苗林[1]1995年在《珊瑚人工骨理化性能检测，生物学评价及骨修复作用的评价》文中进行了进一步梳理从生物学的观点来看，理想的骨移植代用品应能完全被宿主骨取代。珊瑚人工骨因其具有与人类骨骼相似的结构和成份自70年代以来引起人们的广泛注意，并作了大量的研究，证实了珊瑚人工骨具有良好的生物相容性、骨传导作用和生物降解特性。近年来国内也有初步的研究报道，但缺乏系统性，作为一种新型骨移植代用品应用于临床，尚有大量的问题亟待解决。我们采集海南三亚滨珊瑚，经处理后，对以下方面进行了研究。 1 物理、化学性能测试 观察了材料应用前的清洗过程对珊瑚理、化性能的影响，并且对我国海南滨珊瑚进行了较为全面的物理性能、机械性能和化学成份的测定。结果显示，清洗过程对珊瑚硬度、密度、机械性能无明显影响，能适当加大孔隙率，能有效地清除珊瑚中的有机成份，以去除抗原性，具体测试结果为：硬度68.85kg／mm~2，密度1.956g／cm~3，孔径约179μm，交通孔径125μm，孔隙率约36.5％，CaCO_3含量98.5％，蛋白质0.009％，游离氨基酸54.6mg／100g，抗压强度18.6MPa，抗拉强度0.8MPa，弹性模量49.7GPa，泊松比0.38，抗剪强度为：内摩擦角56.7℃，凝聚力2.1MPA。从力学性能结果综合分析，珊瑚人工骨强度低，脆性大，弹性模量与人骨相比仍偏高。 2 生物学评价 在国内，较为全面地评价了珊瑚人工骨的生物学性能，以确保临床应用的安全。具体检测了细胞毒性、溶血，经口LD_(50)、热源试验、皮下、肌肉种植试验，结果显示珊瑚人工骨具有良好的细胞相容性，溶血、热源试验符合标准，无全身毒性作用，材料植入软组织无明显的炎症反应，无
佚名[2]2010年在《CRTER杂志呼吸科方面生物材料研究的发稿方向》文中指出○可吸收椎体内支撑器植入中远期组织学、影像学及生物降解研究○血管内皮祖细胞靶向损伤血管内皮磁共振成像的实验研究○纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料提高义齿修复效果的实验研究○超顺磁Fe_3O_4纳米粒子的抗肿瘤药物靶向释放体系设计○珊瑚人工骨理化性能检测,生物学评价及骨修复作用的评价○生物医用Ti-Ta基合金的形状记忆效应和力学性能的研究
林山[3]2011年在《数字化珊瑚羟基磷灰石人工骨支架的制备及生物学评价》文中研究说明研究背景由于创伤、感染、骨肿瘤以及发育异常等原因造成的骨缺损,特别是复杂解剖结构的骨缺损一直是困扰临床的一大难题。目前,对于骨缺损的治疗主要采用自体骨移植和异体骨移植。然而,自体骨供应来源有限,并能造成供骨部位的残留疼痛和变形；异体骨具有抗原性,存在感染疾病的风险,而且自体骨和异体骨,很难制造出与骨缺损形态相匹配的外形轮廓。20世纪80年代出现的骨组织工程学技术为骨缺损,特别是复杂结构的骨缺损的修复开辟了新的渠道。支架是骨组织工程的关键要素之一,理想的支架材料不但要具有良好的机械强度和生物活性,而且要具备能够提供细胞和新生组织长入的合理三维空间结构,以及与缺损部位相匹配的复杂外形。虽然传统的支架制造方法(纤维黏结、相分离、溶剂浇铸/微粒过滤、膜迭片法、融化成形、气体发泡/微粒过滤法以及这几种方法的并用)应用已经十分广泛,但存在致命缺点,主要表现为制造过程人工操作,使用有毒的有机溶剂,缺乏对孔结构(如孔的尺寸、空间走向、连通性等)的控制,很难制造出与骨骼相匹配的外形轮廓。20世纪80年代出现的一种基于计算机辅助设计(Computer aided design, CAD)的新型制造技术——快速成形(Rapid prototyping, RP)技术,可以制造任意复杂形状的三维实体,为骨组织工程支架的仿形与仿生制造提供了可能。本研究组自1995年,用“热液交换反应法”将滨珊瑚改造合成为珊瑚羟基磷灰石(Coralline hydroxyapatite, CHA),并且证明生物相容性良好,其天然的微孔样结构与人的松质骨结构极其相似,有利于纤维及血管组织长入,但CHA人工骨脆性较大,无法根据骨缺损的形状个性化地制备出人工骨支架,存在一定不足。如果能够利用快速成形技术,在保留珊瑚羟基磷灰石的天然微孔样结构的基础上,根据骨缺损的形态,利用数字骨科相关技术,个性化地制备出人工骨支架修复材料,这样可以避免支架制备过程中二期制孔的繁琐工艺,这将极大地促进骨组织工程支架的发展。具有生物相容性和可降解性的高分子生物材料为数字化珊瑚羟基磷灰石(Digital coralline hydroxyapatite, DCHA)人工骨支架材料的制备提供了关键“附形剂”。左旋-聚乳酸(L- polylactic acid, L-PLA)是一种已在医学上广泛应用的人工合成的高分子材料,作为人体的植入物已经通过美国食品药品管理局的认证,并已被广泛用于内固定装置例如骨板、骨钉、手术缝合线、纺丝等。本研究将选用L-PLA作为“附形剂”,将珊瑚羟基磷灰石制备成DCHA人工骨支架材料,通过系列实验,研究DCHA人工骨支架材料的理化学特性、生物相容性,通过修复动物骨缺损模型,探讨其临床应用的可行性。研究目的1.研究DCHA人工骨支架材料的制备方法,并对其结构特征及物理、化学性能进行分析,探索制备DCHA人工骨支架材料的原料的理想配比。2.研究DCHA人工骨支架材料在体外模拟体液条件下降解性能,探讨其作为组织工程材料的可行性。3.对DCHA人工骨支架材料进行细胞毒性试验、溶血反应、热原试验、急性毒性试验、迟发性超敏反应试验,以评价DCHA人工骨支架材料生物安全性,为进一步研究提供实验依据。4.通过体外分离培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)并向成骨方向诱导培养,将成骨诱导的细胞与DCHA人工骨支架材料进行体外复合培养,检测DCHA人工骨支架材料的细胞相容性。5.探索DCHA人工骨支架材料的成骨作用及作为骨替代材料的可行性,期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。研究方法1.将珊瑚羟基磷灰石粉碎成250μm-500μm微粒,然后将其与L-PLA以不同的质量比(2：1、3：1、4：1、5：1)混合均匀后,采用Simpleware 3.1软件,通过CAD构建一数字化的圆柱形模型,通过数控转换,将其生成STL格式的文件,导入快速成型机,采用选择性激光烧结快速成型的工艺,将数字化的模型制备成不同质量比的DCHA人工骨支架材料。采用游标卡尺测量制备的DCHA人工骨支架材料的高度和直径,将其与CAD模型的高度和直径进行对比分析,评价不同质量比制备的DCHA人工骨支架材料的精确度。通过模拟体液浸泡检测不同质量比制备的DCHA人工骨支架材料的亲水率。采用压汞仪、材料力学试验机和扫描电镜等对不同质量比制备的DCHA人工骨支架材料的的理化、结构和力学性能进行对比分析。2.将采用质量比为3：1和4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料试件,分别放置于初始pH值为7.4的50mL模拟体液(stimulated body fluid, SBF)中,在37℃恒温箱中降解,观察各试件的大体形态、颜色及光泽等变化。并分别于2W、4W、8W、12W、16W检测其在模拟体液中的PH值,钙、磷离子浓度变化情况,并检测各试件材料在不同时间点的材料降解率、抗压强度变化。采用扫描电子显微镜观察降解16W时DCHA人工骨支架材料的微观结构变化。3.参照GB/T 16886.1-2001 idt ISO 10993-1：1997和GB/T 16175 -2008,对采用质量比为3：1和4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料试件,进行细胞毒性实验、溶血反应、热原实验、急性毒性实验、迟发性超敏反应实验的生物学评价。3.1细胞毒性实验：采用体外细胞培养技术,观察DCHA人工骨支架材料浸提液对L-929细胞形态的变化,采用MTS法检测对L-929细胞增殖情况的影响,以评价其细胞毒性。3.2溶血反应：检测DCHA人工骨支架材料浸提液的溶血率,评价材料的溶血反应。3.3热原实验：静脉注射DCHA人工骨支架材料浸提液,观察兔体温的变化,评价材料的热原反应。3.4急性毒性实验：静脉注射DCHA人工骨支架材料的浸提液,观察小鼠的毒性反应,评价材料的毒性。3.5迟发性超敏反应实验：皮内注射DCHA人工骨支架材料浸提液,观察豚鼠皮肤反应情况,评价材料的致敏反应。4.