张利辉[1]2001年在《玉米大斑病菌2号小种毒素的分离与纯化研究》文中研究表明玉米大斑病（Northern Leaf Blight of Corn）是玉米生产上的主要病害，它的病原物凸脐蠕孢菌（Exserohilum turcicum）能够产生一种寄主选择性毒素（HT-毒素），在玉米的叶片上产生典型的大斑病症状。作者通过对玉米大斑病菌2号小种毒素的提取纯化以及组分分析的研究，明确了以下问题：（1）玉米大斑病菌在改良Fries培养液可以产生毒素，培养21天后的滤液经低温冷冻、加甲醇去沉淀后对玉米的毒性没有降低。（2）将玉米大斑病菌的培养滤液用乙酸乙酯、氯仿、乙醚叁种有机溶剂进行分步萃取和分别萃取，各萃取物经HPLC（高效液相色谱）分析，发现所分离出色谱峰的保留时间和形状基本相同，可见HT-毒素可以溶于上述叁种有机溶剂；用根冠细胞法和离体叶片针刺法进行生物活性跟踪测定，发现HT-毒素在乙酸乙酯中溶解度最大。（3）将玉米大斑病菌HT-毒素的乙酸乙酯粗提物用紫外分光光度计进行紫外吸收波长扫描，发现该粗提物在206、215、227和257nm处有吸收，经比较发现在257nm处噪音信号较小，吸收范围较宽。（4）试验用不同比例的甲醇和乙腈作为流动相对乙酸乙酯粗提物进行了HPLC分析，发现流动相中溶剂的组成和比例对HT-毒素的分离效果影响很大，在最佳洗脱条件下，HT-毒素可以分离出8个主要的组分。（5）用C_18制备柱对所分离出的几个组分分别进行了制备，经生物测定发现其中的组分7和组分10对玉米有明显的毒性。（6）在同一分离条件下，将标准毒素（组分Ⅰ：5-羟甲基-2-呋喃甲醛）进行HPLC分析，并将其保留时间与本试验所得制备图谱进行比较，发现组分Ⅰ的保留时间最小，可以推断，本试验所得各组分纯品的分子量可能大于标准毒素。 河北农业大学硕士学位论文门）将制备所得组分分别进行红外光谱扫描并比较其吸收光谱，发现两个毒性组分的红外吸收光谱基本上是一致的，它们的吸收峰形状也基本相同，只是其波数稍有变动，其它非毒性组分与其有所差别，其中组分4与6也属于同一类物质。
张利辉, 刘云惠, 董金皋, 李正平[2]2003年在《玉米大斑病菌特异性毒素组分的分离与纯化》文中研究表明玉米大斑病菌的 2号小种菌株用改良Fries培养液进行体外培养 ,培养滤液经 - 40℃冷冻干燥 ,加等体积甲醇去除沉淀后用乙酸乙酯提取 ,粗提物经HPLCC18柱可以分离出 8个组分 (峰 3～ 10 )。经生物测定发现 ,7号峰和 10号峰的纯品对玉米叶片有明显的毒性 ,其中 7号峰对带有Ht1基因的玉米表现出了一定的特异性。制备所得毒性组分分别进行红外光谱扫描 ,发现 2个毒性组分的红外吸收光谱基本一致 ,吸收峰形状基本相同 ,只是其波数稍有变动。
王绍新[3]2006年在《HT-毒素特异性组分的分离及其在Ht1基因玉米质膜存在结合蛋白的证据》文中进行了进一步梳理本研究对玉米大斑病菌1号小种毒素的特异性组分进行分离,建立了高效的特异性毒素分离纯化方法,并对其进行了紫外波谱分析;用荧光素双醋酸酯(FDA)染色法,测定了毒素特异性组分对原生质体死亡率的影响;进而用1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)荧光探针标记法和SDS-PAGE电泳法对特异性毒素组分与Htl基因玉米细胞互作过程中的质膜蛋白进行了研究,旨在证明Htl基因玉米细胞质膜上存在特异性毒素组分结合蛋白(TBP),为从细胞和分子生物学角度阐明毒素的致病机理提供证据。主要结果如下: 1.对玉米大斑病菌的1号小种菌株(99-2)的粗毒素进行硅胶薄层层析(TLC),分离到Ⅰ(Rf0.06)、Ⅱ(Rf0.21)、Ⅲ(Rf0.45)、Ⅳ(Rf0.60)、Ⅴ(Rf0.75)5个条带,分别对此5个条带进行生物测定,发现条带Ⅱ对带Htl基因的玉米具有较强的特异性。 