L-苹果酸异构体方法学验证论文_李娟

L-苹果酸异构体方法学验证论文_李娟

西安万隆制药股份有限公司 710119

【摘 要】苹果酸,又名2-羟基丁二酸,由于分子中有一个不对称碳原子,有两种立体异构体。大自然中,以三种形式存在,即D-苹果酸、L-苹果酸和其混合物DL-苹果酸。苹果酸主要用于食品和医药行业。本文对高效液相色谱法拆分L-苹果酸、D-苹果酸异构体进行了研究。建立了相应的L-苹果酸异构体方法学验证,保证该方法的可靠性和可行性。[1]

【关键词】L-苹果酸;异构体;方法学

1 色谱条件的确定:使用高效液相色谱法对L-苹果酸、D-苹果酸异构体进行定位、分离,DL-苹果酸分离度良好,并进行方法学验证及供试品检测。色谱条件:色谱柱:CHIRALPAKR AD-H(4.6mm×250mm,5μm);供试品浓度:6mg/ml,流动相:正己烷-异丙醇-三氟乙酸(85:15:0.1);流速:1.0ml/min;检测波长:210nm;柱温:30℃,进样量:20μl。[2]

2 专属性及系统适用性:精密称取L-苹果酸和D-苹果酸对照品适量,加甲醇1ml溶解加流动相稀释制成浓度分别为6.12 mg/ml、6.05μg/ml的混合溶液。记录色谱图,保留时间:D-苹果酸11.656分,L-苹果酸12.507分,分离度1.85。结论:L-苹果酸与D-苹果酸分离良好,空白溶剂不干扰待测溶剂的测定。

3 检出限与定量限:取浓度为0.6mg/mlD-苹果酸对照品贮备液稀释制成一系列浓度的溶液。记录色谱图,S/N≈3时为检测限;S/N≈10时为定量限。D-苹果酸检出限1.0μg/ml,定量限3.0μg/ml。结论:D-苹果酸的检出限和定量限均小于控制限度,能够满足检测要求。

4 线性与范围:取D-苹果酸适量加甲醇溶解,制成浓度为0.6mg/mlD-苹果酸对照品贮备液,取贮备液0.17ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、5.0ml,分别置100ml量瓶加流动相稀释制成D-苹果酸浓度在1~30μg/ml范围内的线性对照品溶液;取上述对照品溶液记录色谱图,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,进行线性回归。线性方程A=818.98×C-81.556相关系数R=0.9994。

期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆结论:D-苹果酸在1.0μg/ml~30.0μg/ml的范围内线性良好。

5 准确度:对照品溶液1:称取D-苹果酸7.05mg置10ml容量瓶中流动相稀释,再取1ml置100ml容量瓶即为浓度7.05μg/mlD-苹果酸溶液。对照品溶液2:称取D-苹果酸6.95mg置10ml容量瓶中流动相稀释,再取1ml置100ml容量瓶即为浓度6.95μg/mlD-苹果酸溶液。供试品溶液:取D-苹果酸约6mg置10ml量瓶中加甲醇1ml使溶解再加流动相稀释,为D-苹果酸对照品溶液贮备液。称取L-苹果酸原料约600mg置100ml量瓶中,量取D-苹果酸对照品溶液贮备液0.8ml、1ml、1.2ml流动相溶解并稀释,各平行制备3份;注入色谱仪计算回收率。结论:D-苹果酸的回收率为98.24%,RSD为0.46%(n=9)含量准确度良好。

6 溶液稳定性:取L-苹果酸与D-苹果酸的混合对照溶液,D-苹果酸对照品溶液,室温放置分别在0、2、4、6、8小时记录峰面积。供试品溶液:D-苹果酸峰面积RSD1.71%;L-苹果酸峰面积RSD1.88%。对照品溶液:D-苹果酸峰面积RSD3.47%。结论:溶液放置8小时内稳定性良好。

7. 精密度:1)重复性:取D-苹果酸6mg置10ml量瓶中加甲醇1ml溶解后加流动相稀释为D-苹果酸对照品溶液贮备液。取L-苹果酸原料600mg置100ml量瓶中取D-苹果酸对照品溶液贮备液1ml,加流动相溶解稀释,平行制备6份为供试品溶液。另取D-苹果酸对照品约6mg,加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含D-苹果酸6μg的溶液为对照品溶液。记录色谱图按外标法计算含量。D-苹果酸结果:0.07%、0.06%、0.07%、0.07%、0.08%、0.08%,重复性良好。

2)中间精密度:分别由人员A和人员B配制供试品溶液和对照品溶液,分别使用液相色谱仪甲和乙记录色谱图以外标法计算含量及RSD。结果:人员A仪器甲D-苹果酸(%):0.10、0.10、0.10、0.10、0.10、0.10;人员B仪器乙D-苹果酸(%):0.08、0.10、0.10、0.09、0.10、0.09。结论:D-苹果酸的RSD值为6.7%(n=6)中间精密度良好。

8 耐用性:改变波长为205nm、210nm和215nm,D-苹果酸(%):0.103、0.098、0.095RSD4.10%。改变柱温为25℃、30℃和35℃,D-苹果酸(%):0.104、0.098、0.097RSD3.80%。改变流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min,D-苹果酸(%):0.097、0.098、0.095RSD1.73%。 结论:波长±5nm柱温变化±5℃流速±0.2ml/min,结果无明显差异耐用性良好。

9 最终确定的色谱条件:异构体 色谱条件与系统适用性试验 用多糖衍生物为填充剂(CHIRALPAKR AD-H(4.6mm×250mm,5μm)),以正己烷-异丙醇-三氟乙酸(85:15:0.1)为流动相;检测波长为210nm;柱温为30℃;流速为1.0ml/min;取DL-苹果酸适量,精密称定,加甲醇1ml使溶解,再加流动相稀释制成每1ml中约含DL-苹果酸6mg的溶液,作为系统适用性溶液,精密量取20μl,注入液相色谱仪,理论板数按L-苹果酸计算不低于2000,D-苹果酸、L-苹果酸峰的分离度均应符合要求。测定法 取本品适量,精密称定,加流动相溶解并稀释制成每1m中约含6mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取上述供试品溶液20μl,注入液相色谱仪按面积归一化法计算,其D-苹果酸的含量,应不得过0.1%。[3]

参考文献:

[1]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心.药品GMP指南.中国医药科技出版社,分析方法的验证和确认

[2]国家药典委员会.《中华人民共和国药典》(四部).中国医药科技出版社,2015:通则0512

[3]刁全平. 高效液相色谱法拆分几种手性药物的研究[D]. 辽宁师范大学,2006.

论文作者:李娟

论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年第16期

论文发表时间:2018/1/23

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