刘云国[1]2002年在《苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术及其遗传变异分析》文中研究表明植物材料在超低温保存过程中，其物质代谢、能量代谢及其它生命活动降至最低限。因而，超低温保存是长期和稳定保存植物种质的有效方法之一。玻璃化超低温保存技术具有操作简单、程序简化及保存效果好等优点，越来越成为超低温保存的主要方法。本试验以离体培养的苹果茎尖作为材料，对玻璃化方法冻存的主要步骤包括继代培养、低温锻炼、预培养、玻璃化冰冻保护剂脱水、冷冻保存、化冻洗涤及再培养进行了优化，筛选了合适的冰冻保护剂PVS3，得到了70％以上的茎尖成活率，并通过对再生苗形态、生化及分子水平的遗传稳定性检测，证明了该方法保存苹果种质资源的可行性。主要实验结果如下： 1．将在高浓度蔗糖溶液(1.5mol．L~(-1))和ABA(0.5mg·L~(-1))的逆境培养基上生长的苹果试管苗继代培养不同时间，分别置于0～7℃的低温下，锻炼0～6周，发现苹果试管苗茎尖(0.5mm)在逆境培养基上继代培养3个月以上，4～5℃低温下锻炼4周以上，经液氮冷冻之后，成活率较高(69％)。 2．对比不同浓度的蔗糖及蔗糖和甘露醇配合使用对成活率的影响发现，单独使用蔗糖时，以0.7 mol．L~(-1)的蔗糖预培养效果较好；而蔗糖配合甘露醇时，0.5 mol．L~(-1)蔗糖加0.2 mol．L~(-1)的甘露醇效果更好。预培养基中去除NH_4~+，添加5％的DMSO，对提高成活率也有一定的效果。在1～4d的预培养时间内，所有预培养基上都以预培养2d成活率最高。 3．分析测定了预培养过程中茎尖含水量和含糖量的变化，结果表明，预培养2d时茎尖含水量和含糖量达到或接近最低和最高值，而冻存之后，其细胞活力最高。 4．设计并研究了5种玻璃化保护剂对成活率的影响，筛选出效果较好的PVS3， （二）刘云国：苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术及其邀传变异分析其组成为 MS－40％甘油＋45％蔗糖－10％乙H醇＋10％DMSO （W／V。单独使用 PVS3时以90min的处理时间最佳。采用分步脱水，即将PVS3稀释2倍和4倍后，分别处理25min和30min，然后再用PVS3处理80min的效果更好。 5．试验结果表明，茎尖在液氮中的冻存时间不影响成活率。而不同的化冻方法对细胞活力影响较大，35～40℃的水浴化冻法得到的茎尖细胞活力最高，是较好的化冻方式。化冻后用 MS＋l二 mol．L－‘的蔗糖溶液清洗浸泡 30min。清洗过的茎尖接种立去掉N＊。－的恢复培养基MS＋BA 0．6＊g．L’＋NA＊ 0．l＊g．LJ十0A3 0．5 mg·L’上，经过20～30d的生长迟滞期后，进入正常生长，同末经冻存的对照生长量一致。不同基因型的苹果超低温保存耐受力不一样，在试验的6个品种中，“世界一”的成活率最高（sl％）。 6．冻存后恢复生长的小苗可以顺利生长、生根，其外部形态与生长发育情况与对照植株未见差异。比较对照与冻存再生苗叶片及茎的可溶性蛋白SDS－PAGE谱带及POD同工酶图谱未发现差异，RAPD扩增结果也未见有差异。这说明冻存后再生植株在形态、生化和分子水平上的遗传稳定性，初步证明了该保存方法应用于苹果种质资源保存的可行性。
