类风湿性关节炎分期诊断和论文_王近吴1,,张辛茂1

[摘要]目的:探究转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-Beta 1,TGF-β1)分子表达与类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)分期诊断的相关性,为早期RA分期诊断提供新的诊断指标和理论依据。方法:收集2018年01月至2018年12月在成都医学院第一附属医院就诊的RA患者样品60例以及同期正常样品20例,根据临床诊断打分和实验诊断结果对RA患者样品60例分活动Ⅰ期14例,活动Ⅱ期18例,活动Ⅲ期28例。运用流式细胞术(FCM)、反转录-荧光定量聚合酶链反应(RT-Q-PCR)方法、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法对所有样本Th17细胞亚型,血液TGF-β1 mRNA,血清TGF-β1蛋白进行检测分析。结果:研究表明,RA样本和正常样品相比,TGF-β1表达具有显著差异(P<0.05)。Th17细胞亚型,TGF-β1蛋白,TGF-β1 mRNA结果与RA DAS28活动分期的相关性分别为r=0.482,r=-0.256,r=0.490。结论:通过血液样本对TGF-β1分子表达检测,发现其与RA分期诊断具有相关性。且TGF-β1 mRNA 比Th17细胞亚型和TGF-β1蛋白结果更具有参考性,TGF-β1 mRNA分子表达检测可以作为RA早期分期诊断指标,为临床RA早诊断早治疗提供理论依据。

[关键词] 类风湿性关节炎;分期诊断;TGF-β1;分子表达

[通信作者] 王近吴,女,硕士生,基础研究,E-mail:jinwuwang95@163.com;Tel:15308035721

Correlation between staging diagnosis and TGF-β1 expression in rheumatoid arthritis

Wang-Jinwu1, Zhang-Xinmao1

(Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan,610500,P.R.China)

【Abstract】Objective: To investigate the correlation between the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and the diagnosis of rheumatoid arthritis (RA), and to provide new diagnostic indicators and theoretical basis for the early stage diagnosis of RA. Methods: We Collected 60 RA patients and 20 normal samples from the same period in the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College from January 2018 to December 2018. According to clinical diagnosis scores and experimental diagnosis results, 60 patients were divided into desease activities. There were 14 cases in stage I, 18 cases in stage II, and 28 cases in stage III. We had detected T cell subtypes, TGF-β1 protein and TGF-β1 mRNA experession level for all samples by Flow cytometry (FCM), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-Q-PCR) methods. Results: Studies show that there is a significant difference in the expression of TGF-β1 protein and TGF-β1 mRNA between RA samples and normal samples (P<0.05).The correlation of Th17 cell subtype, TGF-β1 protein, mRNA and RA DAS28 activity stage was r=0.482, r=-0.256, r=0.490. Conclusion: We found that the expression of TGF-β1 molecule has a correlation with the diagnosis of RA staging. Moreover, TGF-β1 mRNA is better than protein results. TGF-β1 molecule expression can be used as an early diagnostic marker for RA and it provide a theoretical basis for early diagnosis and early treatment of RA.

【Key words】Rheumatoid Arthritis;staging diagnosis;transforming growth factor-beta 1;molecular expression

类风湿关节炎((Rheumatoid Arthritis,RA)是一种常见的骨关节滑膜炎系统性自身免疫性疾病,多见于女性[1,2,3],多见于女性,全球患病率达到1%[4]。其主要表现为关节滑膜的慢性炎症、增生形成血管翳,侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等[1,5-9],是一种对称性、慢性、进行性多关节炎。RA造成关节结构破坏,最终导致关节畸形和功能丧失,对患者生活自理能力产生严重影响,给国家医疗造成严重负担。现行研究RA发病机制除与遗传和环境相关外,涉及复杂的细胞免疫及体液免疫反应,具体致病机制不清楚[10]。多项研究表明RA患者外周血Th1、Th2、Treg和Th17亚细胞群间存在的动态平衡及交互抑制作用被打破,RA的早期发生与Th1/Th2细胞的失衡有关,后期发展与Th17/Treg细胞的失衡有关系[11-13]。我们推测机体处于Th1/Th2/Treg/Th17其中一种或几种细胞占优势的漂移现象,这可能是导致RA全身及关节局部炎症持续的原因之一。临床主要通过定量的实验诊断结果和定性的患者病理情况对RA患者进行诊断和分期,由于RA活动期症状和静止期不同,且表现多样,实验诊断和病理情况不能很好地对处于活动期的RA进行分期诊断。