2.在检测波长220nm、流速1.0mL/min的HPLC分析条件下,对条带Ⅱ的洗脱剂中甲醇与水的比例进行摸索,最后确定60%甲醇为最佳洗脱条件。经对条带Ⅱ进行高效液相色谱(HPLC)的进一步纯化,得到3种组分Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3,其中只有Ⅱ-3具有特异致病活性。对Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3进行紫外-可见光谱扫描。发现只有Ⅱ-3在300nm处有吸收峰,Ⅱ-1和Ⅱ-2的峰形相似,可能为类似物。 3.从HT-毒素Ⅱ-3组分处理玉米幼苗的叶片中提取原生质体,在0-1.5h内其死亡率与对照(蒸馏水处理幼苗)无明显差别,但1.5h后Ⅱ-3处理一直明显高于对照,说明Ⅱ-3加速了叶片细胞的死亡;在6h左右处理有显着上升,而对照变化不大。说明Ⅱ-3与叶片细胞作用后并不直接伤害细胞,而需经过一定时间,这一过程很可能是Ⅱ-3与受体结合后信号不断放大,最终使原生质体失去活力的过程。 4.以玉米叶片原生质体为研究对象,以ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)作荧光探针,用荧光法研究了Ⅱ-3与质膜蛋白的互作。在被ANS标记后的原生质体悬浮液中加入不同浓度HT-毒素Ⅱ-3组分后,ANS荧光强度明显增加,呈现出了剂量—效应关系,表明Ⅱ-3与质膜上ANS某些受体发生了互作。本试验采用两种试剂,从两个角度表明了ANS受体和质膜上存在的Ⅱ-3受体具有蛋白特性。推测HT-毒素特异性组分的原始作用位点在质膜外侧,且特异性毒素组分与其受体互作具明显的饱和性。 5.利用SDS-PAGE电泳技术分析了HT-毒素Ⅱ-3组分对玉米叶片中可溶性蛋白和质膜蛋白的影响。结果表明,Ⅱ-3对叶片中可溶性蛋白没有影响,但在叶片质膜蛋白中找到了3个与Ⅱ-3致病相关的蛋白,经分析其分子量分别为31.622KD、63.125KD和93.536KD,其中分子量为31.622KD和63.125KD的蛋白为叶片本身所特有。
翟羽红[4]2008年在《玉米弯孢叶斑病菌致病性分化定向选择机理与致病相关基因鉴定》文中指出玉米弯孢菌叶斑病是由新月弯孢霉(Curvularia lunata (Wakker) Boed)引起的,自上世纪90年代末,该病害在我国各玉米产区不断蔓延,成为制约我国玉米安全生产的主要病害之一。关于该病害的发生规律、品种资源抗性鉴定、病原流行学已有一些研究,然而关于寄主对该病原菌选择效应和致病相关基因却缺少深入研究。本文通过人工继代接种寄主和蛋白质组学技术相结合的方法,以弱致病类型的玉米弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata (Wakker) Boed.)瓦试18(WS18)和C107为材料,反复接种(6代)玉米抗病自交系沈135,Mo17,78599-1,分析病菌致病性动态变化。在接种前二个世代,病情指数和菌丝蛋白图谱没有发生明显变化,到了第叁代,病情指数明显增加,蛋白质图谱的差异蛋白数量和表达水平也同步发生变化。到接种第五代时,随着病情指数的增加,蛋白质图谱上的差异蛋白数量大幅增加。利用MALDI-TOP/MS鉴定出10个差异蛋白点,包括4个上调蛋白、4个下调蛋白和2特异诱导蛋白。