细胞相容性评价4.1兔BMSCs的分离培养、成骨诱导及鉴定抽取新西兰白兔的骨髓5mL,通过密度梯度离心法与贴壁细胞分离法相结合的方法获取BMSCs,体外贴壁培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态及生长情况,描绘生长曲线。第3代细胞用含1×10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,0.2mmol/L L-抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置显微镜观察细胞形态变化,采用MTS法测定细胞增殖情况,采用碱性磷酸酶活性测定、Von Kossa钙结节染色和茜素红染色等方法,鉴定其成骨性能。4.2成骨诱导细胞与DCHA人工骨支架材料体外复合培养将兔BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的采用质量比为3：1或4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料试件上复合培养,采用盖玻片作为阴性对照组。通过倒置显微镜、扫描电镜观察成骨诱导细胞在材料中的生长情况。以MTS法检测材料对细胞增殖活性的影响,以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力,评价DCHA人工骨支架材料的细胞相容性。5.构建5mm×15mm胫骨干骺端的腔隙性骨缺损,然后采用以质量比为3：1和4：1的CHA微粒与L-PLA为原料,制备的DCHA人工骨支架材料修复骨缺损,空白对照组骨缺损区不植入任何材料。于术后第2天,第4周、8周、12周行X线摄片,观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行HE染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较各组动物的骨修复情况。结果1.对不同的质量比混合均匀的CHA微粒与左旋聚乳酸混合物,采用CAD和选择性激光快速成型的工艺,可以制备出DCHA人工骨,制备的人工骨支架表面粗糙,呈规整的小圆柱体状,粗细均匀,且随着CHA含量的增加,人工骨支架表面的粗糙度增加,表面的CHA微粒也容易拨脱。本工艺制备的DCHA人工骨支架的加工精度为+0.1cm；制备的不同质量比的DCHA人工骨支架的亲水率为35.00%-53.07%；孔隙率为31.93%～55.36%,密度为1.61g/mm3～2.29g/mm3；抗压强度为1.04MPa-3.70MPa。随着CHA含量的增多,亲水率、孔隙率和密度逐渐增加,抗压强度逐渐降低,各质量间有显著性差异(P<0.01)；制备的数字化人工骨均具备微孔样结构,孔与孔之间纵横交错,孔径为150μm-350μm,随CHA含量的增多,大孔径所占的比例逐渐增多。2.随着体外降解时间的延长,DCHA人工骨支架材料表面粗糙度逐渐增加,有细颗粒样材料溶出,孔隙增大。在16周的降解过程中,pH值略有降低,pH值维持7.34-7.36,同一时间点的pH值均高于L-PLA降解液的pH值(P<0.01),低于HA降解液的pH值(P<0.01)。钙、磷离子浓度随降解时间延长逐渐增高,开始2周内升高较快；第4W、8W、12W、16W时,质量比为3：1的DCHA人工骨支架材料的钙离子浓度高于质量比为4：1的DCHA人工骨支架材料的钙离子浓度(P<0.01),而磷离子浓度无显著性差异(P>0.05)。质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料的降解速度无显著性差异(P>0.05)。随着降解时间的延长,质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料,抗压强度缓慢降低,2周时抗压强度分别为2.89±0.22 MPa和1.62±0.07 MPa；12周时4：1的DCHA人工骨支架材料失去骨支撑的强度,降为0.69±0.08 MPa,而3：1的DCHA人工骨支架材料仍有1.15±0.03 MPa的抗压强度；两种材料在各时间点抗压强度差异非常显著(P<0.01)。3.质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料浸提液的细胞毒性均为0级；溶血率为：2.22%,小于5%,符合生物医学要求；所含热原符合规定；急性毒性程度分级均为0级；致敏反应记分均为0分。4. BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖,条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性,细胞增殖良好,体外矿化结节Von Kossa染色阳性、茜素红染色阳性,证实其有成骨潜能。倒置相差显微镜、扫描电镜观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在质量比为3：1和4：1的DCHA人工骨支架材料上均能够良好地粘附和增殖。ALP活性测定及MTS法测定OD值均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受材料影响,与阴性对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。5.各组动物2周后均能自由活动、正常进食。手术切口无红肿、渗液,均Ⅰ期愈合,无死亡动物,末出现病理性骨折。实验组与及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示,P<0.01,实验组优于空白对照组,两实验组无显著性差异(P>0.05),大体观实验组兔桡骨缺损完全愈合；空白对照组缺损基本无骨修复作用,由纤维组织充填。结论1.本研究将CHA粉碎成250μm-500μm的CHA微粒,然后将其与L-PLA以不同的质量比(2：1、3：1、4：1、5：1)混合均匀后为原料,采用Simpleware3.1软件,CAD构建数字化骨块模型,通过选择性激光烧结快速成形的工艺,可以制备出DCHA人工骨支架材料,其加工精度为+0.1cm,本方法充分利用和保留了珊瑚天然的微孔样结构,避免了制孔的繁琐工艺。2.通过一系列方法对DCHA人工骨支架材料进行表征发现,制备DCHA的原料中CHA微粒与L-PLA理想的质量比为3：1或4：1,采用这种质量比为原料制备的DCHA人工骨支架材料的孔径150μmm-350μm,孔与孔之间相互交通不规则,孔隙率为46.55%～52.65%,亲水率42.66%～46.29%,抗压强度1.82MPa～3.02 MPa。3.在体外模拟体液降解过程中,DCHA人工骨支架材料的pH值,在16周的降解周期内持续维持在7.35左右,16周的降解率为37%左右,介于CHA与L-PLA之间。体外模拟体液降解过程中,支架材料内部的孔径逐渐增大,孔隙逐渐增多,抗压强度逐渐下降,16周时下降为0.32MPa～0.55 MPa,基本还保持有天然松质骨的强度(0.4 MPa～11 MPa)。4.质量比为3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料无毒性、无热原性、不引起溶血反应、不会引起迟发性超敏反应,完全符合GB/T16886.1-2001 idt ISO 10993-1：1997中的标准要求,说明以3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料具有良好的生物学特性,符合作为骨组织工程材料的基本条件。5.质量比为3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料作为人工骨材料具有良好的细胞相容性。6.质量比为3：1或4：1的原料制备的DCHA人工骨支架材料修复兔胫骨干骺端腔隙性骨缺损,显示出良好的骨传导作用和生物相容性；DCHA人工骨支架材料在骨缺损部位可逐步降解并与骨修复相适应,成骨效果好,显示了DCHA人工骨支架材料作为理想人工骨支架材料的诱人前景,有望成为治疗临床骨缺损的一种新材料。
