件／β-酪蛋白(β-casein)和绵羊β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin BLG)启动子控制的hFL乳腺特异性表达载体：pMBCFL、pBCFL、pBFL 。表达载体瞬时转染人乳腺癌细胞ZR－7530，经ELISA方法检测，其表达量分别为：2.7ng/mL、1.8ng/mL、2.1ng/mL。
参考文献：
[1]. 人FL基因在大肠杆菌中的表达研究[D]. 张友鸿. 中国协和医科大学. 2002
[2]. 重组人FL在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定[D]. 郁建锋. 苏州大学. 2004
[3]. FL基因的克隆及在大肠杆菌中表达[J]. 祝怀平, 孙自敏, 汪健, 戴海明, 吴竞生. 中国生化药物杂志. 2001
[4]. 人FL的甲醇酵母表达及腺病毒介导的免疫基因治疗[D]. 张艳丽. 中国协和医科大学. 2004
[5]. Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定[J]. 刘小林, 段秀梅, 方艳秋, 谭岩, 史宏博. 吉林大学学报(医学版). 2007
[6]. 蛋白折迭液相色谱法复性与同时纯化重组人Flt3配体的研究[D]. 贾佳. 西北大学. 2010
[7]. 重组人Flt3配体在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定[J]. 郁建锋, 李大为, 马弘冰, 吴明媛, 周璇. 现代免疫学. 2005
[8]. Flt3配体基因的克隆、表达及生物学活性鉴定[D]. 黄河. 吉林大学. 2006
[9]. 人FLT3配体的克隆、表达与纯化[J]. 吴成利, 师建国, 颜真, 韩苇, 石继红. 第四军医大学学报. 2002
[10]. 精原干细胞途径建立hFIX转基因小鼠及Flt3配基乳腺生物反应器研究[D]. 王宁. 复旦大学. 2002
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