（1.沈阳中心血站；2.辽宁中医药大学 基础医学院；3.荆州市中心医院）
摘要：目的 研究松果菊苷（echinacoside，ECH）对顺铂诱导的卵巢早衰的保护作用，并探讨其保护机制。方法 昆明雌性小鼠40只，随机分成5组，顺铂组及顺铂+不同浓度ECH组给予腹腔注射顺铂，共7天；在顺铂干预同时，低、中、高浓度ECH组给予ECH灌胃处理，并在顺铂干预结束后再持续给药7天，共14天；对照组给予同等剂量的生理盐水腹腔注射及去离子水灌胃处理。分别利用HE染色观察卵巢形态结构、TUNEL染色及Western blot方法检测卵巢组织凋亡发生情况。结果 顺铂组小鼠卵巢外观体积减小，组织学检测可见卵泡数量减少，卵泡中颗粒细胞层减少且颗粒细胞发生凋亡；不同浓度ECH干预组卵巢外观接近正常组，卵巢组织中各级卵泡数量增加，卵泡中颗粒细胞层数量增加且颗粒细胞凋亡发生减少。结论 ECH具有对抗顺铂所致卵巢组织凋亡，保护化疗药物引起的卵巢早衰的作用。
关键词：卵巢早衰；顺铂；松果菊苷；凋亡
卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指妇女40岁之前卵巢功能衰退、闭经，伴雌二醇（Estradiol 2，E2）浓度降低、促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）浓度升高的一种妇科内分泌性疾病[1]。近年来，POF在育龄妇女中的发生率有逐年升高且向低龄化发展的趋势。卵巢早衰的病因学及高危因素复杂，主要包括遗传因素、免疫学因素、促性腺激素作用障碍、酶缺陷异常及医源性因素等[2，3]。卵巢及其周围组织受到大剂量或长时期放射线照射或接受化疗药物治疗等均可破坏卵巢，引起POF[4]。
中医古代并无卵巢早衰的病名，其相似证治散见于“闭经”、“血枯”、“血隔”、“月经过少”、“经水早断”等。分析其病因病机，可认为POF多以肾虚为本，又多夹杂郁、瘀之证。整理归纳治疗卵巢早衰的方药，多为补虛之药，如当归、熟地、莬丝子、仙灵脾、甘草、肉苁蓉等[5]。
肉苁蓉主要分布于我国内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、新疆等地，生长于湖边、沙地之中，味甘、酸、咸、性温，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效。《神农本草经》中所载：肉苁蓉主五劳七伤、补中、益精气、妇人症瘕；唐甄权在《药性论》中记有：肉苁蓉具有益髓、悦颜色、延年、治女人血崩、壮阳之功效；《本草纲目》亦记载：肉苁蓉可养五脏、强阴、益精气、多子。松果菊苷（echinacoside，ECH）是肉苁蓉的主要活性成分之一，主要具有抗氧化、抗炎、神经保护、改善学习记忆、抗肿瘤以及免疫调节等作用[6]。此外，ECH还表现出植物雌激素活性[7]。但ECH是否具有保护卵巢、干预POF的作用，目前尚不清楚。
本实验利用顺铂干预构建的小鼠POF模型，观察ECH是否具有保护卵巢组织的作用，并探讨其保护机制。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
松果菊苷（南京光润生物制品有限公司）、顺铂冻干粉DDP（齐鲁制药有限公司）、Cleaved-caspase 3兔多克隆抗体、Cleaved-PARP兔多克隆抗体及β-actin鼠单克隆抗体（SAB）、HRP-标记羊抗兔IgG及HRP-标记羊抗鼠IgG（金斯瑞生物科技）、TUNEL试剂盒（Roche）、免疫组化SP法试剂盒、内源性生物素阻断剂试剂盒及DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）、RIPA buffer及BCA蛋白定量试剂盒（鼎国生物）。