免疫初始T细胞分化不平衡与参与RA致病过程的众多关键细胞因子分泌紊乱有关,前人研究表明参与RA致病过程的关键细胞因子很多,包括了多种白介素(如IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10,IL-17,IL-21,IL-23)、干扰素(Interferon,IFN)、转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-Beta 1,TGF-β1)和肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)等[14,15]。其中转化生长因子(TGF-β1)的表达异常与Th1/Th17和Th17/Treg细胞的分化失衡密切相关[10,16]。转化生长因子β1(TGF-β1)是一种对细胞成熟、增值,分化具有双重调节作用的多功能因子[17]。TGF-β1通过smads蛋白传递信号,它的表达几乎关系到RA病情发生、发展、治疗、预后及转归的全过程,其作用复杂多样。所以TGF-β1基因的表达与RA患者的免疫状态息息相关,并影响RA的病程[18,19]。

1资料与方法

1.1一般资料

收集成都医学院第一附属医院RA病人60例(全部为女性,平均年43±8.7),健康人群20例(全部为女性,年龄在40±7.6岁之间)清晨空腹静脉血2ml左右两管,活动期必须同时满足下列条件:(1)4个或以上的关节肿胀;(2)6个或以上的关节触痛;(3)符合下面两条标准中任意1条:随访当日晨僵持续时间≥45min,血沉(魏氏法)≥28mm/h,C反应蛋白(C-Reactive protein,CRP)>10mg/L[20,21]。所有病人均符合2010年美国风湿病学会的RA分类标准[22];

排除非RA标准:无其他严重病史者;3个月以内未接受过生物制剂或关节皮质类固醇治疗。临床评估包括压痛和肿胀关节数,DAS28评分和实验室指标红细胞沉降率(Erythrocyte Sedimentation Rate,ESR)[6]、CRP、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(Anti Cyclic Citrullinated Peptide Autoantibody,ACPA)。RA组与健康对照组两组间的性别以及年龄比均衡性检验皆显示无差异[20]。

1.2 方法

分别对血液样本进行了T细胞亚型FCM分析、TGF-β1蛋白ELISA检测和mRNA荧光定量PCR检测。

1.3 相关统计学处理

所有数据采用GraphPad Prism7.0软件分析和作图。结果数值用(x±s)表示,不同组间比较采用t检验和方差分析,不同组间数据相关性分析采用Spearman相关分析[23],最终统计结果以(P<0.05)为差异有统计学意义。

2结果

2.1 样本分类和实验诊断指标结果

收集成都医学院第一附属医院RA病人60例,健康人群20例血液样本。对60例RA患者标本应用疾病活动评分 DAS28分成RA活动期Ⅰ期(DAS28 ≤ 3.2),RA活动期Ⅱ期(3.2 < DAS28 ≤ 5.1)和(DAS28 > 5.1)。正常样本和RA活动期样本之间,年龄,疾病持续时间并无统计差异,血沉ESR,类风湿因子RF和抗环瓜氨酸肽自身抗体(ACPA)在RA活动期Ⅱ期和Ⅲ期并无统计学差异。(见表2-1)

注:数值用平均值±标准差表示,数据统计用t-检验方法,--表示无或未检测到结果,? P < 0.05表示具有统计学差异。

2.2 血液样本T细胞亚型FCM处理结果

收集成都医学院第一附属医院RA病人60例,健康人群20例血液样本,通过流式细胞术对Th1,Th2,Th17和Treg细胞进行分选和计数。以同型对照标记为对比,计算各血液T细胞亚型相对频率。Th1和Treg细胞亚型RA活动Ⅲ期对正常样本具有统计学差异(P<0.05),Th2细胞亚型无统计学差异。Th17细胞亚型RA活动Ⅰ期,Ⅱ期,Ⅲ期对正常样本都具有统计学差异(P<0.05)。(见表2-2)