邵建柱[2]2003年在《苹果等果树种质资源的离体保存研究》文中提出植物遗传资源是人类赖以生存和发展的最重要的物质基础,保持其遗传多样性是人类实现可持续发展的重要保证。果树是重要的经济作物,在国民经济中占有重要的地位。传统的果树种质资源保存方法是田间种植保存,该方法易受病虫害、自然灾害以及经费短缺等问题的困扰,使得大量的资源面临或已经流失。离体保存安全可靠、占用空间小、节省开支,正在成为田间保存的重要补充技术。本研究在前人工作的基础上,对苹果等重要果树资源的离体保存技术进行了较深入的研究,主要结果如下: 1 建立了包括西洋梨(Pyrus communis)、沙梨(P.pyrifolia)、白梨(P.bretschneideri)及新疆梨(P.sinkiangensis)等4个种在内的15个梨品种的离体茎段培养物,及适宜上述材料的通用继代培养基即MT+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA_3 2.0mg/L。为梨的离体保存研究初步奠定了基础。借鉴植物微茎尖及热处理脱毒原理,通过暗培养促进枝条的伸长生长及弱化输导组织的发育,然后再培养茎尖,成功地脱除了梨的内生菌,为组培材料内生菌的脱除提供了一个新思路。 2 通过叶片再生胚状体途径,建立了富士、王林、嘎拉、八楞海棠、珠美海棠和MM_(106)等6个苹果基因型的单胚系,为遗传变异研究提供了材料。 3 确立了在继代培养基中添加低浓度秋水仙素长时间处理石榴茎段离体加倍的有效方法,并首次获得了石榴的四倍体植株。四倍体植株田间表现叶色深绿、花变大、育性下降等多倍体特征。该技术为石榴的育种开辟了一条新途径。 4 通过对试管苗状态的调整,外植体类型及大小的选择,结合密闭减少氧气供应和水分蒸发,成功地建立了适合苹果等果树离体材料的常温缓慢生长法保存技术。应用该技术,苹果离体茎段在常温下至少可以连续保存1a以上,最长的可以保存25个月;梨和石榴离体茎段可以连续保存7个月以上。 5 以多个具有代表性的基因型为材料,确立了苹果和梨常低温保存中适宜的外植体类型和通用培养基。完善了苹果和梨离体茎段的常低温保存技术,使得苹果和梨离体茎段在3±0.5℃条件下,保存28个月和24个月后,仍保持近100%存活率。进一步完善了苹果茎段的超低温保存技术,确立了甘油和ABA在预处理中的重要作
冯超红[3]2014年在《苹果茎尖超低温保存技术及脱毒效率的研究》文中指出种质资源是植物传统育种和基因工程育种的基础。超低温保存是目前国际上公认为最理想的长期保存植物种质资源的方法。苹果是世界上最重要的果树之一。中国是世界上最大的苹果生产国，是苹果属种质资源的起源中心。苹果病毒病害一直是制约苹果生产持续发展的重要因素。苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）和苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）是危害苹果生产的重要病毒。栽培无毒苗是目前国际上防治苹果病毒病的有效途径。茎尖超低温脱毒是近年来建立的一种新的脱毒技术。本研究旨在建立简易、高效的苹果茎尖超低温保存技术，并利用该技术尝试对ASPV和ASGV病毒的脱除。1．建立了简单、高效的苹果茎尖包埋-干燥法超低温保存技术。以‘嘎啦’试管苗为试材(Malus×domestica Borkh.‘Gala’)，从4周苗龄试管苗取茎尖（2mm，含5-6片叶原基），用2.5%的硅藻酸钠溶液在0.1M CaCl2溶液中，将茎尖包裹成5mm直径的小球，每个小球含一个茎尖，将小球在含有0.5M蔗糖的预培养基上培养7d，然后在超净工作台中空气干燥6个小时后，将小球转入1.8mL的冷冻管中（每个冷冻管中盛10个小球），直接投入液氮中保存。保存后的茎尖在38oC水浴中解冻2min，培养在后培养基上再生植株。后培养基成分为MS附加30g L-1蔗糖，0.25mg L-1BA,0.01mg L-1IBA和8g L-1琼脂，培养8周后可获得发育良好的植株(≥5mm)。将该技术应用于7个苹果基因型（4个种和1个杂交种），再生率最高的是‘嘎啦’（75%），最低的是‘望山红’（Malus×domestica‘Wangshanhong’，36%）。