李坚[4]2006年在《高分子纳米材料的研制及用于骨组织工程的初步研究》文中认为修复各种原因(创伤、感染、肿瘤切除、先天性疾病等)引起的骨缺损一直是骨科临床、生物材料学、组织工程学等领域共同关注的难题，而传统的骨修复材料(自体骨、异体骨、生物材料等)均存在不同程度的缺陷，因此，客观上要求人们寻找理想的骨替代物。骨组织工程于20世纪80年代应运而生，其特点是将种子细胞植于细胞支架材料上，形成组织工程化骨后再植入骨缺损部位。其中支架材料是当前骨组织工程研究的热点。理想的骨组织工程支架需具备的条件包括：(1)良好的生物相容性；(2)良好的生物降解性或生物吸收性；(3)支架材料的降解速率应与骨形成能力相适应；(4)良好的多孔结构，平均孔径在200～400μm之间；(5)具有很强的渗透能力；(6)精确的空隙尺寸以适合种子细胞的生长；(7)良好的力学性能为细胞提供适宜的微应力环境；(8)适宜的表面结构以促进细胞的粘附；(9)增强细胞分泌细胞外基质的能力；(10)可充当信号分子如生长因子的载体。现有支架材料包括天然和人工合成两大类，研究较多的有胶原(collagen)、聚乳酸(polylatic acid, PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate, PMMA)、羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)、磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)、珊瑚(coral)等。其中合成高分子具有性能可控、无免疫排斥反应以及生物相容性好等优点，PLA、PGA以及PLGA是目前应用最广的几种可降解性材料，其不足之处在于：机械强度不足，降解产物呈酸性不利于骨细胞生长，降解速度与成骨速度欠协调，残留的有机溶剂有毒等。针对当前骨组织工程支架材料存在的缺点，本研究在收集分析大量文献的基础上，选择赖氨酸盐合成赖氨酸二异氰酸酯，再将后者与甘油聚合得到赖氨酸二异氰酸酯-甘油共聚物，应用超临界抗溶剂结晶技术(SAS)、超声分散等手段将高分子材料纯化、纳米化，并用溶剂浇铸／颗粒滤沥法(SC／PL)获得具有一定孔径和孔隙率的高分子支架材料。本课题重点研究高分子材料的制备工艺、理化特性、降解特性和生物相容性，并将高分子材料与纳米羟基磷灰石(HA)制得仿生复合材料修复动物骨缺损。本研究的实验内容分为5个部分进行：一高分子纳米材料的制备及表征1本实验以赖氨酸盐、二(三氯甲基)碳酸酯为原料，改进传统工艺合成赖氨酸二异氰酸酯(LDI)，然后以赖氨酸二异氰酸酯与甘油聚合获得高分子材料。2通过超声分散、乳化／溶剂扩散法和超临界抗溶剂结晶技术(SAS)等手段分别制备出液相和固相的高分子微粒。通过电镜观察，液相高分子纳米粒尺寸为80.0～200.0 nm(平均为140.0±56.3 nm)，分布比较均匀。SAS制备的固相纳米晶须尺寸为100.0～350.0 nm(平均为156.0±67.5 nm)晶须相互交织形成孔径为100.0～400.0μm(平均为276.0±87.2μm)的孔隙，孔隙率为75.6％。3通过一系列方法对高分子材料进行表征，测得聚合物的玻璃化温度(T_g)为88.6℃，接触角为67.3°，初始压缩强度为4.26±0.78 Mpa、抗断裂强度为11.63±2.30 Mpa。证实该高分子材料具有作为组织工程支架材料所需要的物理特性。4制备高分子纳米粒的全过程均采用无毒原料和无毒工艺，有机溶剂基本去除，获得的高分子材料纯净、无毒，符合“绿色化学”的观点。二高分子纳米材料的体外降解研究1通过检测pH值、亲水性、重量、机械强度变化及降解产物探讨赖氨酸二异氰酸酯-甘油聚合物(LDIG)在体外的降解规律，证实本材料是一种理想、无毒、可生物降解的高分子材料。2 LDIG的重量在头6周内变化小，6周后下降加快，10周约保留初始重量的一半，即材料的重量丧失具有先慢后快的特点。3 LDIG浸泡液的pH值在12周的降解过程中十分恒定，12周时溶液的pH值为7.35。因此，LDIG聚合物的降解行为不会影响介质的pH值。4 LDIG于6周内压缩强度衰减较慢，6周后稍快，8周时强度衰减至初始强度的一半，可见机械强度与重量、亲水性随着材料降解而出现相应的衰减。5 LDIG材料的体外降解属于聚氨酯的酯键水解作用，其降解产物是无毒小分子物质：赖氨酸、甘油、乙醇和CO_2。三高分子纳米材料的生物学评价1根据国家卫生部《生物材料和医疗器材生物学评价的技术要求》的相关规定，对高分子纳米材料(n-LDIG)进行急性毒性实验、溶血反应、热原实验和肌肉内植入实验，结果表明，该材料无毒性，无热原性、不引起溶血反应，植入后局部组织反应小，完全符合文件中的标准要求。2高分子纳米材料(n-LDIG)具有良好的生物学特性，符合作为骨组织工程材料的基本条件。四纳米羟基磷灰石／高分子(n-HA／n-LDIG)复合型骨修复材料的构建及表征1 n-HA／n-LDIG复合生物材料在化学组成上与人自然骨相近，其力学性能与人自然骨力学性能接近，具有较好的力学相容性。HA纳米晶体对LDIG有增强作用。2复合材料的生物相容性及力学性能与两相间的界面有关。n-HA晶体与LDIG分子链间有化学键合、氢键连接及电荷吸引作用，具有较强的结合力。3 n-HA加入到n-LDIG基体中除增加n-HA／n-LDIG复合材料的弯曲模量外，其它力学性能略有下降。小粒径HA对提高复合材料的弯曲强度、剪切强度有利。五高分子纳米骨修复材料(n-HA／n-LDIG)修复家兔腿骨缺损的研究1通过热致相分离(TIPS)和乳液共混获得高分子纳米骨修复材料(n-HA／n-LDIG)，并成功修复家兔腿骨缺损，证明两者复合后，能发挥良好的修复重建作用。2高分子纳米骨修复材料(n-HA／n-LDIG)在骨缺损部位可逐步降解并与骨修复相适应。3骨缺损修复实验表明，高分子纳米骨修复材料(n-HA／n-LDIG)具有良好的生物相容性和骨传导性，成骨作用明显，可有效修复长骨穿通性缺损。
朱辉[5]2012年在《数字化载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的制备及生物学研究》文中研究指明研究背景在世界范围内,由于创伤,肿瘤和感染等原因造成的骨缺损每年都在折磨着众多的患者,需要进行植骨移植。然而,临床上对于大面积污染性骨缺损的治疗使用常规的植骨材料有可能因继发感染而致骨移植失败。且临床上细菌耐药性的问题日益严重,植骨材料加载抗生素的作用越来越局限化,从而对抗菌剂提出了更高的要求。近年来,无机抗菌材料以其有效的抗菌性、较高的安全性和稳定性引起了广泛关注。无机抗菌剂与有机天然抗菌剂相比,具有抗菌谱广、长效持久、不产生耐药性、无毒副作用等优点。Ag+的抗菌性能是金属离子中最强的,亦是应用最早、最成熟的无机抗菌剂。长期以来,研制具有抗菌功能的生物材料替代自体骨修复骨缺损一直是医学和材料学领域的重要课题。而骨组织工程为骨缺损,特别是复杂结构的骨缺损的修复带来了新的期盼。骨组织工程包括三个关键因素：信号分子(骨生长因子、骨诱导因子)、支架材料和靶细胞。其中支架材料的选择是骨组织工程的核心问题。目前的支架材料主要有天然的支架材料、人工合成的支架材料以及复合材料。珊瑚羟基磷灰石(CHA)是由天然珊瑚通过“水热反应”转变而来的羟基磷灰石,保留了天然珊瑚的多孔结构,生物相容性好,具有较大的孔径、较高的孔隙率和孔隙交通率。大量的文献表明珊瑚类人工骨为一类较为理想的骨替代材料,并因为它的良好组织相容性和三维多孔结构,也被认为是有前途的组织工程支架材料和载体。但CHA人工骨脆性较大,无法根据骨缺损的形状个性化地制备出人工骨支架,存在一定不足。左旋-聚乳酸(L-polylactic acid, L-PLA)是一种已在医学上广泛应用的有机高分子材料,作为人体的植入物已经通过美国食品药品管理局的认证,并已被广泛用于内固定装置例如骨板、骨钉、手术缝合线等。其优点是可降解性,良好的细胞相容性,容易塑形。然而,单一类型材料(天然支架或人工合成支架)一般难以满足骨组织工程用于细胞外支架材料的要求。天然材料具有生物相容性好、细胞识别信号、利于细胞黏附增殖；人工材料虽然缺乏细胞信号,但具有天然材料所不足的可以大规模生产、可以设计和控制结构、机械性能和降解时间等优点。通过一定的方法将由几种不同材料相结合形成,或者由生物材料与生长因了复合而成,复合材料在性能上互相取长补短,在实际应用中已经取得了良好效果。天然生物衍生材料、高分子材料、陶瓷材料既可以作为复合材料的基材,又可作为其增强体和填料,他们互相搭配和组合形成大量性质各异的复合材料。快速成形技术(Rapid Prototyping Technology, RPT)是种基于离散堆积成型思想的新型成形技术,可快速、高精度地从CT数据完成快速成形生物模型的制造。它自20世纪80年代产生以来得到了迅速的发展,是制造技术领域出现的一次重大突破,其对制造业的影响完全可以与数控技术相媲美。近年来,已广泛应用于医学领域,可以制造任意复杂形状的三维实体模型,为骨组织工程支架的个性化制造提供了可能。如果能够利用快速成形技术,在保留珊瑚羟基磷灰石的天然微孔样结构的基础上,载入银离子,根据骨缺损的形态,个性化地制备出具有抗菌性人工骨支架修复材料,这将极大地促进抗菌性骨组织工程支架的发展。