其中3个蛋白点与致病性分化密切相关,包括两个与黑色素合成相关蛋白(下调蛋白Brn1,上调蛋白Scytalone dehydratase)和1个甘油合成相关蛋白(上调蛋白NAD-dependent glycerol-3-phosphate);2个过敏性相关蛋白(上调蛋白Serine/threonine protein kinase,上调蛋白Iron/manganese superoxide dismutases),另外4个蛋白参与了能量代谢和信号转导过程(Triosephosphate isomerase, Phosphoglycerate mutase, RNB domain, Ran/TC4 subfamily)。此外,还发现1种未知蛋白(hydrolases or acyltransferases)。这些特异诱导或表达上调的蛋白与致病性分化关系密切,一方面可反映出抗病寄主对病菌的定向选择效应,另一方面可做为致病性分化标记,为深入研究致病性分化机理提供线索和技术方法。关于病菌致病相关基因的研究,本文利用限制性内切酶介导基因整合技术,用带有潮霉素和氨卞抗性基因的线性化质粒pv2和限制性内切酶HindⅢ转化经合适PEG浓度处理的弯孢菌CX3原生质体,构建获得200多个REMI突变体,经选择性培养基继代培养筛选出10株遗传稳定的白色转化子,对这10株白化菌株进行致病性测定,接种结果显示具有很弱的致病性,从而形成了优化的弯孢菌异源基因转化体系。将单拷贝插入的白化菌株A-2进行质粒拯救,得到的特异性整合载体包含了430bp的弯孢菌基因组DNA序列信息,经NCBI数据库检索发现,插入位点侧翼序列与不饱和脂肪酸脱氢酶(FAD3)基因具有很高的同源性(93%),该酶是形成不饱和脂肪酸的关键酶类,可能与病菌孢子和菌丝的形成与萌发相关。
刘亚光[5]2002年在《大豆灰斑病菌毒素组分、致病性及其诱导抗性的研究》文中研究表明本论文在研究大豆灰斑病菌产毒条件的基础上，分离出大豆灰斑病菌的粗毒素，用生物测定的方法明确了所提取的粗毒素的致病作用，并用粗毒素进行了抗性鉴定。然后又进一步对10个生理小种粗毒素组分进行了鉴定，分析了10个生理小种粗毒素的蛋白组分与其生理小种田间致病力之间的关系，为进一步明确灰斑病菌的毒素是致病因子提供了更确凿的依据。在以上的研究基础上，又进一步地研究了大豆灰斑病菌及其粗毒素以及化学因子等对大豆叶片内与抗病性密切相关的生化物质的诱导作用，旨在探索大豆灰斑病菌及其毒素的生化致病机制与诱导抗性机制。本研究的主要结论如下： 1 大豆灰斑病菌粗毒素的提取及致病活性的测定 大豆灰斑病菌的最佳产毒条件是利用Czapek培养基，以蔗糖作为碳源，糖含量为3％，将培养基的pH调到6.0，接种新鲜菌丝叁块，在25～28℃黑暗条件下静止培养25～27天。用甲醇、乙醇、丙醇和硫酸铵等两种沉淀大分子物质的方法，均提取到使大豆叶片产生典型病斑和致萎毒性的化合物，且该粗提物确实能引起大豆感病品种产生典型的病斑症状，由此可以肯定从培养滤液中提取的粗提物符合毒素的概念，可将其称为大豆灰斑病菌所产生的粗毒素。同时灰斑病菌的粗毒素使感病品种叶片产生典型的灰斑病病斑，而抗病品种则表现出对粗毒素的明显抗性，从而可进一步说明灰斑病菌的次生代谢产物——粗毒素是大豆灰斑病的致病因子之一。其中以二倍体积的甲醇来沉淀大豆灰斑病菌毒素最为简单、快速且彻底。 其中离体叶片萎蔫法可以作为测定灰斑病菌粗毒素含量和致病活性的定量生测方法。另外叶片针刺法和幼苗法均体现出所提取粗毒素的致病性及其对抗感品种的毒性作用与田间接种结果的一致性。通过叶片萎蔫法验证了1～10号生理小种粗毒素的致病性与田间接种鉴定抗感品种的结果符合率高达91％。本研究还利用叶片针刺法，观察了大豆灰斑病菌粗毒素对不同作物产生的致病活性，初步的结果表明大豆灰斑病菌粗毒素属于非寄主选择性毒素。 