组织学切片观察结果表明，超低温冷冻后，只有顶端分生组织和幼嫩叶原基的大部分细胞成活，茎尖才能再生正常植株。2.建立了苹果茎尖小滴-玻璃化法和玻璃化法超低温保存技术。以‘嘎啦’试管苗为试材，从4周苗龄的试管苗取茎尖（2.0mm，含5-6片叶原基），在含有2M甘油和0.8M蔗糖的液体MS培养基中预培养1d。在小滴-玻璃化法中，将预培养过的茎尖用植物玻璃化溶液（PVS2）处理40min，然后转入铝箔条上的PVS2（6μL）小滴中，直接投入液氮中保存。在玻璃化法中，将预培养过的茎尖用PVS2处理30min后，转入含有100μl PVS2的冷冻管（1.8mL）中，直接投入液氮中保存。经小滴-玻璃化法和玻璃化法超低温保存的茎尖在含有1.2M蔗糖的MS培养液中卸载20min，转入后培养基上再生。将两种超低温保存技术用于测试苹果6个基因型（4个种和1个杂交种）。3.叁种超低温保存技术冷冻效果的比较。包埋-干燥法的成活细胞数和再生率高于小滴-玻璃化法和玻璃化法，再生速率较快。叁种方法冷冻后的成活茎尖均产生叁种再生类型：愈伤组织、叶片（没有茎段伸长）和茎。叁种再生类型在包埋-干燥法中的比例分别为4.8%、18.7%和76.5%；在小滴-玻璃化法中的比例为29.4%、11.2%和59.4%。包埋-干燥法受季节影响较大，而小滴-玻璃化法较为稳定，两种方法在冬季（10-12月）保存时的再生率最高。用ISSR和RAPD法对叁种超低温保存技术冷冻后再生植株的遗传稳定性进行检测，没有发现异常条带。流式细胞仪（Fow Cytometry，FCM）检测没有发现染色体倍性的变化。4．用茎尖（≥0.5mm）超低温处理和热处理结合茎尖（≥0.5mm）超低温处理分别脱除了ASPV和ASGV病毒。以带ASPV和ASGV病毒的‘M9’和‘M26’试管苗为试材，茎尖（≥0.5mm）培养不能脱除ASPV。用小滴-玻璃化法茎尖超低温处理脱除了ASPV病毒，‘M9’和‘M26’所取茎尖为0.5-1.0mm时，脱毒率为85.1%和80.3%；茎尖大小为1.0-2.0mm时，脱毒率为57.6%和62.8%。热处理（36oC/30oC，16h光周期，60d）结合茎尖培养（茎尖≥0.5mm）和单一的茎尖（≥0.5mm）超低温处理不能脱除ASGV病毒。而‘嘎啦’经热处理结合茎尖超低温处理能脱除ASGV病毒，取茎尖为0.5-1.0mm时脱毒率为57.1%，1.0-2.0mm的茎尖脱毒率为50%。免疫组织化学法定位ASPV和ASGV在茎尖的分布表明，ASPV只能在第四片以外的叶原基和顶端分生组织靠下的部位有分布，而ASGV病毒在顶端分生组织区域和幼嫩叶原基中都有分布。用病毒在茎尖的定位与超低温冷冻后成活细胞在茎尖的分布，揭示了超低温处理能脱除ASPV，难脱除ASGV的原因。本研究获得的结果为建立苹果种质资源超低温库和生产无毒苗提供了技术支撑。
宋萍萍[4]2010年在《怀菊花种质资源玻璃化超低温保存技术研究》文中进行了进一步梳理怀菊花[Huaiqing chrysanthemum (Dendranthema morifolium)]是“四大怀药”之一,主产于河南温县、武陟、博爱(古为怀庆府所辖,故名),兼具观赏、药用、食补叁大功能。但目前怀菊花种质资源仍采用大田种植保存的方法,方式单一,加上其自身的特点,菊花属于异花授粉,大田种植使其纯度不能保证,长期以来种质混杂,珍贵的种质资源流失严重。20世纪末发展起来的超低温保存技术,是目前长期稳定保存植物种质资源的唯一可行的好方法,它可以节省空间,避免继代、病虫害和气候等因素造成的种质丢失,并且设备简单,操作简便。基于此,我们开展了怀菊花玻璃化法超低温保存种质的技术研究。取得了如下研究结果:1.建立了怀菊花的快繁技术体系。