本研究将珊瑚羟基磷灰石(CHA),通过溶液离子交换法,成功载入银离子,制备出不同含银量的载银羟基磷灰石抗菌粉末,与聚乳酸(PLA)混合后,通过选择性激光烧结快速成形制备出具有特殊形状的数字化载银抗菌人工骨(CHA-Ag)支架材料。通过系列实验,研究CHA/PLA-Ag人工骨支架材料的理化学特性、抗菌性、生物相容性,通过修复动物大段污染性骨缺损模型,探讨其应用于感染性骨缺损的可行性。研究目的1、研究载银数字化珊瑚羟基磷灰石／聚乳酸人工骨的制备及性能表征。2、研究载银数字化珊瑚羟基磷灰石／聚乳酸人工骨的细胞相容性。3、研究载银数字化珊瑚羟基磷灰石／聚乳酸人工骨体外抑菌性。4、研究载银数字化珊瑚羟基磷灰石／聚乳酸人工骨载银量及体外释放速率。5、探讨载银数字化珊瑚羟基磷灰石／聚乳酸人工骨的组织相容性与修复大段污染性骨缺损的动物实验。研究方法1.将珊瑚羟基磷灰石,经球磨机球磨后成细颗粒粉末状,过目筛后取颗粒大小为140-200μ m,分别放在含有10-2、10-3、10-4、10-5mmol/LAgNO3溶液避光浸泡,制备出含不同质量银的载银羟基磷灰石粉末,然后将其与L-PLA以3：1质量比混均后,采用Simpleware3.1软件,通过CAD构建一数字化的圆柱形模型,通过数控转换,将其生成STL格式的文件,导入快速成型机中,采用选择性激光烧结快速成型的工艺,将数字化的模型制备成制备出含不同质量银的载银羟基磷灰石人工骨支架材料(CHA/PLA-Ag)。采用扫描电镜、红外光谱仪、X射线衍射仪对数字化载银羟基磷灰石抗菌人工骨进行理化、结构分析。2.体外抗菌性能实验2.1抑菌圈实验：复苏金黄色葡萄球菌ATCC25923及大肠杆菌ATCC25922,接种于含LB液体培养基试管中,于37℃恒温摇床中培养1d备用。取浸泡10-2、10-3、10-4、10-5mmol/LAgNO3所制备的5种珊瑚羟基磷灰石人工骨圆柱状材料各1粒,分别置于接种有金黄色葡萄球菌(接种量为1.5×107CFU)及大肠杆菌(接种量为1.5×107CFU)的90mm的LB琼脂培养基中,青霉素液滴作为阳性对照组；于37℃恒温培养箱中培养24小时,测量抑菌圈,记录抑菌圈大小。每个菌株重复6次。2.2菌落计数实验：将金黄色葡萄球菌及大肠杆菌配制成浓度为3×108CFU/mL的细菌悬液。取100μ L细菌悬液分别滴于载银及未载银珊瑚羟基磷灰石人工骨材料表面,于37℃恒温培养箱中培养24小时。将材料置于5mL PBS液中,在漩涡振荡仪上振荡5min,洗脱细菌。取100μ L洗脱液用PBS稀释至适当浓度,推平板,于37℃恒温培养箱中培养3d后计平板菌落数及计算抗菌率。每个菌种实验重复6次。3.参照GB/T16886.1-2001idt ISO10993-1:1997和GB/T16175-2008,对载银羟基磷灰石人工骨支架材料,进行细胞毒性实验、溶血反应、急性毒性实验、迟发性超敏反应实验的生物学评价。3.1细胞毒性实验：采用体外细胞培养技术,观察载银羟基磷灰石人工骨支架材料浸提液对L-929细胞形态的变化,采用MTT法检测对L-929细胞增殖情况的影响,以评价其细胞毒性。3.2溶血反应：检测载银羟基磷灰石人工骨支架材料浸提液的对新西兰大白兔溶血率,评价材料的溶血反应。3.3急性毒性实验：小鼠腹腔注射载银羟基磷灰石人工骨支架材料的浸提液,观察小鼠的毒性反应,评价材料的毒性。3.4迟发性超敏反应实验：豚鼠皮内注射载银羟基磷灰石人工骨支架材料浸提液,观察豚鼠皮肤过敏反应情况,评价材料的致敏反应。4.将不同质量银的载银羟基磷灰石人工骨支架材料,采用原子吸收光谱仪对材料进行Ag+含量分析。将10q组载银羟基磷灰石人工骨支架材料分别放置于初始pH值为7.4的15mL模拟体液(stimulated body fluid, SBF)中,在37℃恒温箱中降解,并分别于1d、4d、7d、14d、21d、28d、49d检测其在模拟体液中的银离了释放量和速度。5.于新西兰大白兔胫骨干骺端构建5mm×15mm的污染性腔隙性骨缺损,实验组植入10-3mmol/L AgNO3载银羟基磷灰石人工骨支架材料修复骨缺损,对照组骨缺损区植入未载银的羟基磷灰石／聚乳酸人工骨支架材料,空白对照组骨缺损区不植入任何材料。于术后第1天,第4周、8周、12周行X线摄片,观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组胫骨缺损的骨修复程度评分,标本行HE染色组织学观察以了解骨修复情况。结果1.采用珊瑚羟基磷灰石(CHA)粉末浸泡不同浓度的硝酸银溶液,通过溶液离子交换法,制备出不同含银量的载银羟基磷灰石,再将不同的载银CHA粉末与左旋聚乳酸(L-PLA)按3：1质量比混均,并通过CAD和选择性激光烧结快速成形技术,可以成功制备出具有特殊形状的数字化载银抗菌人工骨支架材料。数字化CHA-Ag人工骨制备后为灰白色,其中浸泡10-2mol/L AgNO3载银珊瑚羟基磷灰石人工骨为棕黑色,其粉末制备成型前仍为灰白色,考虑为其载银量相对较高,制备成型时银离子经激光束强光照射后与氧结合成氧化银所致。制备的人工骨支架表面粗糙,呈规整的小圆柱体状,粗细均匀,可见微孔结构。各组材料的抗压强度均大于1Mpa。2.体外抗菌实验。抑菌圈实验：浸泡10-4mmol/AgNO3、10-5mmol/L AgNO3浓度硝酸银所制备的数字化CHA-Ag人工骨材料在整个实验过程中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无抑菌圈产生。浸泡10-2mmol/L AgNO3、10-3mmol/L AgNO3浓度硝酸银所制备的数字化CHA-Ag人工骨材料24h对2种细菌均产生抑菌圈,其中浸泡10-2mmol/L AgNO3载银人工骨材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为(13.00±0.71)mm及(12.30±0.71)mm,浸泡10-33mmol/LAgNO3载银人工骨材料分别平均为(11.51±0.09)mm及(11.00±0.15)mm。金黄色葡萄球菌各材料间以及与青霉素对照组比较,单因素方差分析统计结果显示各组方差不齐(F=5.149,P=0.020),组间差异有显著性统计学意义(F=95370.727,P=0.000),两两比较均有显著性统计学意义(P=0.000)。大肠杆菌各材料间以及与青霉素对照组比较,单因素方差分析统计结果显示各组方差齐性(F=1.585,P=0.237),组间差异有显著性统计学意义(F=2692.000,P=0.000),两两比较均有显著性统计学意义(P=0.000)。菌落数实验：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与浸泡10-2mmol/L AgNO3载银CHA-Ag人工骨材料接触后无生长繁殖,抗菌率为100%；与浸泡10-3、10-4、10-5mmol/L AgNO3载银CHA-Ag人工骨材料接触后生长减缓,表明有抗菌作用,对金黄色葡萄球菌抗菌率分别为99.99±0.00%、49.42±0.28%及22.18±0.26%；对大肠杆菌抗菌率分别为99.99±0.00%、44.66±0.44%及21.09±0.32%。金黄色葡萄球菌各材料间比较,单因素方差分析统计结果显示各组方差不齐(F=6.154,P=0.004),组间差异有显著性统计学意义(F=2E+007,P=0.000),两两比较均有显著性统计学意义(P=0.000)。大肠杆菌各材料间比较,单因素方差分析统计结果显示各组方差不齐(F=15.792,P=0.000),组间差异有显著性统计学意义(F=1E+007,P=0.000),两两比较均有显著性统计学意义(P=0.000)。3.100%浸泡10-2mol/L AgNO3的CHA-Ag人工骨浸提液作用于L929细胞2、4、7d,大部分细胞死亡,呈圆形,生长欠佳,对细胞有毒性,毒性分级为3级；而10-3、10-4、10-5mmol/L AgNO3的CHA-Ag人工骨浸提液作用于L929细胞2、4、7d后,细胞生长旺盛,倒置显微镜下观察,细胞膜完整,细胞呈典形的梭形,贴壁良好,毒性分级分别为1级、0级、0级。实验结果表明10-mmol/LAgNO3的CHA-Ag人工骨材料浸提液的细胞毒性均为0级；溶血率为：2.22%,小于5%,符合生物医学要求；急性毒性程度分级均为0级；致敏反应记分均为0分。表明10-3mmol/L AgNO3的CHA-Ag人工骨材料符合生物材料医用标准。