1.2 动物药物干预实验
雌性昆明小鼠，40只，体重（20±2）g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。小鼠随机分成5组（8只/组），对照组、顺铂组、顺铂+低浓度ECH组、顺铂+中浓度ECH组及顺铂+高浓度ECH组。顺铂组、顺铂+低浓度ECH组、顺铂+中浓度ECH组及顺铂+高浓度ECH组小鼠，分别给予腹腔注射顺铂（前3天：3.0 mg/kg?d；后4天：2.0 mg/kg?d）[8]，共7天；同时灌胃给予等体积去离子水及不同浓度的ECH溶液（10 mg/kg?d、20 mg/kg?d及40 mg/kg?d），共14天。对照组小鼠给予同等剂量的生理盐水腹腔注射及去离子水灌胃处理。实验结束后，处死小鼠，取卵巢组织，一侧卵巢组织用于制备蛋白样品，另一侧卵巢组织用于制备石蜡切片。
1.3 免疫组织化学染色法观察卵巢组织形态
新鲜卵巢组织分别经过4%中性甲醛固定、梯度酒精脱水、浸蜡、包埋、切片。取卵巢组织切片，分别经过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、蒸馏水漂洗、苏木精染色、1%盐酸酒精分化、自来水浸泡、伊红复染后，常规脱水透明封片。
1.4 TUNEL法检测卵巢组织凋亡发生情况
取卵巢组织切片，分别经过常规脱蜡、水化后，Proteinase K工作液37℃孵育25 min，PBS漂洗后滴加TUNEL反应混合液、37℃孵育1 h，PBS漂洗后再经过常规脱水、透明、封片，显微镜下观察凋亡细胞。
1.5 Western blot方法检测凋亡相关蛋白的表达情况
称取一定量卵巢组织，剪碎、研磨后，于RIPA buffer溶液中裂解；离心取上清，BCA蛋白定量；制备SDS-PAGE凝胶，在泳道上加入等量的蛋白样品电泳（20 μg/孔），转膜后分别经过一抗杂交（4℃过夜）、封闭、二抗杂交（室温1 h），ECL、凝胶图象分析。
2 结果
2.1 ECH具有保护顺铂损伤小鼠卵巢组织的作用 从大体上观察，正常组卵巢表面饱满、平滑；顺铂组卵巢较正常组小，表面有凹陷且不光滑；顺铂+不同浓度ECH干预组卵巢外观逐渐接近正常组小鼠卵巢。HE染色后的卵巢组织切片，正常组可见各级卵泡（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡），卵泡数量多且完整，颗粒细胞层致密；与之相比，顺铂组虽可见各级卵泡，但数量少、结构不完整，闭锁卵泡增加，且卵泡内颗粒细胞层明显减少；与顺铂组相比，不同浓度ECH干预组卵泡数量及卵泡内颗粒细胞层逐渐增多，与正常组相近（图1）。
图1 HE染色观察卵巢组织
A 正常组，B顺铂组，C 顺铂+低浓度ECH干预组，D 顺铂+中浓度ECH干预组，E 顺铂+高浓度ECH干预组
2.2 ECH具有抑制顺铂引起的小鼠卵巢组织凋亡的作用 与正常组小鼠相比，顺铂组小鼠卵巢组织颗粒细胞层中表现为棕黄色核的凋亡细胞分布较多；不同浓度的ECH干预可抑制顺铂引起的卵巢颗粒细胞凋亡，其中高浓度干预组表现尤为明显（图2）。Western blot方法检测凋亡相关蛋白，亦可观察到顺铂组活化的caspase 3（即cleaved-caspase 3）增多；同时cleaved-caspase 3降解底物PARP，生成的cleaved-PARP亦增多，标志凋亡细胞增多（图3）。而不同浓度的ECH干预组cleaved-caspase 3及cleaved-PARP表达降低，标志细胞凋亡减少。
图3 Western blot方法检测凋亡相关蛋白
3 讨论