2 大豆灰斑病菌粗毒素组分及特性的研究 灰斑病菌不同生理小种粗毒素中的蛋白质含量和多糖含量的差别，反应了各生理小种所产生毒素是不同的。粗毒素中蛋白质组分及其含量高低在灰斑病菌毒素的致病作用中起主要作用，多糖组分在灰斑病菌毒素的致病作用中也起到一定的致毒作用。粗毒素对热有一定的敏感性，不同生理小种的粗毒素经6NHCl处理后，因蛋白质组分变性失活和多糖组分的彻底水解而丧失全部的生物活性。SDS—PAGE的电泳图谱说明大豆灰斑病菌粗毒素蛋白质大多数都是糖蛋白。此外，10个生理小种田间致病力聚类结果与10个生理小种(除3、8号小种)中的8个生理小种的粗毒素的蛋白质聚类结果相符合，说明粗毒素确是引起大豆发生灰斑病的重要致病因子之一。 3 大豆灰斑病菌及其粗毒素对大豆叶片内几种生化物质的诱导作用 灰斑病菌粗毒素浓度较低时发挥激发子的作用，而浓度达到一定高度时则发挥毒性作用。不同的生理小种的粗毒素的诱导作用存在差异。东北农业大学博士学位论文 摘要 同一生理小种的粗毒素与灰斑病菌对大豆叶片内PAL活性、总多酚类含量、总黄酮含量以及几丁质酶活性等几种生化指标均表现出相似的诱导作用，由此可推断粗毒素是诱导大豆叶片内的PAL活性、总多酚含量、总黄酮含量以及几丁质酶活性产生变化的主要生物因子，只是二者在对抗性不同的大豆品种的诱导速度及强度上存在一定的差异。其一：粗毒素对抗病品种的PAL活性和总黄酮含量的诱导速度比灰斑病菌快，而粗毒素对感病品种的PAL活性、总多酚含量、总黄酮含量和几丁质酶活性的抑制作用则比灰斑病菌出现的早，由此可推断粗毒素是大豆感病品种发病的重要致病因子；其二：粗毒素对抗病品种叶片内PAL活性、总黄酮含量和几丁质酶活性的诱导作用比灰斑病菌强。其叁：灰斑病菌及其粗毒素对抗病品种的PAL活性和几丁质酶活性的诱导作用强于对感病品种的诱导作用，可推断灰斑病菌及其粗毒素是使大豆品种产生抗性反应的生物激发子，或者说灰斑病菌及其粗毒素对抗病品种主要起激发子的作用而对感病品种则主要起抑制子的作用。4大豆产生抗住伤质的诱导因于 乙烯利、草酸和水杨酸这叁种化学因子同灰斑病菌粗毒素一样，分别在各自适合的浓度下均对大豆叶片内的总多酚含量、总黄酮含量、PAL活性和几丁质酶活性等生化指标具有诱导作用。其中水杨酸作为外源化学因子在相同浓度诱导下与粗毒素对抗感品种的诱导作用是一致的。可见，无论是生物因子还是化学因子均能诱导大豆体内抗性物质的变化，而且具有相似的生化诱导抗性机制。
王朝华[6]2002年在《玉米大斑病菌特异性毒素组分的纯化及化学结构》文中认为玉米大斑病是玉米生产上的一种主要叶部病害。大量研究表明，病原物(Exserohilum turcicum(Pass.)Leonard et Suggs)产生的致病毒素(HT-毒素)，是诱致该病发生的主要原因。 本试验以玉米大斑病菌2号小种99-2菌株为材料，利用高效液相色谱(HPLC)技术，通过分离图谱、峰高、峰面积等不同的角度相互比较，对HT-毒素分离、纯化的最佳条件进行了摸索。试验结果表明：利用超纯水作为流动相能够较好地将HT-粗毒素分离；在254nm～269nm波长范围内，紫外检测灵敏度高，便于毒素组分的观察与制备；流动相的pH值对HT-毒素的分离度有很大影响，在pH3.25时，各色谱峰分离度较好；空白对照表明，在检测波长范围内及最适pH值条件下，流动相无任何紫外吸收。试验选用1.8mL/min作为流动相的流速，并在57分钟后加入2％甲醇。这样，HT-毒素完成一次分离需要80分钟，可分离到13个组分。 利用离体叶片针刺法，对分离、制备的各组分的生物测定结果表明，组分1、组分3(为混合组分)和纽分6对供试的玉米品种均表现出不同程度的毒性。组分3和组分6在OH43Ht，玉米上引起的病斑面积大于在其它品种上的病斑面积。