4.10-2、10-4、10-4、10-5组Ag+含量分别为2310.520±33.418、318.692±1.763、67.535±0.191及6.050±0.028μ g/g,单因素方差分析统计结果显示各组方差不齐(F=9.005,P=0.001),组间差异有显著性统计学意义(F=25847.567,P=0.000),两两比较均有显著性统计学意义(P=0.000)。10-3材料在体外SBF中Ag+呈缓慢释放趋势,在最初浸泡7d内释放速度较快,之后释放速度逐渐减慢。5.各组实验动物术后进食基本正常,2周后均能自由活动。其中10-3CHA/PLA-Ag组术口无明显红肿,无裂开,无渗液流脓,愈合良好；CHA/PLA组术口愈合差,裂开,术口红肿渗液流脓,取分泌物行细菌培养,为金黄色葡萄球菌,术后2周术口软组织肿胀减轻,逐渐愈合；空白对照组术口度红肿,无明显渗液流脓,1周后术口愈合良好。术后3月未出现动物死亡,未出现病理性骨折。大体观实验组及CHA/PLA组兔胫骨缺损完全愈合；空白对照组缺损基本无骨修复作用,由纤维组织充填。实验组、CHA/PLA组及空白对照组的放射学检查评分同一时间点比较,单因素方差分析统计结果显示各组方差齐性(P>0.05),组间差异有显著性统计学意义(P<0.05),其中实验组、CHA/PLA组各时间点评分差别无显著性统计学意义(P>0.05),说明实验组、CHA/PLA组的骨修复作用无显著差异,而实验组、CHA/PLA组与空白对照组各时间点评分差异有显著性统计学意义(R<0.05),实验组、CHA/PLA两组均高于空白对照组的评分,说明实验组、CHA/PLA组有明显的骨修复作用。结论1.本研究采用珊瑚羟基磷灰石(CHA)粉末浸泡不同浓度的硝酸银溶液,通过溶液离子交换法,制备出不同含银量的载银羟基磷灰石,再将不同的载银CHA粉末与左旋聚乳酸(L-PLA)按3：1质量比混均,并通过CAD和选择性激光烧结快速成形技术,成功制备出具有特殊形状的数字化载银抗菌人工骨支架材料,其工艺简便易行。并通过一系列方法对数字化载银的珊瑚羟基磷灰石/聚乳酸人工骨支架材料进行表征发现,本方法充分利用和保留了珊瑚天然的微孔样结构,各组材料的抗压强度均大于1Mpa。2.载银CHA/PLA-Ag人工骨材料体外抗菌实验表明,其对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均有抗菌作用,其中浸泡10-4、10-5mmo/L AgNO3载银CHA-Ag人工骨材料体外对上述2种细菌抑菌圈实验为阴性,菌落数实验表明其抗菌率均低于90%,不符合医用抗菌材料标准。而浸泡10-2、10-3mol/L AgNO3的载银人工骨材料体外对上述2种细菌产生明显的抑菌圈,菌落数实验表明其抗菌作用明显,抗菌率均大于90%,具有良好的抗菌性能,符合医用抗菌材料标准。3.载银人工骨支架材料体外生物学试验表明浸泡10-2mmol/L AgNO3所制备的CHA/PLA-Ag人工骨材料浸提液有细胞毒性,不符合生物材料医用标准。而10-3、10-4、10-5mol/L AgNO3的CHA/PLA-Ag人工骨浸提液对细胞毒性分级分别为1级、0级、0级。表明材料随着载银量增高,对细胞毒性越大。10-1、10-1、10-5mol/L AgNO3的CHA/PLA-Ag人工骨材料符合生物材料医用标准,其中10-3mmol/L AgNO3载银人工骨支架材料无溶血反应、无全身毒性及致敏性,具有良好的生物相容性。4.载银CHA-Ag人工骨材料的载银量及释放实验表明人工骨材料的载银量随着溶液中银离子浓度的增加而增加,支架材料中银离子能保持长时间的缓释特性,从而能有效地避免银离子早期大量释放,保持长时间的持续缓慢释放,有效地减少银离子对组织细胞的毒性作用。5.在修复兔胫骨干骺端污染性腔隙性骨缺损模型中,10-3mmol/L AgN3,所制备的载银人工骨支架材料具有良好地抑制骨感染及修复骨缺损效果,表明羟基磷灰石人工骨载银后与左旋聚乳酸复合后具有良好的抗菌性、生物相容性和骨传导作用,未明显影响成骨作用,是一种具有良好应用前景的新型抗菌性骨修复替代材料。
王根林[6]2008年在《可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其在SD大鼠体内降解的实验观察【目的】制备丝素蛋白/羟基磷灰石(silk fibroin/hydroxyapatite,SF/HA)复合人工骨材料,并将该材料植入生物体内降解,以了解SF/HA在动物体内的降解速率及机体对SF/HA的组织学反应,为后续成骨实验提供可靠的参考数据。【方法】以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板,以家蚕丝素短纤维为增强材料,以NaCl为致孔剂,采用等静压的方法制备4种SF/HA复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组,测定4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石在0.5h、2h、6h、12h及24h不同时间点的吸水率。将4种SF/HA复合材料及羟基磷灰石植入SD大鼠背部皮下,进行体内降解观察。实验组分别于术后2、6、12、16、20及24周取材,对照组分别于术后2、12及24周取材,进行大体观察及组织学检查。【结果】丝素蛋白、HA、添加剂及致孔剂配比不同,制备的4种SF/HA人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下:SF/HA_3、SF/HA_4>SF/HA_2、SF/HA_1 >HA。HA、SF/HA_1及SF/HA_2降解十分缓慢或基本不能降解;SF/HA_3 20～24周降解完毕;SF/HA_4 12～16周降解完毕;各种材料周围组织未见明显变性坏死等。【结论】SF/HA_1平均孔径为6.5μm,最大孔径也只有15μm,不适合骨组织工程支架材料的要求。SF/HA_4虽然孔径、孔隙率满足要求,但力学强度较低,压缩强度只有1.59MPa,在水中很快散开,也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中,我们剔除这两种材料,将对SF/HA_3及SF/HA_2两种材料进行体外细胞相容性研究。第二部分兔骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究【目的】体外分离培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),并向成骨方向诱导培养,为SF/HA相容性提供检测细胞及为SF/HA组织工程化骨提供适宜的种子细胞。【方法】抽取新西兰白兔的骨髓5ml,通过密度梯度离心法获取BMSCs,体外贴壁培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况,描绘生长曲线。第2代细胞用含1×10~(-8)g/l地塞米松、10mmol/lβ-甘油磷酸钠及50μg/l L-抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;采用MTT法测定细胞增殖情况;使用碱性磷酸酶染色及Von Kossa钙结节染色等方法,鉴定其成骨性能。【结果】BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖,条件培养液诱导后表现出明显的成骨活性,细胞增殖良好,体外矿化结节Von Kossa染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性,证实其有成骨潜能。【结论】可以通过体外分离纯化兔BMSCs,在一定条件下能够向成骨方向诱导分化,并能使细胞保持较高的成骨活性,适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。第三部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究【目的】以成骨诱导的BMSCs作为检测细胞,与两种丝素蛋白/羟基磷灰石(SF/HA)进行体外复合培养,检测SF/HA的细胞相容性。【方法】将兔BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的SF/HA_2及SF/HA_3材料上复合培养,以单纯BMSCs相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及HE染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以MTT法检测材料对细胞增殖活性的影响,以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力,以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。