近年来的研究发现，肿瘤的化疗药物可对女性生殖系统造成损害，如出现月经紊乱、闭经、不孕，甚至卵巢功能早衰。化疗药物对卵巢的作用主要表现在对原始卵泡的干预，如干预卵母细胞和前颗粒细胞，干扰卵泡的成熟、耗尽原始卵泡等。化疗药物引起的卵巢组织病理学改变主要表现为：各级卵泡数量减少，由以初级卵泡和次级卵泡的减少最明显，甚至出现无卵泡；同时，卵巢间质出现不同程度纤维化和坏死等改变。化疗对卵巢功能的影响与卵巢的破坏程度成正比，主要体现为卵泡数量减少和黄体功能丧失[9]。本研究利用顺铂干预小鼠，可观察到卵巢体积减小、卵巢面不光滑，镜下可见卵泡数量减少、结构不完整、闭锁卵泡增加、卵泡内颗粒细胞减少且发生凋亡，组织学改变同以往类似研究[10]。
中医对于“闭经”、“血枯”、“血隔”、“不孕症”等病证的分析认为，虚、郁、瘀是卵巢早衰病因病机的关键所在。肾虚为主要病机，《素问?上古天真论》云：“女子七岁，肾气盛，齿更发长……；二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”。肾为先天之本，元气之根，主藏精和生殖。肾中精气为化血之源，直接为胞宫的行经、胎孕提供物质基础。肝郁是促进因素，肝主疏泄和藏血，肝郁则气机失调，气滞血瘀，经水不调，郁而化火，直伤气血，血海空虚，胞宫失养。瘀血是主要诱因，《临症指南医案》中提及“大凡经主气，络主血，久病血瘀”；《血证论》云“一切不治之症，总由不善去瘀之故，......久病则瘀，瘀滞丛生，瘀滞丛生则怪病，难病乃成”。卵巢早衰患者，除了有经血减少、闭经等症状，还伴有潮热汗出、骨质疏松等症状。
中药肉苁蓉具有补肾阳、益精气，治疗妇人症瘕、女人血崩之证。现代药理学研究表明肉苁蓉具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、促进骨再生、抑制妇女绝经后期骨质疏松及植物雌激素作用[11]。近年，越来越多的研究表明肉苁蓉的活性成分——ECH具有植物雌激素活性，可与雌激素受体ERα、ERβ结合，上调雌激素应答元件，进而发挥雌激素效应[12]。植物雌激素还能调节骨代谢、维持骨吸收与骨形成的平衡，肉苁蓉可抑制绝经期/后妇女骨质疏松，可能与ECH的雌激素样作用相关。本研究中，ECH具有改善顺铂诱导的小鼠卵巢体积减小，改善卵巢组织结构，增加卵泡及卵泡内颗粒细胞数量，并防止了顺铂诱导的颗粒细胞凋亡，这些结果可能与ECH的植物雌激素样作用相关，即ECH通过与雌激素受体结合，抑制了化疗药物所诱导的卵巢颗粒细胞凋亡，从而改善卵巢组织结构，抑制卵巢早衰。
本研究发现ECH具有改善顺铂引起的卵巢早衰的作用，为进一步开拓中药肉苁蓉的临床应用及活性成分开发提供实验依据。
参考文献
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[11]王琳琳，李薇，宋新波，等. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的植物雌激素活性研究. 天然产物研究与开发，2014，26：377-380.
[12]王琳琳，李薇，宋新波，等. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的植物雌激素活性研究. 天然产物研究与开发，2014，26：377-380.
*获辽宁省自然科学基金项目（项目号：2015020379）及辽宁省大学生创新创业项目支持（项目号：201610162037）
**王淳，通信作者，辽宁中医药大学 沈阳市皇姑区崇山东路79号 基础医学院 110847
论文作者:林,妍1，2,王,梅2,潘鹏宇2,邓锦芳3,王
论文发表刊物:《航空军医》2018年3期
论文发表时间:2018/4/15
标签：卵巢论文; 卵泡论文; 小鼠论文; 肉苁蓉论文; 雌激素论文; 组织论文; 细胞论文; 《航空军医》2018年3期论文;