经HPLC分析比较，组分6与本实验室前期工作分离到的特异性组分(HT-7)为同一组分。此外，本试验还分离到了一些无毒性的组分，并对活性组分6的纯度进行了定性分析。 对标准毒素组分(5-羟甲基-2 呋喃甲醛)进行HPLC分析发现，该组分与本试验分离到的组分8的保留时间相同。 在HPLC分析的基础上，对活性组分进行了制备，并利用质谱(MS)、核磁共振(NMR)和红外光谱(IR)等波谱手段对组分1和组分6的化学结构进行了初步鉴定。推测组分1的分子量可能为163，含甲基、亚甲基、-C-O-等的糖类；组分6可能为含有不饱和双键、羰基、亚甲基、分子量为142的化合物。具体的化学结构还有待于进一步分析鉴定。
王琴[7]2006年在《玉米条斑型圆斑病病原菌的鉴定和生物学特性研究》文中进行了进一步梳理玉米是世界上重要的粮食作物，它还作为主要的饲料和重要的工业原料在人们的社会生产和生活中扮演重要角色。它的栽培面积和总产量仅次于小麦、水稻居世界第叁位。玉米在其生育期内发生多种病害，这些病害造成玉米生产中的重大损失。玉米生平脐蠕孢引起的玉圆斑病就是其中之一。我国历史上也曾有过圆斑病的大发生。玉米生平脐蠕孢有生理小种的分化，国外已报道了5个生理小种，我国只报道了1号和2号生理小种。 本研究通过致病性测定、形态学和分子生物学鉴定方法首次明确陕西省发生的玉米条斑型叶斑病是由玉米生平脐蠕孢(Bipolaris zeicola)3号生理小种引起的。这是该小种在我国的首次报道。 该小种在PDA、PSA、OMA、CMA、WA和Czapek上均可生长，最适生长培养基为PDA。在PDA培养基上，菌落生长温度范围为5℃～35℃，最适菌落生长温度为25℃。在PDA、PSA、OMA、CMA、WA+MS和Czapek上分生孢子形态变化比较大，以在WA+MS培养基上分生孢子形态与自然状态下最接近。 菌株在以Czapek为基础培养基，等含碳量的变换碳源(淀粉、葡萄糖、乳糖、甘露醇和鼠李糖)制成的培养基上菌落生长速度均低于对照-以蔗糖为碳源培养基。菌株在以鼠李糖为碳源培养基上不产孢。 在以Czapek为基础培养基，等含氮量变换氮源(蛋白胨、牛肉膏、尿素、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、盐酸精氨酸、草酸铵、硫酸铵、硝酸钾和硝酸钙)制成的不同培养基上的菌落生长速度也不一样。以在蛋白胨和牛肉膏为氮源的培养基上生长最好。菌株在以尿素、草酸铵为氮源的培养基上不产孢。 分生孢子可以在自来水中萌发，蔗糖和葡萄糖溶液对孢子萌发有一定促进作用，在0.5％的蔗糖溶液中萌发效果最好。分生孢子在5℃～40℃均可萌发，低于5℃高于40℃萌发率极低，萌发的最适温度为28℃。分生孢子在pH3～11的0.5％的蔗糖溶液中均可萌发，萌发最适pH为5。 供试品种豫玉22、农大108、农大3138、东单7号、沈单10号、沈单16号、户单4号、新陕资1号、高农1号和陕单9号都对3号生理小种表现感病，品种间抗病性差异不显着。 本研究首次报道我国存在玉米平脐蠕孢3号生理小种。由于人们对该病原物的认识有限，防范其爆发流行的警惕性也不够，而且供试的几个品种对该病原也没有明显的抗病性，如果条件适宜，该病原菌可能造成极大的损失。