【结果】扫描电镜及组织学观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在SF/HA_2及SF/HA_3上能够良好地粘附和增殖。ALP活性测定及MTT法测定OD值均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受材料影响,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。材料浸提液细胞毒性试验显示,细胞毒性分级均为0～Ⅰ级,两种SF/HA浸提液对细胞生长基本无毒性作用。【结论】SF/HA_2与SF/HA_3对BMSCs的生长和成骨功能无影响,具有良好的细胞相容性,具有构建组织工程化骨的可行性。第四部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石异位成骨及其组织相容性的实验研究【目的】探讨SF/HA_2及SF/HA_3体内异位成骨的能力,并通过肌肉植入实验进一步观察两种材料的组织相容性,为SF/HA修复节段性骨缺损提供实验依据。【方法】将体外诱导培养的兔骨髓基质细胞,以5×10~7/ml的密度接种到SF/HA_2,作为实验组1;接种到SF/HA3,作为实验组2,并于3～5d后植入兔背部肌肉中。植入单纯SF/HA_2与SF/HA_3,作为对照组。对照组亦作为材料的肌肉植入实验模型,观察组织相容性。于术后第4、8、12周,每次随机选取5只兔处死后取材,大体观察及HE染色组织学观察,并进行骨组织形态计量学分析,定量比较各组新骨形成情况。【结果】实验组术后4、8、12周均有新骨形成,随着时间延长,新骨生成量增多;骨组织形态计量学分析显示,实验组1优于实验组2(P<0.05);对照组则均无新骨形成。肌肉植入实验未见肌肉变性坏死等。【结论】肌肉植入实验、第一部分的皮下植入实验及第三部分的细胞相容性研究均显示,两种SF/HA具有良好的组织相容性。SF/HA_3与SF/HA_2复合细胞后构建的组织工程化骨,具有良好的异位成骨能力,可望应用于临床修复骨缺损。但从生物降解性及异位成骨的效果看,SF/HA_3更适合于作为人工骨材料,将进一步研究该材料修复节段性骨缺损的能力。第五部分可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究【目的】探索SF/HA_3组织工程化骨的成骨作用及作为骨替代材料的可行性,期望为临床治疗骨缺损提供新的人工骨材料。【方法】在本实验中将SF/HA_3更名为SF/HA,与诱导的兔BMSCs复合,构建组织工程化骨。麻醉生效后,充分显露兔左侧桡骨中上段,造成15mm节段骨缺损。实验组植入SF/HA+BMSCs复合物,实验对照组植入SF/HA材料,空白对照组骨缺损区不植入任何材料。于术后第4、8、12及16周行X线摄片及16周时行螺旋CT扫描重建,观察骨缺损修复及骨塑形情况。参照Lane-Sandhu X线评分标准对各组桡骨缺损的骨修复程度评分。标本行HE染色及Masson染色组织学观察,按照Lane-Sandhu组织学评分法比较12周及16周时各组动物的骨修复情况。【结果】实验组、实验对照组及空白对照组的放射学及组织学检查评分显示,新骨生成有统计学差异(P<0.05),实验组优于实验对照组优于空白对照组;大体观察及放射学检查证实:实验组兔桡骨缺损完全愈合;实验组对照组缺损处少部分骨愈合;空白对照组缺损基本无骨修复作用,由纤维组织充填。【结论】SF/HA与BMSCs复合,降解速率适宜,能较快被骨组织取代,具有相当于自体骨的骨缺损修复能力,基本达到现代骨组织工程学的要求。但材料本身缺乏骨诱导作用,单独用于节段性骨缺损修复作用有限。
姜红江[7]2008年在《陶瓷化骨的改性及生物活性人工骨构建的研究》文中进行了进一步梳理骨缺损的修复一直是临床的难题,组织工程学的发展,为骨缺损的修复开辟了新的途径。组织工程学是应用细胞生物学和工程学的原理,对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴科学。骨种子细胞的来源、支架材料及细胞与支架材料的体外构建是其基本研究环节,也是骨组织工程临床应用亟需解决的问题。为此,本文开展了成人骨髓基质细胞的体外培养及成骨研究,并对天然陶瓷化骨进行表面涂层,与骨髓基质细胞体外构建,开展了骨组织工程的相关研究。骨髓来源的成骨细胞具有取材方便,对机体损伤小,便于自体移植等优点,具有广阔的应用前景;但骨髓基质细胞具有多向分化性,其成骨转化的条件尚待进一步完善,且与适宜载体结合的生长及成骨能力亦需进一步研究。本实验以成人骨髓基质细胞为研究对象,采用含地塞米松10-8mol/L和丹参0.05mg/ml的条件培养液联合培养。结果表明,丹参可消除地塞米松对骨髓基质细胞的抑制作用,二者联合培养可明显提高骨髓基质细胞的成骨转化率。不同成人骨髓来源的成骨细胞有较强的成骨特性,采用含维生素C50μg/ml、β-甘油磷酸钠10mmol/L的条件培养液培养,体外能形成钙化的骨样组织。陶瓷化骨具有原骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统,保留了原有自然骨的连续多孔结构,有一定的强度,能够起支撑作用,解决了化学合成人工骨的孔隙率、孔隙连通及孔径大小等方面的制作难题,使煅烧骨具有良好的骨传导性,是较为理想的骨组织工程支架材料。但是,陶瓷化骨不具有骨诱导性。采用载药自固化磷酸钙表面涂层,使陶瓷化骨具备了骨诱导性。与骨髓基质细胞体外联合培养发现,细胞在改性陶瓷化骨均获得良好生长;上述细胞载体复合物自体异位植入体内,细胞载体复合物有新骨形成。通过表面改性,天然陶瓷化骨进一步满足了骨组织工程支架材料的要求,可作为骨组织工程学中的细胞载体。与自体骨髓来源的成骨种子细胞构建生物活性骨,是理想的骨修复材料。
张宇[8]2010年在《抗菌性骨缺损修复材料的理化与生物学性能实验研究》文中研究指明最为理想的生物材料就是机体自身的组织,天然生物材料经过亿万年的演变进化,形成具有结构复杂精巧、效能奇妙多彩的功能原理和作用机制。新鲜自体骨是由无机材料和有机材料巧妙地结合在一起形成的复合体,其中无机材料的大部分是羟基磷灰石结晶,具有较高的骨诱导性,无免疫排斥反应,但是会增加手术创伤,并且病人还会出现局部疼痛、感觉异常或过敏等并发症,骨的来源也十分有限。近年来,利用组织工程化骨修复骨缺损,不仅提供了一种修复骨缺损的方法,而且也提供了一种全新思路,骨组织工程学的研究为治疗骨缺损带来了新的希望。目前,体外构建的组织工程化人工骨虽然还停留在实验室及动物实验阶段,但随着细胞生物学、工程学、免疫学、材料学等相关学科的发展,骨组织工程学的研究也将会取得突破性进展,在工业化生产和临床应用上有着极其广阔的应用前景,它将会成为21世纪极具发展潜力的高新技术产业,蕴藏着巨大的经济与社会效益。作为人类骨组织的主要无机成分,羟基磷灰石生物陶瓷价廉易得,具有良好的生物相容性,可降解又具备骨引导、骨融合性,尤其是含孔的珊瑚羟基磷灰石可提供很大的表面积/体积比,能保证细胞的增殖、分化和高代谢活动,所以特别适合用于骨组织工程。随着现代工业化机械化程度的提高,由于创伤、感染、肿瘤、事故、战争、地震等所致的大量污染性骨缺损发生率大幅度升高。对其传统治疗方法,即先清创、待伤口关闭、无感染迹象3-6个月后、再行二期植骨修复；而一期植骨常因发生较高的感染率而被视为禁忌,且临床上细菌耐药性的问题日益严重,植骨材料加载抗生素的作用越来越局限化,对抗菌剂提出了更高的要求。为解决传统治疗方法所带来的增加治疗时间、难度、患者的痛苦和经济负担等一系列问题,改变传统观念,近年来,国内外学者在抗菌骨移植材料的基础实验和临床实践方面进行了大量的研究,取得了一定的进展。为此,我们研制一种抗菌性骨支架修复材料,并经以下系列实验研究证明：这一抗菌性骨修复材料具有良好的生物相容性,可在局部缓释银离子,有效地抑制污染性骨缺损清创术后局部残留的细菌。实验分四个部分进行观察研究：课题研究第一部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的制备及性能表征。目的：制备载银珊瑚羟基磷灰石人工骨并观察其理化性能表征。方法：实验于2008-05/08在清华大学材料科学与工程系实验室完成。