华露 任少伟
(内蒙古包头市第四医院 014030)
【摘要】 目的：指导工作人员在PCR实验室日常工作中更好的了解掌握PCR的操作。
【关键词】 PCR实验室 实验室设置 工作制度
【中图分类号】R197.32 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）01-0077-02
在临床PCR实验室正常工作中，如何建立PCR实验室的工作规范，确保分子诊断室正常工作？这就要求:第一、在实验室设置及仪器设备等硬件上要满足开展临床检验的条件；第二要求实验室在日常工作要有严格的工作制度作为保障。
首先对实验室有严格要求
1、样品准备区
这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取必要的预防措施[1]：
1）PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。
2）组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。
3）用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。
4）DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。
5）大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。
6）管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。
7）任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCR
RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。
3、前PCR区
必须有专门用于准备各种反应的区域，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR实验室试剂的操作
1）所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。
2）所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。
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3）在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。
4）所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
5）所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
6）新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
7）样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物
1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。
2）如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。
3）作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。
4）阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。
5）当做阳性对照时，应该使用最少数量的核酸[2]。
6）由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。
6、PCR仪的位置
仪器应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有良好的接地线。环境温度保持在23℃左右，湿度保持在60％左右
7、后PCR区
PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。
8、控制污染的方法
一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。
其次，要有严格的工作制度[3]。
1. 实验室内必须保持安静、整洁，不得大声喧哗，不得在室内从事与实验无关的事宜。
2. 禁止与实验无关人员出入，实验室主要通道入口及各功能区域应有特殊的标志。
3. 实验室各区域有各自专用的实验设备和器材，包括工作服、拖鞋、一次性消耗品、办用品等，各有明显的标志，绝对不能混用。
4. 严格遵守人员及物品按单区流动，不得交叉混流。
5. 严格按照基因检测操作规程进行实验和使用仪器设备，定期检测、校正并作好记录工作。
6. 每次基因检测中应设立阴阳对照。
7.实验室工作人员必须严格按照PCR实验室操作程序进行，实验开始前必须做好室内及工作台的清洁消毒，离心管、吸头等一次性用品需高压灭菌处理。
8.工作结束后必须立即应用10%次氯酸钠溶液消毒实验室台面，并用紫外灯照射实验室。试验中使用过的吸头，离心管等应送到指定的地点进行处理。
日常工作中严格按照以上要求操作才可以保障基本的实验开展，为一个合格的临床PCR实验室打下基础。
参考文献
[1]申子瑜，李金明，临床基因扩增检验技术，北京：人民卫生出版社，2002：111-122
[2]李金明，申子瑜，正确认识临床实验室认可与提高检验质量之间的关系，中华检验医学杂志，2007，30（2）：136
[3]《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[2002]8号）,《医学实验室－质量和管理要求》（ISO15189-2003)
论文作者:华露,任少伟
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第1期供稿
论文发表时间:2014-4-2
标签：样品论文; 实验室论文; 试剂论文; 操作论文; 核酸论文; 气溶胶论文; 日常工作论文; 《医药前沿》2014年第1期供稿论文;