怀菊花试管苗可通过腋生枝型和多芽体发生型两种途径进行繁殖,腋生枝型的最佳快繁培养基为MS+6-BA 0.2 mg·L~(-1) + NAA 0.2 mg·L~(-1);多芽体发生型(带芽茎段和叶片)最佳的培养基为MS+6-BA 1 mg·L~(-1)+NAA 2 mg·L~(-1);试管苗生根的最佳培养基为MS + PP333 0.5 mg·L~(-1)。2.建立了玻璃化法超低温保存怀菊花种质资源的技术体系。继代培养40 d的试管苗,于4℃低温下锻炼7 d,在无菌条件下切取0.5 cm左右的带芽茎段,采用MS培养基添加Glu 0.24 mol·L~(-1) + Gly 0.4 mol·L~(-1)作为预培养基,在4℃下恒定培养3 d,然后将材料用60% PVS2做装载液在室温下装载20 min,然后用改良的PVS2(Gly 30% + EG 15% + DMSO 10%)0℃下脱水60 min,迅速投入液氮保存;在液氮中至少保存1 d后,立即将材料放入40℃水浴中快速化冻1～3 min,化冻后以MS基本培养基添加1.0 mol·L~(-1)和1.2 mol·L~(-1)葡萄糖的梯度洗涤,每次10 min,洗涤后转入再生培养基(同快繁培养基)中,于暗处培养至15 d开始形成愈伤,30 d时转到光下培养,培养至7 d时愈伤开始转绿,至25 d～30 d时芽开始形成,60 d后可长成正常植株,成活率可达80%以上。3.对保存后的再生苗进行了稳定性分析。与常温苗相比,玻璃化超低温保存后的怀菊花再生苗的平均茎节长、株高和叶片数增加值均没有显着差异;叶片的可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量也均没有显着的差异;而再生苗叶片的相对电导率、超氧阴离子和丙二醛含量显着降低,SOD和POD活力增强,同工酶谱分析表明,二者的POD、SOD酶谱表现出高度的一致性,但个别谱带的宽窄及亮度存在差异。以上说明,所建立的怀菊花玻璃化超低温保存技术体系,不仅能保持其形态和生理及酶谱的稳定性,而且增强了其抗膜质过氧化的能力。
王晗[5]2016年在《人参种质资源超低温保存方法及其对遗传变异特性研究》文中提出人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是五加科人参属名贵中药材。我国人参资源丰富,但由于收集与保存体系不完善,造成人参种质资源遗传多样性的丢失与缩减,给种质创新、育种工作带来很大困难。超低温保存技术是种质资源长期保存的有效方法。本研究以人参不定芽和愈伤组织为试材,通过探讨影响人参超低温保存技术的各项因素,建立起人参种质资源超低温保存体系;并对再生材料进行遗传变异特性研究。主要结果如下:1.本试验采用玻璃化法对人参不定芽进行超低温保存,探讨了影响玻璃化法超低温保存技术的因素,初步建立人参不定芽玻璃化法超低温保存体系。即选择继代培养45~60d的组培苗为试材,低温锻炼14~28d后切取2-3mm的不定芽,之后用含0.5mol/L Suc的MS培养基预处理2d,于室温下在2mol/L Gly+0.4mol/L Suc混合液下装载处理30min,然后PSV2于冰水浴条件下(0℃)处理90~120min,快速投入液氮中;液氮保存30d后,迅速投入38~40℃水浴快速化冻,用含1.2mol/L Suc的MS液体培养基洗涤3次,最后转入MS+4mg/L 6-BA+5mg/L GA3+0.25mg/L NAA培养基上进行恢复培养,存活率高达72.39%。2.本试验采用程序降温法对人参愈伤组织进行超低温保存,对影响程序降温法超低温保存技术的因素进行分析,结果表明:预处理对细胞活力、含水量均有影响,当预处理10d左右时,细胞活力达到最大值,细胞含水量约为30%;最佳冷冻保护剂为10%DMSO+0.5mol/L Suc+10%Gly。