王玉萍[8]2007年在《我国玉米大斑病病原菌变异研究》文中研究表明玉米大斑病(Northern corn leaf blight,Turcicum leaf blight)是世界玉米生产的重要病害。病原菌的群体结构的组成与变异直接影响着该病害的发生与流行。本文主要进行了玉米大斑病传统生理小种的鉴定,并结合AFLP技术,研究我国玉米大斑病菌的遗传结构,旨在为今后抗病品种的选育和田间布局提供参考意见、为控制或减缓小种的变异寻找方法。以2005～2006年从吉林、黑龙江、河北、北京、辽宁、天津、海南、广西、广东、四川等省23个市县玉米产区采集和分离100份大斑病病菌分离物为供试菌株,以具有Ht单基因的OH43Ht1、黄早四Ht2、黄早四Ht3、黄早四HtN为鉴别寄主,在温室内进行了生理小种的鉴定。发现上述地区生理小种组成复杂,参加测试的4个抗性基因全部都能被克服。在100个菌株中存在15个生理小种,出现频率较高的为小种1、0、N发生频率分别为21%、18%、13%,其次为小种13、1N、2、123、3N、2N、3、23、123N、12、12N、23N发生频率为2%～8%。同时发现北方地区玉米大斑病菌生理小种的变异明显较南方地区丰富。通过对各技术环节的优化,建立了适于玉米大斑病菌遗传结构分析的AFLP技术体系;通过“1+1”、“1+2”、“2+2”、“2+3”、“3+3”引物组合对6个不同来源的玉米大斑病菌株基因组DNA进行扩增,最终选择扩增总条带较多且差异带较多的“2+2”组合。从120多对“2+2”组合中筛选出了11对多态性高、谱带清晰的引物组合。利用筛选的11对引物扩增采自吉林、黑龙江、辽宁、河北、天津、北京、四川、广西、海南的90个大斑病菌株,结果:AFLP指纹谱带的聚类结果玉米大斑病菌的地理来源、生理小种没有直接的对应关系。
董金皋, 李正平, 李秉华, 王瑞瑶[9]1996年在《玉米大斑菌Ht－毒素组分分析》文中认为对分别属于玉米大斑病菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍｔｕｒｃｉｃｕｍ）１号和２号生理小种的致病毒素进行硅胶ＴＬ层析、薄层扫描和生物监测的结果发现，两个小种的毒性组分不同。２号小种可分离到Ｉ（Ｒｆ０．５０）、Ⅱ（Ｒｆ０．３６）、Ⅲ（Ｒｆ０．６７）、Ⅳ（Ｒｆ０．８０）、Ⅴ（Ｒｆ０．１３）、Ⅵ（Ｒｆ０．２５）６种组分，而１号小种最多可分离到除Ⅳ以外的其它５种组分，这些组分均有不同程度的紫外吸收。对在２００～３６０ｎｍ有明显紫外吸收的４种组分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的生物监测结果表明，只有组分Ⅲ对带Ｈｔ１基因和不带Ｈｔ１基因的Ｏｈ４３和Ｂ３７２对玉米自交系不具任何致病活性，组分Ⅰ、Ⅱ对不带Ｈｔ１基因的玉米自交系具有致病活性，而对带Ｈｔ１基因的玉米自交系却无毒性。值得重视的是组分Ⅳ的致病特性与组分Ⅰ、Ⅱ正好相反，即对带Ｈｔ１基因的玉米自交系具有致病活性，却对不带Ｈｔ１基因的玉米自交系没有致病作用。结论指出，Ｈｔ－毒素的ＴＬＣ组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ玉米斑菌诱致玉米发病的主要活性成份，其中组分Ⅳ是２号小种与Ｈｔ１基因玉米互作的特异性因子
赵辉[10]2009年在《玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）生理分化和遗传多态性研究》文中提出本论文从寄主-病原菌互作角度,采用性状培养、Ht单基因鉴别寄主鉴定技术、同工酶电泳技术、扩增片段长度多态性分析技术(AFLP)和血清学技术,系统研究了我国玉米大斑病菌(Exerohilum turcicum)生理分化和遗传多态性。本研究从我国玉米大斑病菌生理小种组成和种群变化等方面,全面分析了近年来我国玉米大斑病危害加重的原因。