注:数值用平均值±标准差表示,数据统计用t-检验方法,?P< 0.05表示具有统计学差异。

2.3 血清样本TGF-β1蛋白ELISA检测结果

对收集到RA病人60例,健康人群20例血清样本ELISA检测TGF-β1蛋白结果显示,总体RA样本TGF-β1蛋白浓度表达和健康对照组相比低40pg/ml,但P>0.05无统计差异。RA活动Ⅰ期和Ⅲ期跟健康对照组相比也无差异,值得注意的是RA活动Ⅱ期TGF-β1蛋白浓度表达较低,跟健康对照组相比,P<0.05有统计学差异。(见表2-3)

注:数值用平均值±标准差表示,数据统计用t-检验方法,?P<0.05表示具有统计学差异。

2.4 血液mRNA荧光定量PCR检测结果

对收集到的60例RA病人血样和20例健康人群血样,提取RNA,反转录荧光定量PCR TGF-β1后,根据CFX96本身软件采用2-??Ct的相对定量计算方法,结果表明RA样本TGF-β1转录子相对表达量低于正常样本组。而且根据RA活动期加强,TGF-β1转录子相对表达量成负相关性,都差异低于正常样本组,而且组间差异P<0.05,有统计学差异。(见图2-1)

注:control为正常对照组,RA1为RA活动Ⅰ期,RA2为RA活动Ⅱ期,RA3为RA活动Ⅲ期,?P<0.05表示具有统计学差异。

2.5 散点图相关性分析

根据RA患者分期样本和正常对照组样本的流式结果(Th17),ELISA结果,荧光定量PCR结果,对应DAS28分期样本,运用采用Spearman相关分析方法,进行组间相关性分析。流式Th17细胞频率结果显示,和RA患者严重程度成正比,且各组间具有统计学差异(P<0.05)。ELISA TGF-β1蛋白表达结果显示,RA活动Ⅱ期、RA活动Ⅲ期和正常对照组相比表达降低,有统计学差异(P<0.05)。荧光定量PCR TGF-β1 mRNA相对表达结果显示,和RA患者严重程度成正比,且各组间具有统计学差异(P<0.05)。荧光定量PCR结果与流式(Th17)结果相比,与DAS28分期的相关性要高(r=0.490 VS r=0.482)。(见图2-2)

注:control为正常对照组,RA1为RA活动Ⅰ期,RA2为RA活动Ⅱ期,RA3为RA活动Ⅲ期, P<0.05表示具有统计学差异。

3讨论

类风湿关节炎(RA)是一种较为常见的系统性自身免疫病,全球流行,但具体致病机制尚不清楚[24-26]。目前RA的临床诊断一般是通过定性的临床病理分析和定量的检验指标。本文通过定性病理分析,对照样本,比较了RA与正常人的组间差异和不同活动期的相关性。

TGF-β1低浓度时与IL-6联合作用促进分化为Th17细胞,单独高浓度时促进分化为Treg细胞,而Th17/Treg的平衡影响RA的病情进程[27,28]。同时TGF-β1蛋白表达受TGF-β1基因和mRNA表达的影响,而且与转录后修饰和翻译调控有关。患者RA和正常样本血细胞TGF-β1蛋白表达水平在不同的研究中,结果有差异。RA患者血液中TGF-β的水平明显低于正常人,因此RA患者下调免疫活动的功能下降,自身免疫反应异常,自身抗体及免疫球蛋白合成增多[29,30]。TGF-β1对RA患者起到很重要的保护作用,它的减少导致RA患者自身免疫紊乱[29]。正常人群各细胞因子和T亚群细胞正常分泌行使功能,而RA患者各细胞因子分泌紊乱,导致T亚群细胞分化失衡,分化失衡反过来也影响各细胞因子的分泌[31-34]。TGF-β1基因的表达与RA患者的免疫状态息息相关。其作用形式多样,生物功能复杂,单独存在时和与其他细胞因子共同作用的时候,对人体免疫细胞的分化和发展影响完全不一样。因此,TGF-β1的分子表达与类风湿性关节炎的关系值得我们去研究。分析TGF-β1检测结果与类风湿性关节炎不同活动期的相关性,鉴定分析对于评价RA早期诊断分期具有临床意义的分子表达指标,有助于临床早期诊断RA和其分析用药,最终为探究RA的发生与发展关系,研究TGF-β1分子表达在RATh17/Treg细胞分化平衡中的作用机制,对早期诊断、评价病程发展提供借鉴,为治疗RA提供实验理论依据。

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论文作者:王近吴1,,张辛茂1

论文发表刊物:《医师在线》2020年3期

论文发表时间:2020/4/7

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