人参愈伤组织恢复生长的特征是以在原愈伤组织表面长出新的愈伤组织,恢复培养过程中,先经过一段时间的生长停滞期,之后进入快速生长阶段。3.本试验采用形态学观察、SSR分子标记技术、双向电泳技术对超低温保存前后的材料进行遗传变异特性分析,结果如下:在形态学方面,其生长状态未发现差异;在分子水平方面,未发现差异条带;在蛋白质水平方面,发现多种蛋白质表达量发生不同程度的变化。本试验通过探讨影响超低温保存的因素,建立了人参种质资源超低温保存体系;并对再生材料的遗传变异特性进行研究,为人参种质资源保存和创新提供了材料基础和理论依据。
张晓宁[6]2011年在《香石竹种质资源小滴玻璃化法超低温保存技术研究》文中提出香石竹(Dianthus caryophyllus L.)是闻名世界的四大切花之一,因其花形秀美,花色艳丽,而被广泛应用于花卉领域。超低温保存可以对香石竹种质资源进行长期保存,具有省时省力,不受自然环境及病虫害的影响,遗传稳定性高的优点,是今后种质资源保存的重要手段。本文以香石竹品种'Master'为实验材料,利用正交设计和单因素方差分析优化了香石竹茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系,并将该体系应用到叁个香石竹品种'Calibra'、'Lamour'、(?)'Ofcar'中,最后对保存过程中细胞超微结构的变化进行了观察。主要研究结果如下：建立了香石竹品种'Master'茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系。具体保存方法为：取继代1.5-2个月的香石竹试管苗'Master',剥取含2-4片叶原基的无菌茎尖(1-2mm)于室温下分别经含0.3M蔗糖的MS液体培养基预培养2d,5%DMSO+5%甘油预培养10min,2M甘油+0.4M蔗糖装载20min,0℃下用冰冻保护剂PVS2处理60min,冻存后的材料室温下迅速投入MS+1.2M蔗糖的卸载液中洗涤2次,每次10min。然后转入恢复培养基暗培养1周后转到正常光照下培养,存活率和成苗率分别为91%和73%。运用优化的方案对'Calibra'、'Lamour'、和'Ofcar'3个香石竹品种进行超低温保存,平均成活率分别为85%,50%和47%；平均成苗率分别为62%,42%,42%。结果显示品种间差异显着。利用透射电镜观察冻存过程中细胞超微结构的变化,结果表明,茎尖分生组织细胞变化最大的是在脱水阶段,在脱水阶段发生的主要变化是部分原生质体收缩,细胞质浓厚,质壁分离极其严重,大液泡变小,内质网膨大,质膜内陷形成一系列小泡,这些小泡从膜上脱落下来,使细胞内小泡大量增加,核周隙扩张,线粒体膨胀变形,线粒体基质较对照细胞稀薄,脊更加发达,受到破坏的细胞器或膜系统流到质壁分离的空腔内。冷冻24小时细胞质壁分离更加严重有些细胞内部空洞化,在某些细胞壁周围出现嗜饿颗粒,标志着细胞受到致死损伤,经过恢复培养,多数细胞损伤得以修复,转化为与对照相似的细胞结构。
殷振芳[7]2014年在《百合（Lilium）离体植株再生及超低温保存研究》文中研究表明百合是单子叶植物纲百合科（Liliaccae）百合属（Lilium）的多年生球根草本植物的总称。中国是全球百合资源最丰富的国家，特有种占全球百合资源的一半以上。百合不仅具有较高的观赏价值和经济价值，还具有食用和药用价值。植物种质资源的收集与保存是传统育种和生物技术育种的前提条件。工业化、城市化、全球气候变暖正导致全球约1/3的物种濒临灭绝。传统的种质资源保存的方法成本较高，占地面积大，易受病虫害和自然灾害的威胁。超低温保存被视为植物种质资源长期保存最理想、最有效的方法。