实验材料：在加工好的珊瑚羟基磷灰石(Coral Hydroxyapatite, CHA)颗粒与相应浓度硝酸银(Silver nitrate, AgNO3)溶液浸泡一定时间后置入冻干机冻干制得载银珊瑚羟基磷灰石(Silver-loaded Coral Hydroxyapatite, SLCHA或Ag+-CHA)。应用X射线衍射法对Ag+-CHA、CHA和纯珊瑚样品晶体的物相、结构和位相进行分析；应用FT-IR光谱法对样品的材料组成进行分析；应用扫描电镜观察材料的显微形貌和孔径；利用压缩试验及三点弯曲试验评价骨修复支架材料的机械性能。应用SPSS13.0软件对机械性能测试结果行单向方差分析及LSD法两两比较(a=0.05)。结果：①X射线衍射法对Ag+-CHA、CHA和纯珊瑚三种材料晶体进行物相分析、结构分析和位相分析,图形显示Ag+-CHA样品的衍射峰与CHA的图谱基本相符,而且XRD图中无其他相的衍射峰,说明银离子与CHA发生反应后产物比较单一,无其他衍生物生成,仍然保持原有的晶形结构；同时晶面位于(211),(300)的峰值较CHA低,说明银离子可能与此晶面位置的HA发生反应。②FT-IR光谱法图中显示三者具有一定的相似性,1456 cm-1和1413cm-1是材料中C032-基团的特征峰位,与纯珊瑚基本一致,说明Ag+-CHA和CHA材料本身大部分为CaCO3成分。1031 cm-1、604 cm-1和563cm-1为HA的特征峰,即显示出P04-3离子根的振动峰,说明Ag+-CHA和CHA中已存在一部分HA。这些HA特征波峰变宽,对FT-IR光谱进行分析,Ag+-CHA的曲线的变化可能与Ag+与CHA的Ca2+之间存在离子键变换、Ag+的离子半径大于Ca2+有关。③扫描电镜、能谱分析及背散射电镜可见载银珊瑚羟基磷灰石样品仍维持着珊瑚本身的三维多孔结构,载银材料表面存在有钙、碳、银、磷和氧等多种元素,且载银材料表面沉淀物的银含量与制备过程中硝酸银的浓度成正比关系；④采用压缩试验法分析这三种材料间的压缩强度无显著性差异(F=3.147,P=0.196)；三种材料间的压缩模量无显著性差异(F=0.827,P=0.482)；及采用三点弯曲试验法分析三种材料间的三点弯曲折断功无显著性差异(F=2.543,P=0.159)。结论：珊瑚羟基磷灰石经载银后未改变其理化性能,依然维持着三维多孔框架结构；制备原理主要为钙银离子之间的置换反应,其次为银离子的溶出-沉积反应,并且随着制备过程中硝酸银溶液浓度的递增,Ag+-CHA的载银量也随之递增。课题研究第二部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的载银量及体外缓释实验研究目的：研制载银珊瑚羟基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,通过对其自身载银量及体外缓释实验完善对该抗菌性磷灰石类复合人工骨的认识。方法：应用电感耦合等离子体发射光谱(inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP-OES)测定载银材料中银的平均含量,并在模拟体液(Stimulated body fluid, SBF, pH=7.25)中通过体外释放试验测定银离子释放浓度与时间的变化曲线,探讨材料结构与释放银的关联性。实验数据应用SPSS13.0统计软件处理,用相关回归分析和曲线拟合载银量与AgNO3浓度关系曲线,建立回归方程。结果：根据实验结果绘制的载银量-AgNO3浓度关系曲线。经统计学分析拟合出载银量-AgNO3浓度曲线方程为：y=3E+007x2+126863.3x+12.845(R SquareChange=0.997),对方程进行回归检验,F=959.625,P=-0.000,有统计学意义。载银羟基磷灰石颗粒3个试样中银离子均能从颗粒向模拟体液中扩散,具有明显缓释作用。第1个24小时释放量最大,达到885.27±122.49μg/L,低于文献中报道的银离子最低抑菌浓度(MIC) 1.25μg/mL.,达到减毒增效的效果。以后逐渐减少,7-14天维持一平台期释放,其后以较低浓度维持,第28天仍有79.80±6.69μg/L的银离子释放量。结论：载银珊瑚羟基磷灰石之所以能保持长时间的银离子释放,与羟基磷灰石本身的空间晶格结构关系密切,这种可逆的离子置换过程使其释放性能更显著,能更有效地避免银离子突释,保持长时间的持续释放,有效地减少金属银的使用量,达到减毒增效的作用。课题研究第三部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的细胞相容性研究目的：研制载银珊瑚羟基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,观察其在体外与小鼠胚胎成骨细胞株(MC3T3-E1)的细胞相容性。方法：实验于2009-06/09在广州军区广州总医院实验科完成。采用体外细胞培养技术,将MC3T3-E1细胞种植于10-3、8×10-5、10-5mol/L Ag+-CHA, CHA及纯珊瑚支架材料上。实验评估：①MTT法测定MC3T3-E1细胞接种在不同支架材料上生长1,3,5d后的吸光光度值,绘制细胞在不同骨材料上的生长曲线,评价材料上细胞的增殖情况；②碱性磷酸酶(ALP)活性法测定细胞接种在不同支架材料上2,4,6d的吸光光度值,计算培养液中碱性磷酸酶值；③倒置相差显微镜下直接观察培养板上MC3T3-E1细胞的生长形貌；④应用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopes, CLSM)直接观察支架材料上MC3T3-E1细胞的生长形貌；⑤应用扫描电镜(SEM)观察细胞在材料上生长的微观形貌。应用SPSS 13.0软件对各框架材料上的细胞生长情况结果行析因方差分析及LSD法两两比较,(α=0.05)。结果：①成骨细胞在各组材料上的增殖能力有显著性差异(F=76.457,P=0.000)。CHA组与8×10-5mol/L组比较有显著性差异(P=0.019),而与10-5mol/L组及纯珊瑚组两两比较均无显著性差异(P值分别为0.177、0.428),成骨细胞在CHA组上的活性最高,增殖能力最强,增长速度最快,其次为纯珊瑚组、10-5mol/L组及8×10-5mol/L组；而细胞在10-3mol/L组上的增殖能力最低,材料上细胞数目最少,与其他组比较均有显著性差异(P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),各组与对照组相比较均有显著性差异(P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),表明8×10-5、10-5mol/L Ag+-CHA及其他非载银材料适合用于培养成骨细胞,对细胞无明显毒性,可诱导细胞迅速增长,而10-3mol/L Ag+-CHA不适合成骨细胞在其上生长。②各组之间比较有显著性差异(F=15.582,P=0.000)；10-3mol/L组与其他各组之间比较有显著性差异(P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),说明细胞在此组材料上生长最慢,分泌ALP最少；8×10-5mol/L组与对照组比较无显著性差异(P值为0.292),而8×10-5mol/L组与10-5mol/L组及CHA组两两比较无显著性差异(P值分别为0.340、0.068),说明随着材料载银量的减少,上述载银材料对细胞已无明显毒性作用；10-5mol/L组、CHA组、纯珊瑚组三组之间比较无显著性差异(P值分别为0.366、0.292、0.880),而与对照组比较有显著性差异(P值分别为0.049、0.006、0.004),说明三组材料适合细胞在其表面粘附生长,同时材料的三维多孔空间结构拓展了细胞粘附的表面积,有利于细胞快速增殖,其结果与MTT试验结果一致。③MC3T3-E1细胞与不同框架材料联合培养1d时的生长形貌：10-3mol/L Ag+-CHA培养板上细胞未贴壁生长,为透明的圆球形,呈游离状态,未能很好舒展,且有些皱缩,生长活力也不旺盛；细胞与8×10-5mol/L组、10-5mol/L组、CHA组及纯珊瑚组联合培养的生长情况要明显好于10-3mol/L组,细胞相互融合成片,多呈长梭形,细胞紧密排列成束,聚集生长的趋势更明显,这些结果与MTT及ALP结果相一致。④CLSM图像显示三组材料上的细胞数量及形貌无明显差别。⑤SEM图像显示材料上细胞呈梭形,较扁平,表面有细小绒毛与皱褶,细胞在与材料接触部位伸出伪足,形成鸭蹼状粘附并包绕材料,表面可见其分泌的骨基质。