采用两套Ht单基因(Ht1、Ht2、Ht3和HtN)鉴别寄主,对2005年和2006年采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、陕西、山西、河南、四川和北京-天津-唐山地区共10个省区28个地区的204株玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定,共鉴定出0、1、2、3、12、13、23、123和23N等9个生理小种,其中0号和1号生理小种为优势小种,分别占供试菌株的62.25%和19.12%。毒力频率分析结果表明,玉米大斑病菌小种组成对Ht1抗性基因的毒力频率最高,为33.33%;对HtN抗性基因的毒力频率最低,为1.47%。Ht1和Ht2抗性基因在我国玉米产区均有不同程度的抗性“丧失”。玉米大斑病菌不断有新小种出现,生理分化明显。生理小种组成较复杂的省份为东北叁省、河北和四川等地区。本研究从病原物的环境适应性、同工酶和DNA多态性等方面,系统探讨了导致病原菌生理小种变异的生理和分子生物学机制。利用继代培养、连续接种和rDNA ITS序列比较,探明了在稳定的寄主选择压力条件下,玉米大斑病菌生物学特征、致病性和rDNA-ITS序列是相对稳定的,rDNA-ITS序列同源性达96.9%～100%。在培养性状方面,玉米大斑病菌不同生理小种间菌落形态、菌丝生长速度、产孢量、孢子萌发和菌落产色素能力均存在明显的多态性。在同工酶方面,玉米大斑病菌不同生理小种在6种同工酶水平上均表现出不同程度的多态性,其中酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)的多态性尤为明显。这种同工酶水平上的多态性,反映了病原菌遗传表达的多态性。在DNA遗传多态性方面,采用扩增片断长度多态性分析技术(AFLP)分析了玉米大斑病菌的遗传变异,供试菌株间遗传相似系数在0.6～1.0之间,表现出明显的遗传多态性。聚类结果表明,该病菌的遗传多态性与其生理分化存在明显相关性。但不同地域的同一生理小种的菌株相似系数达到了1.00,说明其生理分化与地域无关。在玉米大斑病菌生理小种辅助鉴定方法的研究方面,本研究首次利用AFLP特异条带序列设计,筛选出玉米大斑病菌生理小种的特异引物,引物组合可以为0、13号等生理小种鉴定提供准确的分子生物学辅助鉴定。在病原菌遗传多态性的基础上,首次利用免疫学方法制备了玉米大斑病菌1、2、12、13号生理小种的抗血清,在提高抗血清稀释度的情况下,经效价、交叉反应、ELISA和Western blot试验,发现1、12号生理小种菌株的抗血清表现出小种特异性。本研究完成了辽宁省主栽玉米品种对玉米大斑病菌生理小种的抗性鉴定。各品种对不同生理小种的抗病性存在明显差异,其中高抗品种占17.86%,中抗至抗的品种占53.57%。抗病性鉴定结果与品种系谱相关性分析表明,品种对不同生理小种的抗性与品种血缘关系相关。另外,气候条件对抗病性鉴定结果亦有影响。综合上述研究结果:玉米大斑病菌存在明显的生理分化。新小种的出现及其种群数量的上升和某些垂直抗病品种抗性的“丧失”是玉米大斑病逐年加重的重要原因。寄主更换的选择压力变化和病原菌种群内的遗传多态性是玉米大斑病菌发生变异的重要原因。AFLP和免疫学技术可以作为玉米大斑病菌生理小种的辅助鉴定技术。辽宁省主栽品种对玉米大斑病菌主要优势小种表现出较好的抗性。
参考文献：
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[8]. 我国玉米大斑病病原菌变异研究[D]. 王玉萍. 西北农林科技大学. 2007
[9]. 玉米大斑菌Ht－毒素组分分析[J]. 董金皋, 李正平, 李秉华, 王瑞瑶. 植物病理学报. 1996
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