微型繁殖、转基因、种质资源保存及人工种子（Articifcial seeds）生产等依赖于高效、广谱的离体植株再生体系，包括器官发生（Organogenesis）和体细胞胚发生（Somaticembryogenesis）。本研究通过器官发生和体细胞胚发生，分别建立了高效、广谱的的百合器官发生和体细胞胚发生再生体系；建立了高效、广谱的百合茎尖超低温保存体系；建立了百合胚性愈伤超低温保存技术，为百合转基因研究提供更为理想的受体材料；为百合种质资源超低温库的建立提供了技术支撑。本研究取得的主要结果如下：1.通过优化影响百合叶片不定芽再生的关键因素，建立了6个百合品种的高效、广谱叶片不定芽再生体系。供试的6个百合品种叶片不定芽分化率均较高（91.6%-100.0%），平均分化率为95.8%，单个外植体不定芽数最高为西伯利亚百合（7.0），最低为双色百合（4.7），平均值为5.5。组织学研究表明，叶片近轴端表皮下的单个或几个细胞最先开始脱分化，之后经过细胞分裂直接形成不定芽，没有愈伤组织的形成。ISSR分子标记研究结果表明，再生植株没有变异条带的出现；AFLP分子标记研究结果表明，再生植株仅有0.73%的变异率；形态学观察表明再生植株与母本材料外形一致。2.通过优化百合鳞茎薄层细胞诱导胚性愈伤组织的关键因素，建立了5个百合品种的高效、广谱的体细胞胚再生体系。胚性愈伤组织的诱导率最高为新铁炮百合（85.0%），最低为兰州百合（25.0%），平均值为56.1%。组织学研究表明，鳞茎表皮的单个细胞最先开始脱分化，之后经过细胞分裂形成胚性细胞团，胚性细胞团进一步发育形成无性胚，进而萌发成完整植株。ISSR分子标记研究表明，再生植株没有变异条带的出现。3.通过优化小滴玻璃化法超低温保存的关键步骤，建立了6个百合品种的简易、高效、广谱的茎尖超低温保存体系。供试的6个百合品种中，茎尖超低温保存后的植株再生率最高为西伯利亚百合(87.5%)、最低为双色百合（42.5%），平均再生率为67.1%。组织学研究表明，茎尖经过超低温冷冻后，仅生长点顶部的几层细胞和幼嫩叶原基（第一到第叁）中的部分细胞可以存活，其余细胞均不能成活。西伯利亚百合和双色百合茎尖超低温保存后细胞的成活模式和数目相似，表明不同百合品种再生率的差异可能与再生培养基有关。ISSR分子标记研究结果表明，西伯利亚百合和双色百合茎尖超低温保存后的再生植株均未没有变异条带的出现。4.建立了百合小滴玻璃化法超低温保存后茎尖体细胞胚再生技术。将超低温保存后的茎尖培养在0.1mg L-1NAA+0.1-0.2mg L-1KT后培养基上，在黑暗条件下培养6周后，超低温保存后的茎尖形成叁种再生物：胚性愈伤组织、茎和胚性愈伤组织、茎。胚性愈伤组织发生率最高的是西伯利亚百合（90.0%），最低的是亚洲百合‘精粹’（45.0%），茎的再生率最高的为亚洲百合‘波利安娜’（52.5%），最低的为新铁炮百合（25.0%）；6个百合品种的平均胚性愈伤组织发生率为60.0%，平均茎再生率为39.6%。5.通过优化玻璃化法超低温保存的关键步骤，初步筛选出西伯利亚百合胚性愈伤组织超低温保存的最适预培养蔗糖浓度为0.5M，最适PVS2脱水时间为4h，获得的胚性愈伤组织成活率为50.0%。
刘云国, 王晓云[8]2002年在《苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术》文中认为研究了苹果茎尖的玻璃化法超低温保存技术。实验了低温锻炼、预培养及恢复培养基对成活率的影响 ,筛选出了合适的冰冻保护剂PVS 3,构建了苹果茎尖玻璃化法超低温保存体系。同时对冻存成活苗的叶片再生能力和过氧化物酶 (POD)同工酶进行了检测