结论：通过MTT、ALP活性、倒置相差显微镜、激光共聚焦及扫描电镜全方位多角度观察了细胞在天然框架材料上的反应。细胞增殖、生长良好,表明材料具有良好的细胞相容性。MTT、ALP活性的定量结果表明低载银量珊瑚羟基磷灰石材料与非载银骨替代材料的生物相容性基本一致。课题研究第四部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨修复兔桡骨污染性骨缺损的实验研究目的：通过体内动物实验检测该抗菌性人工骨植入动物体内的组织相容性、骨传导性和材料的生物降解等组织自愈合生物学性能。方法：新西兰大白兔36只,随机分为4组,每组9只。选用新西兰大白兔制作兔桡骨15mm节段性污染性骨与骨膜缺损模型,将36只大白兔称重,按体重大小顺序编号,按随机数目表法随机分为A-D组。A组植入载银珊瑚羟基磷灰石材料；B组植入珊瑚羟基磷灰石材料；C组植入原位自体骨材料；D组无任何植入,做为对照组。分别于术后2,6,10周分三次处死动物取材,每次每组3只,通过大体观察、影像学检查、组织学检查观察比较各组骨缺损修复情况,应用SPSS13.0软件对X线观察结果行重复测量方差分析及LSD法两两比较,α=0.05,比较上述各组对大段骨缺损的修复作用。结果：不同组材料对骨缺损修复的大体观察结果可见2w时A、B两组移植物表面有肉芽组织和部分半透明骨质覆盖,与宿主骨断端间有部分骨痂连接,移植物无明显移位；C组移植物与宿主骨有部分骨痂连接,移植物无活动；D组骨缺损区填充以肌纤维组织。6w时A、B两组移植物表面有薄层骨质覆盖,与宿主骨断端间有大量骨痂连接,较稳固；C组移植物与宿主骨皮质连续,但不均匀,移植物无明显移位；D组缺损区仍填充以肌纤维组织。10w时A、B两组移植物表面有明显连续骨质覆盖,移植物稳固；C组移植物与宿主骨皮质连续成一体；D组缺损区仍填充以肌纤维组织。X线检查结果可见不同时间点各组之间比较有显著性差异(F=11.537,P=0.000)；自体骨成骨情况最好,与其他各组之间比较有显著性差异(P值分别为0.004、0.010、0.000),说明自体骨组织在大段骨缺损修复时仍然是最好的材料；Ag+-CHA组与CHA组两组比较无显著性差异(P值分别为0.524),说明珊瑚羟基磷灰石经一定量载银后其成骨作用未受明显影响；对照组与其他各组之间比较有显著性差异(P=0.000、0.000、0.000),说明污染性兔桡骨大段骨缺损后其成骨作用明显受到抑制,其模型制作是成功的。结论：根据仿生的思路和以往对骨修复框架材料的研究,我们制备了一种新型的抗菌性框架材料用于污染性骨缺损修复。此材料成分和结构均与天然骨无机成分有相似性,多孔结构与松质骨类似。通过体内动物实验,证明了此材料具有良好的生物相容性和骨传导性,是有效的骨修复框架材料,可以达到与自体骨材料相同的效果,有希望成为污染性骨缺损修复的优选材料,具有广阔的市场前景。综上所述,抗菌性载银珊瑚羟基磷灰石骨替代材料的制备过程简单,抗菌剂银离子的缓释性能较为理想,在污染性大段骨缺损处有良好的骨传导性及成骨作用,可以预想该抗菌人工骨材料是一种治疗污染性骨缺损的良好骨修复材料。
高宁[9]2004年在《RhBmp-2、聚乳酸复合体植入犬拔牙创促进牙槽骨再生的实验研究》文中研究指明[目的]：通过将rhBmp-2与聚乳酸的复合体植入犬拔牙创内，利用X线检查、光镜、扫描电镜观察实验组拔牙创与对照侧拔牙创牙槽骨的愈合情况并做对比，为临床寻找一种适合实际应用的促进牙槽骨再生的新型的生物材料。[方法]：选成年雄性牙周健康杂种犬6只，随即方法分为2组，每只犬全麻下间隔拔除左右双侧上下颌前磨牙，两侧相同牙位做自体对照，一侧拔牙创内充填rhBmp-2与聚乳酸的复合体，缝合创口，一侧缝合创口，自然愈合做对照，于2周后，6周和10周行X线检查，于6周和10周分别处死2组犬，取标本行光镜和扫描电镜观察成骨情况，材料与新生骨结合情况。[结果]：复合体材料充填组，术后6周拔牙创处出现较清晰骨小梁影像，与周围松质骨牙槽骨影像相近，对照组拔牙创骨小梁影像密度则低于周围牙槽骨影像。术后10周，实验组骨小梁影像密度明显高于周围松质骨牙槽骨影像。对照组骨小梁影像与周围牙槽骨影响相近。病理观察实验组6周生成的骨小梁比对照组粗大成熟度高，扫描电镜观察术后6周材料与新生骨结合紧密，结合面为骨性结合，材料内有新生毛细血管，成骨活跃，术后10周，实验组已生成较为成熟骨组织，骨陷窝缩小，材料基本降解。[结论]：rhBmp-2、聚乳酸复合体是一种促牙槽骨再生的新型生物复合材料，并可缩小拔牙创，减少出中文摘要血，促进拔牙创的愈合，有希望成为临床实际应用的修复牙槽骨缺损的新型材料。
徐佳[10]2014年在《下颌骨外板劈开珊瑚羟基磷灰石植入治疗半侧颜面短小的基础与临床研究》文中研究表明研究目的1、探讨血管内皮生长因子、纤维蛋白胶及珊瑚人工骨复合物作为复合支架材料在体内的成骨效果以及下颌骨外板劈开联合血管内皮生长因子、纤维蛋白胶及珊瑚人工骨复合物充填用以增加下颌骨宽度的效果,评估该方法的可行性,为进一步的实验研究及以后的临床应用提供理论依据。2、运用下颌骨外板劈开颗粒状珊瑚羟基磷灰石充填矫治以Pruzansky-Kaban分型为Ⅰ型或者Ⅱa型的半侧颜面短小导致的下颌骨发育不良畸形,评估该方法的术后效果并分析该手术方法的优点及应用范围。方法1、本实验以小型猪为实验对象,A组5头小型猪,左侧行下颌骨外板劈开,颗粒状珊瑚羟基磷灰石、血管内皮生长因子及纤维蛋白胶(CHA+VEGF+FS)复合物植入术,右侧作为正常对照组。B组5头小型猪,左侧行下颌骨外板劈开,颗粒状珊瑚羟基磷灰石、血管内皮生长因子及纤维蛋白胶(CHA+VEGF+FS)复合物植入术；右侧行下颌骨外板劈开,颗粒状珊瑚羟基磷灰石及纤维蛋白胶(CHA+FS)复合物植入术。通过形态学、组织学、影像学观察及生物力学检测等手段研究VEGF对新骨形成过程的影响,通过骨质吸收率评估复合物材料的成骨效能,观察术后增加下颌骨宽度的效果。2、6例患者采用下颌骨外板劈开珊瑚羟基磷灰石人工骨植入术进行以Pruzansky-Kaban分型为Ⅰ型或者Ⅱa型的半侧颜面短小所致下颌骨发育不良畸形的矫治。对其中4名患者进行随访,随访时间6至24个月,通过术前、术后的摄像、头颅CT三维重建进行术后效果的评估。结果1、研究发现CHA+FS复合物及CHA+VEGF+FS复合物植入后均可有效对下颌骨的宽度进行扩展,但早期通过组织学观察发现CHA+VEGF+FS复合物植入后较CHA+FS复合物血管化程度高,更早地实现骨成熟。在骨质吸收率的检测上,CHA+VEGF+FS复合物植入后较CHA+FS复合物低从而实现更好的成骨效能。术后6个月两种植入物通过组织形态学、扫描电镜等超微结构观察与正常骨组织无明显差别,并且两者植入后对最大应力无明显影响。2、所有患者由于珊瑚人工骨的植入下颌骨相应部位厚度均不同程度的增加,术后患者面下部不对称畸形得到明显的改善,同时还有很好的美容效果。结论1、论证了下颌骨外板劈开联合珊瑚人工骨、血管内皮生长因子及纤维蛋白胶(CHA+VEGF+FS)复合物充填术是一种更为有效增加下颌骨宽度的方法,为其应用于临床打下理论基础。2、下颌骨外板劈开颗粒状珊瑚羟基磷灰石人工骨植入术是一种行之有效修复Pruzansky-Kaban分型为Ⅰ型或者Ⅱa型的半侧颜面短小导致的下颌骨发育不良畸形的方法,为解决下颌骨发育不良畸形临床治疗难题提供了一种有效的手段。
参考文献：
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[2]. CRTER杂志呼吸科方面生物材料研究的发稿方向[J]. 佚名. 中国组织工程研究与临床康复. 2010
[3]. 数字化珊瑚羟基磷灰石人工骨支架的制备及生物学评价[D]. 林山. 南方医科大学. 2011
[4]. 高分子纳米材料的研制及用于骨组织工程的初步研究[D]. 李坚. 中南大学. 2006
[5]. 数字化载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的制备及生物学研究[D]. 朱辉. 南方医科大学. 2012
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[8]. 抗菌性骨缺损修复材料的理化与生物学性能实验研究[D]. 张宇. 南方医科大学. 2010
[9]. RhBmp-2、聚乳酸复合体植入犬拔牙创促进牙槽骨再生的实验研究[D]. 高宁. 青岛大学. 2004
[10]. 下颌骨外板劈开珊瑚羟基磷灰石植入治疗半侧颜面短小的基础与临床研究[D]. 徐佳. 北京协和医学院. 2014