徐定华[9]2005年在《柚类种质资源超低温保存体系研究初探》文中研究表明植物种质资源的传统保存形式以田间种植为主,但是其容易受到自然气候、空间限制和管理经费短缺等因素的影响,使其应用于种质资源的长期保存受到限制。近年来基于组织培养技术发展起来的液氮超低温保存技术以其保存稳定、效率高、花费少等优点而被认为是目前植物资源长期保存的理想方法。本研究我们以鄂西地区特有柚类种质为试材,进行了玻璃化法超低温保存研究,以期建立起其长期、稳定的保存体系,为柚类资源和其他果树品种的长期保存提供技术借鉴,所取得的主要结果如下: 1.对柚成年态茎段的离体培养进行了研究。依据真菌孢子的萌发特点及不同生长时期对消毒剂敏感性不同的特性,以8月份左右的柚成年态茎段为试材,试验建立了一种有效的获得无菌外植体方法,即将3～4cm长柚茎段用70%酒精消毒30s,0.1%升汞溶液处理20min,材料放置2d后,相同浓度升汞溶液第二次处理20min。无菌水冲洗后,将材料切成0.5cm长带一腋芽茎段,接种至初代培养基。以这种方法消毒,外植体的污染率大大降低,获得了85.6%的成功率。对柚腋芽诱导培养基进行了筛选,结果表明茎段腋芽诱导最佳培养基配方是:MT+BA 2.0mg/L+GA_30.5mg/L+NAA0.1mg/L+葡萄糖30g/L。待新梢长到1.0～1.5cm长时即进行继代培养,生长正常,其中没有观察到愈伤化现象。 2.对柚茎尖玻璃化法超低温保存的基本条件进行了研究,初步建立起柚类茎尖的玻璃化法超低温保存体系。试验以高浓度的蔗糖作为渗透性保护物质,以景阳白柚为试材进行预培养。结果表明,蔗糖的预培养方式以0.3M(1d)+0.5M(1d)+0.7M(1d)最好,保存成活率达81.4%;对玻璃化液(PVS_2)的脱水时间和温度进行了研究,宜昌本地柚4号的处理结果表明其在0℃下脱水20min,可以取得72.2%的保存存活率,显着高于20℃下的处理;对4个柚品种的茎尖大小对保存成活率的影响进行了研究,结果以大小为2.0～2.5mm的茎尖平均存活率要高于另外二者(1.0～1.5mm,3.0～3.5mm),为60.6%。再生植株的生根有效培养基配方是:1/2MT+NAA0.5mg/L+Suc40g/L,生根率达到90.6%。
吴昀, 张琳, 林田, 夏宜平[10]2012年在《超低温保存植物种质资源的新途径——小滴玻璃化法》文中研究说明超低温保存是一种安全、有效的种质资源保存途径,可长期保存种质资源。小滴玻璃化法是在滴冻法和玻璃化法上基础上发展起来的用于植物种质资源保存的新技术。本文综述了该方法的技术概念、主要优点、基本程序、应用前景及国内外研究现状。
参考文献：
[1]. 苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术及其遗传变异分析[D]. 刘云国. 山东农业大学. 2002
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[3]. 苹果茎尖超低温保存技术及脱毒效率的研究[D]. 冯超红. 西北农林科技大学. 2014
[4]. 怀菊花种质资源玻璃化超低温保存技术研究[D]. 宋萍萍. 河南师范大学. 2010
[5]. 人参种质资源超低温保存方法及其对遗传变异特性研究[D]. 王晗. 中国农业科学院. 2016
[6]. 香石竹种质资源小滴玻璃化法超低温保存技术研究[D]. 张晓宁. 华中农业大学. 2011
[7]. 百合（Lilium）离体植株再生及超低温保存研究[D]. 殷振芳. 西北农林科技大学. 2014
[8]. 苹果种质资源玻璃化法超低温保存技术[J]. 刘云国, 王晓云. 山东农业大学学报(自然科学版). 2002
[9]. 柚类种质资源超低温保存体系研究初探[D]. 徐定华. 华中农业大学. 2005
[10]. 超低温保存植物种质资源的新途径——小滴玻璃化法[J]. 吴昀, 张琳, 林田, 夏宜平. 植物生理学报. 2012